CN109468407A - 八月瓜的ssr分子标记及其应用和制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及八月瓜的SSR分子标记及其应用和制备方法。SSR分子标记的引物包括序列如SEQ ID NO：1‑98引物中的一对或多对。本发明开发的八月瓜转录组SSR标记可用于分析八月瓜种质资源的遗传多样性，为八月瓜分子生物学和遗传学研究奠定了良好的理论基础。采用本发明转录组高通量技术开发的SSR标记，速度快，成本低，效率高。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及八月瓜的SSR分子标记及其应用和制备方法。
背景技术
八月瓜，学名三叶木通[Akebia trifoliate(Thunb.)]，又被称为木通果、牛腰子果、八月炸等，主要分布于我国南部、长江流域和西南山区，是一种原生态无污染的天然绿色水果。八月瓜中含有丰富的多酚、黄酮、齐墩果酸、熊果酸、氨基酸、维生素、矿物质等成分。而且果实中有效成分对多种肿瘤细胞的恶性增殖有抑制作用。其种子含油量高达40％以上，是一种品质非常好的天然高档植物食用油。因此，八月瓜是一种具有强身健体、延年益寿、养颜美容等神奇功效的亟待开发的果中珍品。但由于对八月瓜的需求长期依赖于野生资源，供不应求的问题日渐突出，同时掠夺式的过度采收和生境破坏减弱了其再生能力，造成野生八月瓜种质资源的急剧下降和枯竭。现已被国家科学技术部列为濒危、紧缺中药材，其种质资源保护和恢复性培育迫在眉睫。利用分子标记的手段对八月瓜遗传背景及亲缘关系进行研究，对八月瓜种质资源的保护与有效利用具有重要的科学意义。
简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)标记作为一种常用的分子标记，一般以1-6个碱基为核心序列。SSR标记属于共显性标记，具有重复性好、易操作、共显性遗传、数量丰富和多态性高以及遍布整个基因组等优点，且与其他标记相比常表现出较高的多态性。已在植物遗传育种、基因组作图、基因定位、基因文库构建等方面广泛运用。但是传统的SSR标记开发常以基因文库构建法(包括SSR富集文库)为主，其实验过程繁杂、费时费力、效率较低，使SSR标记开发受到很大限制，通常只能利用近缘物种的相关信息进行分析筛选。由于SSR标记的开发需要建立基因组文库以及进行克隆测序和引物设计等，因而目前八月瓜SSR位点的批量开发还未见报道。
由于目前对八月瓜的研究主要集中在形态学、果实营养成分及药用成分的研究上，其分子生物学研究基础较为薄弱。截止到目前，美国国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information，NCBI)数据库中仅公布了144条八月瓜DNA/RNA序列，远远无法进行SSR标记开发。随着基于高通量、高效准确、快速和低成本特点的新一代测序技术和生物信息学的发展，使得高通量标记开发成为可能。目前，八月瓜SSR标记开发及利用转录组技术开发SSR标记尚未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了八月瓜的SSR分子标记及其应用和制备方法。本发明开发的八月瓜转录组SSR标记可用于分析八月瓜种质资源的遗传多样性，为八月瓜分子生物学和遗传学研究奠定良好的理论基础。采用本发明转录组高通量技术开发的SSR标记，速度快，成本低，效率高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了八月瓜的SSR分子标记，SSR分子标记的引物包括如下引物中的一对或多对：
第1对引物，其序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；
第2对引物，其序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；
第3对引物，其序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；
第4对引物，其序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示；
第5对引物，其序列如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示；
第6对引物，其序列如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示；
第7对引物，其序列如SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示；
第8对引物，其序列如SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示；
第9对引物，其序列如SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示；
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第12对引物，其序列如SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示；
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第14对引物，其序列如SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28所示；
第15对引物，其序列如SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30所示；
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第18对引物，其序列如SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36所示；
第19对引物，其序列如SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38所示；
第20对引物，其序列如SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40所示；
第21对引物，其序列如SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42所示；
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第43对引物，其序列如SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：86所示；
第44对引物，其序列如SEQ ID NO：87和SEQ ID NO：88所示；
第45对引物，其序列如SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：90所示；
第46对引物，其序列如SEQ ID NO：91和SEQ ID NO：92所示；
第47对引物，其序列如SEQ ID NO：93和SEQ ID NO：94所示；
第48对引物，其序列如SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：96所示；
第49对引物，其序列如SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：98所示。
具体序列如下：
本发明还提供了该SSR分子标记在八月瓜遗传多样性分析中的应用。
本发明还提供了该SSR分子标记的开发方法，包括如下步骤：
步骤1：提取八月瓜的RNA；
步骤2：将所得RNA打断成短片段，以片段化RNA为模板，合成第一条cDNA链；
步骤3：合成第二条cDNA链，获得cDNA文库；
步骤4：获得测序文库；
步骤5：对测序文库进行高通量测序，对测序文库的数据进行过滤与组装，得到Unigene；
步骤6：将得到Unigene采用MISA软件搜索SSR序列；
步骤7：对搜索到的SSR序列进行引物设计，经引物多态性检测，得到八月瓜的SSR分子标记。
作为优选，步骤2中，用六碱基随机引物合成第一条cDNA链。
在本发明中，步骤3中，在第一链反应产物中，加入缓冲液、dNTPs、DNA polymerase等合成第二条cDNA链。
