CN103589715B - 猪amy2基因的一个可用于溯源的snp分子标记及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪AMY2基因的一个可用于溯源的SNP分子标记及其检测方法。所述的SNP分子标记是通过DNA池测序获得，共1060bp，其包含部分第五外显子，部分第七外显子和完整的第五内含子，第六外显子和第六内含子序列，且第104位碱基处有一个碱基突变104C→104T，其DNA序列如SEQ？ID？NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.2所示。该SNP分子标记在商品猪培育中，可以广泛用于猪肉产品DNA溯源及其检测，特别是用于猪肉产品的安全性溯源。
Description
技术领域
本发明属食品安全领域，涉及猪AMY2基因的一个可用于溯源的SNP分子标记及其检测方法。
背景技术
猪肉制品作为人膳食中重要的蛋白质来源，如何确保其安全卫生，保障消费者的身体健康和生命安全已成为全球性的热点问题。世界各国政府纷纷采取一系列的技术措施来强化对肉产品的安全管理，以期最大程度上减少食品安全事件的发生。我国各大城市也纷纷建立了肉产品的追溯系统，通过肉制品的溯源管理，能够为消费者提供准确而详细的有关产品的信息，有利于生产经营者及时发现各环节中存在的不安全隐患，为消费者提供一个获取有效可靠信息的途径。更为重要的是，大大加强了政府部门对肉质品质量安全的监管，为国家迅速建立食品安全风险的应对机制提供有效信息，将有助于社会的安定。
但是我国肉产品追溯系统所采用的标签技术存在标签丢失、记录出差、标记图案模糊不清以及标签容易人为改换等缺点；而国外发达国家所采用的DNA溯源技术是基于个体DNA指纹图谱的生物学技术，有着绝对的不可更改性和唯一性，不受人为因素影响。而且因为DNA溯源技术容易分型、重复性好、检测手段简单快捷、成本低廉等成为目前国际上被公认为最具发展潜力和应用价值的快速溯源技术。
DNA溯源技术的产生源于DNA的遗传与变异，用于构建个体DNA指纹图谱的分子标记有AFLP标记(扩增片段长度多态性)、SSR标记(微卫星标记)和SNP标记(单核苷酸多态性)。
AFLP具有的高度可靠性和操作简便性，但是AFLP存在着对模板反应表现迟钝、谱带可能发生错配与缺失、成本相对比较高等缺点。相比SNP标记，微卫星标记的等位基因众多，多态丰富，但也正因如此，使得SSR标记的带型复杂，给DNA指纹识别自动化和规模化带来困难。SNP标记是第三代分子遗传标记，是指基因组同一位点上单个核苷酸的变异，一般表现为二等位基因，非常适宜高通量自动化分析，所以日益成为动物身份识别最受关注的分子标记。
但是用于肉产品溯源的SNP标记不同于一般的SNP标记，对于单个的SNP标记，它必须至少具有以下特征：(1)变异度高，在品种或品系中等位基因频率接近；(2)品种间等位基因分布频率差异小；(3)杂合度大于等于0.3。
在长期的育种工作中，研究者积累了大量的SNP标记，但是这些SNP标记