作为优选，步骤3中，获得cDNA文库的方法为：
经磁珠纯化并加EB缓冲液洗脱之后进行粘性末端修复，连接测序接头，再经琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段，最后降解含U链，并进行PCR扩增，获得cDNA文库。
作为优选，步骤4中，获得测序文库的方法为：使用Qubit3.0进行初步定量，并用磁珠进行片段大小选择，最后进行PCR扩增得到测序文库。
作为优选，步骤5具体为：
使用构建好的测序文库在IlluminaNovaSeq 6000测序平台上运行簇生成及双端测序程序，得到150bp的双端测序reads；
对测序的原始数据进行过滤，过滤标准包括去除带接头adapter的reads、reads中N碱基占比超过10％的序列、去除质量值≤15的碱基数占整个read的50％以上的reads，得到Clean Reads；
使用短序列组装软件Trinity对得到的Clean Reads进行转录组从头组装，并使用TGICL软件做进一步的序列拼接和去冗余处理，得到Unigene。
作为优选，步骤6搜索SSR序列的标准为：单核苷酸的重复次数≥15，二核苷酸的重复次数≥8，三核苷酸的重复次数≥5，四核苷酸的重复次数≥5，五核苷酸的重复次数≥5，六核苷酸的重复次数≥5。
作为优选，步骤7中引物设计的参数为：扩增产物长度为100～300bp，引物长度为18～25bp。
作为优选，步骤7中引物设计的参数为：扩增产物长度为100～300bp，引物长度为18～23bp，平均长度21bp，GC含量40％～60％，平均含量50％，退火温度52～60℃，平均温度55℃。
作为优选，步骤1中RNA总量≥20ng，质量浓度≥400ng/μL，OD260/280范围在1.8～2.2之间，RIN值≥8、28S/18S≥1.0。
本发明提供了八月瓜的SSR分子标记及其应用和制备方法。SSR分子标记的引物包括序列如SEQ ID NO：1-98引物中的一对或多对。本发明具有的技术效果为：
本发明开发的八月瓜转录组SSR标记可用于分析八月瓜种质资源的遗传多样性，为八月瓜分子生物学和遗传学研究奠定了良好的理论基础。
现有技术采用磁珠富集法进行SSR标记筛选，过程繁琐，成本高；采用本发明转录组高通量技术开发的SSR标记，速度快，成本低，效率高。本发明1个月完成了7,316对SSRs引物的开发，而且成本仅有1,300元，平均开发一个标记的成本仅0.18元。
附图说明
图1为使用本发明设计的引物P009(a和b)和P023(c和d)得到的88份资源的SSR多态性图谱，a和c最左边均为Marker。
具体实施方式
本发明公开了八月瓜的SSR分子标记及其应用和制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的八月瓜SSR分子标记的开发方法包括如下步骤：
(1)确定样本RNA的浓度、纯度，测序深度等以确保分子标记开发的密度、效率等，从而确保达到预期的实验目的。
采用Trizol法提取八月瓜A68样本的总RNA，1.2％琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度和完整性，NanoDrop-2000C超微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific，USA)检测其浓度。分析所得RNA是否达到RNA-Seq的试验标准(总量≥20ng、质量浓度≥400ng/μL、OD260/280范围在1.8-2.2之间、RNA integrity number值≥8、28S/18S≥1.0)。
(2)cDNA文库的构建与测序
利用Oligo(dT)吸附纯化mRNA，将mRNA打断成短片段，以片段化mRNA为模板，用六碱基随机引物合成第一链cDNA，然后加入缓冲液、dNTPs、DNA polymerase等合成第二链cDNA。经磁珠纯化并加EB缓冲液洗脱之后进行粘性末端修复等步骤，获得cDNA文库。3'末端加上A尾巴，连接测序接头，再经琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段，最后降解含U链，并进行PCR扩增，获得cDNA文库。文库构建完成后，使用Qubit3.0进行初步定量，并用磁珠进行片段大小选择，最后进行PCR扩增得到测序文库。使用构建好的文库在IlluminaNovaSeq 6000测序平台上运行簇生成及双端测序程序(PE)，得到150bp的双端测序reads。
(3)De novo组装
在进行组装之前，首先对测序的原始数据进行过滤，过滤标准包括去除带接头(adapter)的reads、reads中N碱基占比超过10％的序列、去除质量值≤15的碱基数占整个read的50％以上的reads，得到Clean Reads。使用短序列组装软件Trinity对得到的CleanReads进行转录组从头组装，并使用TGICL软件做进一步的序列拼接和去冗余处理，得到Unigene。最后使用BLAST软件将Unigene与Swiss-Prot、GO、Pfam、eggNOG、KEGG数据库进行序列比对，获得Unigene的注释信息。
(4)SSR搜索
对得到的Unigene序列，利用MISA软件结合人工搜索寻找SSR。参数设置为：单核苷酸的重复次数≥15，二核苷酸的重复次数≥8，三核苷酸的重复次数≥5，四核苷酸的重复次数≥5，五核苷酸的重复次数≥5，或者六核苷酸的重复次数≥5。在8,116个Unigene中，搜索到9,494个SSR。
(5)根据含有SSR位点的序列进行设计引物
根据SSR侧翼序列设计引物，且SSR位点侧翼序列长度≥50bp。引物设计参数：扩增产物长度在100-300bp，引物长18-23bp，平均长度21bp，GC含量40％-60％，平均含量50％，退火温度52-60℃，平均温度55℃。
采用上述方法设计并经过多态性检测得到49对SSR引物序列。
六碱基随机引物(随机六聚体引物)：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。随机引物一般有6-10个碱基的寡核苷酸引物。引物的序列是随机的。
本发明提供的八月瓜的SSR分子标记及其应用和制备方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
(1)确定样本RNA的浓度、纯度，测序深度等以确保分子标记开发的密度、效率等，从而确保达到预期的实验目的。
采用Trizol法提取八月瓜A68样本的总RNA，1.2％琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度和完整性，NanoDrop-2000C超微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific，USA)检测其浓度。分析所得RNA是否达到RNA-Seq的试验标准(总量≥20ng、质量浓度≥400ng/μL、OD260/280范围在1.8-2.2之间、RNAintegrity number值≥8、28S/18S≥1.0)。
(2)cDNA文库的构建与测序
利用Oligo(dT)吸附纯化mRNA，将mRNA打断成短片段，以片段化mRNA为模板，用六碱基随机引物合成第一链cDNA，然后加入缓冲液、dNTPs、DNApolymerase等合成第二链cDNA。经磁珠纯化并加EB缓冲液洗脱之后进行粘性末端修复等步骤，获得cDNA文库。3'末端加上A尾巴，连接测序接头，再经琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段，最后降解含U链，并进行PCR扩增，获得cDNA文库。文库构建完成后，使用Qubit3.0进行初步定量，并用磁珠进行片段大小选择，最后进行PCR扩增得到测序文库。使用构建好的文库在IlluminaNovaSeq 6000测序平台上运行簇生成及双端测序程序(PE)，得到150bp的双端测序reads。
(3)De novo组装
在进行组装之前，首先对测序的原始数据进行过滤，过滤标准包括去除带接头(adapter)的reads、reads中N碱基占比超过10％的序列、去除质量值≤15的碱基数占整个read的50％以上的reads，得到Clean Reads。使用短序列组装软件Trinity对得到的CleanReads进行转录组从头组装，并使用TGICL软件做进一步的序列拼接和去冗余处理，得到Unigene。最后使用BLAST软件将Unigene与Swiss-Prot、GO、Pfam、eggNOG、KEGG数据库进行序列比对，获得Unigene的注释信息。
表1 八月瓜转录组测序信息表
(4)SSR搜索
对得到的Unigene序列，利用MISA软件结合人工搜索寻找SSR。参数设置为：单核苷酸的重复次数≥15，二核苷酸的重复次数≥8，三核苷酸的重复次数≥5，四核苷酸的重复次数≥5，五核苷酸的重复次数≥5，或者六核苷酸的重复次数≥5。在8,116个Unigene中，搜索到9,494个SSR。
(5)根据含有SSR位点的序列进行设计引物
根据SSR侧翼序列设计引物，且SSR位点侧翼序列长度≥50bp。引物设计参数：扩增产物长度在100-300bp，引物长18-23bp，平均长度21bp，GC含量40％-60％，平均含量50％，退火温度52-60℃，平均温度55℃。
采用上述方法设计并经过多态性检测的49对SSR引物序列如下：
表2 49对SSR引物序列
实施例2八月瓜种质资源遗传多样性分析
1材料与方法
1.1材料
88份来自不同地区的八月瓜种质资源，资源名见表3。
表3 八月瓜种质资源名称
1.2方法
1.2.1基因组DNA的提取
采集88份八月瓜种质资源嫩叶，利用天根DNA试剂盒提取DNA。提取后的DNA通过电泳检测浓度后，计算样品DNA浓度，并稀释到所需浓度。
1.2.2利用所设计的SSR引物进行PCR
PCR反应体系：20μL反应体系组成见表4：
表4 PCR反应体系
| 体系组成 | 终浓度 |
| 镁离子(Mg<sup>2+</sup>) | 2.0mmol/L |
| Taq缓冲液(Taq Buffer) | 1× |
| dNTP混合物(dNTP Mix) | 200μmol/L each |
| Taq DNA聚合酶(Taq DNA Enzyme) | 1U |
| 引物(Primers) | 0.25μmol/L each |
| 脱氧核糖核酸(DNA) | 30ng |
PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，52-56℃复性40s，72℃延伸1min，31次循环后72℃延伸10min。PCR扩增在Bio-Rad T100TMThermal Cycler上进行(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA,USA)。
1.2.3PCR扩增产物检测
扩增产物进行8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，进行银染。记录带型。以获得的49对多态性引物为例，对所示材料分别进行PCR扩增，进行多态性检测，实验设3次重复，均得到相同的结果，而且得到清晰的88份材料的SSR多态性图谱。通过聚类分析，所用资源被分成4个群体，表明资源之间的亲缘关系与来源地以及海拔、高度等因素关系密切。说明本发明开发的标记可以用于分析八月瓜遗传多样性分析。
图1为使用本发明设计的引物P009(a和b)和P023(c和d)[得到的88份资源的SSR多态性图谱，a和c最左边均为Marker；
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院麻类研究所
<120> 八月瓜的SSR分子标记及其应用和制备方法
<130> MP1829632
<160> 98
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
aacgcctcca aagggatgag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
gaggagatga ggtgaagccg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
gcgctcttct cttctgtggt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
ggtagttcgg tgccagttga 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
caaccaattg ctgcccatgg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
gcgctctatc ttggctggat 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
agaagggagg acgtatgcct 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
tgggagggaa atcgtgtgtt 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
atgggttgtg aagcgccata 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
acaccagcct gttctagtgc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
agtgcctaac caacccatgt 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
gcgcagagct tcgattcttg 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
accattgaaa ccagttgacc a 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
atgtgggttg ggcttggtag 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
aatggatggc gtttctcagt 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
ctgtttccac caccccatga 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 17
agctgggcta agttggcaaa 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 18
gtgtcatcgc tctcgctgta 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 19
ggctgagccc tcatacactt 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 20
gctttgggca taaacgacga 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 21
gaggccagct ttacagagca 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 22
gtcaagagag aggtggtgca 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 23
ccagcgcggt aaagaaactg 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 24
gctcaccacc atcattccca 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 25
gcccaagtgt ccaattgtcc 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 26
cgtacccaac cacgtaccaa 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 27
gaggtggaga tggaggagga 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 28
aaccctagtt ctctctgcgt 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 29
gagagcagaa actggagcca 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 30
gccacagagc catacttcga 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 31
agcaaccgaa gattctgcca 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 32
cttcagacgc tcacactcgt 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 33
tgtgcgaagg aggaagtgtc 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 34
ctgcccaagt actaaccggt 20
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 35
tggagatgtt gaaatcccac a 21
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 36
gctccgaact gactagatcc a 21
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 37
gccaacacct catcccttca 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 38
gggggactat tttgggtggg 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 39
aaacacaagg ctgccacaac 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 40
aggtggtgct ttccatgctc 20
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 41
aaatacactg tcgacttccg a 21
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 42
tccctctctg cttcgagtga 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 43
accagcaaag gaaatccaca 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 44
agcgttccag gttggttgat 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 45
tggggatgat ctgggaggaa 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 46
ctttcccctc ttgacgctcc 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 47
cttcaattcg cctccgcaac 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 48
aagcagagga cggattgctc 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 49
tacaagtggg cggagatgac 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 50
acacatgcta aaaggccggt 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 51
gatgtgagcc aaccaacacg 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 52
gcacggaagg gtacatggaa 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 53
ggactcgttg gaacagacgt 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 54
tctcaacacc ttcctcccca 20
<210> 55
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 55
caccaatcac aggcgttgc 19
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 56
aacccgggta catgtttgca 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 57
ctctctcgtc tttgctgcca 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 58
cggtttggtc gtaaatcgca 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 59
aggtgtagac gaggtcctcc 20
<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 60
tcgccatcca aatctaccat t 21
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 61
ggctctgaac aaggagacga 20
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 62
cccaatgctt gtgagttcgc 20
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 63
gcccggatac ccttcgttat 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 64
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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gagatccaca agcgagcgaa 20
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 66
agccgcgtta ttcaatccct 20
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 67
gcatgtaaca ccccatccca 20
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 68
acgtgccatt ccaaggagaa 20
<210> 69
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 69
aggagtaagc aaactcagca gt 22
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 70
tcacgcccct ttacgatctc 20
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 71
ttcagaccag gagggaccat 20
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 72
ggcctcggaa atcaccctta 20
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 73
agctttgatg gggatgggtg 20
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 74
ctctcaggtt agcccgcatt 20
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 75
ggcgacttac ctgatccgag 20
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 76
gcgatcatct ttcggcaacc 20
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 77
cagcaacacc aagaagccac 20
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 78
atctaagggc ggaccagagt 20
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 79
gcgaccatga aaccctagct 20
<210> 80
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 80
ccctcacatc tcaactagcg g 21
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 81
acaggtacat caacgcggtt 20
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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gcaaacccaa tccccatcct 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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cggagatcca ctcgttcgag 20
<210> 84
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 84
tcgccagtca tcgatttcgt 20
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 85
gggaaaaatc gtaacgccgt 20
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 86
tcgaacgcca tcgattctct 20
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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ggtttggtgc ctgatgacct 20
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 88
cttcagccca gtcgtgactt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 89
tggttcatct tggagtgcgt 20
<210> 90
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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tctggaagga agggagggag 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 91
tggttcatct tggagtgcgt 20
<210> 92
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 92
agacttctca ggcacacgtg 20
<210> 93
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 93
cacgtgtgcc tgagaagtct 20
<210> 94
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 94
cacagccgat ccttccaact 20
<210> 95
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 95
gcggtacatt ccccggtaaa 20
<210> 96
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 96
actcgtaatc ctgttggccg 20
<210> 97
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 97
gttcgcgtgg gaagaacaac 20
<210> 98
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 98
accttctgat gcgcttcgaa 20
Claims (10)
1.八月瓜的SSR分子标记，其特征在于，所述SSR分子标记的引物包括如下引物中的一对或多对：
第1对引物，其序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；
第2对引物，其序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；
第3对引物，其序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；
第4对引物，其序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示；
第5对引物，其序列如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示；
第6对引物，其序列如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示；
第7对引物，其序列如SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示；
第8对引物，其序列如SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示；
第9对引物，其序列如SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示；
第10对引物，其序列如SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示；
第11对引物，其序列如SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22所示；
第12对引物，其序列如SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示；
第13对引物，其序列如SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26所示；
第14对引物，其序列如SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28所示；
第15对引物，其序列如SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30所示；
第16对引物，其序列如SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32所示；
第17对引物，其序列如SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34所示；
第18对引物，其序列如SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36所示；
第19对引物，其序列如SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38所示；
第20对引物，其序列如SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40所示；
第21对引物，其序列如SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42所示；
第22对引物，其序列如SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44所示；
第23对引物，其序列如SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46所示；
第24对引物，其序列如SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48所示；
第25对引物，其序列如SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50所示；
第26对引物，其序列如SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52所示；
第27对引物，其序列如SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54所示；
第28对引物，其序列如SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56所示；
第29对引物，其序列如SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：58所示；
第30对引物，其序列如SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：60所示；
第31对引物，其序列如SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：62所示；
第32对引物，其序列如SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64所示；
第33对引物，其序列如SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：66所示；
第34对引物，其序列如SEQ ID NO：67和SEQ ID NO：68所示；
第35对引物，其序列如SEQ ID NO：69和SEQ ID NO：70所示；
第36对引物，其序列如SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：72所示；
第37对引物，其序列如SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：74所示；
第38对引物，其序列如SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：76所示；
第39对引物，其序列如SEQ ID NO：77和SEQ ID NO：78所示；
第40对引物，其序列如SEQ ID NO：79和SEQ ID NO：80所示；
第41对引物，其序列如SEQ ID NO：81和SEQ ID NO：82所示；
第42对引物，其序列如SEQ ID NO：83和SEQ ID NO：84所示；
第43对引物，其序列如SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：86所示；
第44对引物，其序列如SEQ ID NO：87和SEQ ID NO：88所示；
第45对引物，其序列如SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：90所示；
第46对引物，其序列如SEQ ID NO：91和SEQ ID NO：92所示；
第47对引物，其序列如SEQ ID NO：93和SEQ ID NO：94所示；
第48对引物，其序列如SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：96所示；
第49对引物，其序列如SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：98所示。
2.如权利要求1所述SSR分子标记在八月瓜遗传多样性分析中的应用。
3.如权利要求1所述SSR分子标记的开发方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：提取八月瓜的RNA；
步骤2：将所得RNA打断成短片段，以片段化RNA为模板，合成第一条cDNA链；
步骤3：合成第二条cDNA链，获得cDNA文库；
步骤4：获得测序文库；
步骤5：对测序文库进行高通量测序，对测序文库的数据进行过滤与组装，得到Unigene；
步骤6：将得到Unigene采用MISA软件搜索SSR序列；
步骤7：对搜索到的SSR序列进行引物设计，经引物多态性检测，得到八月瓜的SSR分子标记。
4.根据权利要求3所述的开发方法，其特征在于，步骤2中，用六碱基随机引物合成第一条cDNA链。
5.根据权利要求3所述的开发方法，其特征在于，步骤3中，获得cDNA文库的方法为：
经磁珠纯化并加EB缓冲液洗脱之后进行粘性末端修复，连接测序接头，再经琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段，最后降解含U链，并进行PCR扩增，获得cDNA文库。
6.根据权利要求3所述的开发方法，其特征在于，步骤4中，获得测序文库的方法为：使用Qubit3.0进行初步定量，并用磁珠进行片段大小选择，最后进行PCR扩增得到测序文库。
7.根据权利要求3所述的开发方法，其特征在于，步骤5具体为：
使用构建好的测序文库在IlluminaNovaSeq 6000测序平台上运行簇生成及双端测序程序，得到150bp的双端测序reads；
对测序的原始数据进行过滤，过滤标准包括去除带接头adapter的reads、reads中N碱基占比超过10％的序列、去除质量值≤15的碱基数占整个read的50％以上的reads，得到Clean Reads；
使用短序列组装软件Trinity对得到的Clean Reads进行转录组从头组装，并使用TGICL软件做进一步的序列拼接和去冗余处理，得到Unigene。
8.根据权利要求3所述的开发方法，其特征在于，步骤6搜索SSR序列的标准为：单核苷酸的重复次数≥15，二核苷酸的重复次数≥8，三核苷酸的重复次数≥5，四核苷酸的重复次数≥5，五核苷酸的重复次数≥5，六核苷酸的重复次数≥5。
9.根据权利要求3所述的开发方法，其特征在于，步骤7中所述引物设计的参数为：扩增产物长度为100～300bp，引物长度为18～25bp。
10.根据权利要求3至9中任一项所述的开发方法，其特征在于，步骤1中RNA总量≥20ng，质量浓度≥400ng/μL，OD260/280范围在1.8～2.2之间，RIN值≥8、28S/18S≥1.0。
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|---|---|---|---|---|
| CN111363844A (zh) * | 2020-04-15 | 2020-07-03 | 广西壮族自治区农业科学院 | 一种荸荠ssr引物组及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105238781A (zh) * | 2015-11-06 | 2016-01-13 | 福建省农业科学院果树研究所 | 基于转录组序列开发的李ssr标记引物对及其应用 |
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| CN111363844B (zh) * | 2020-04-15 | 2023-05-26 | 广西壮族自治区农业科学院 | 一种荸荠ssr引物组及其应用 |
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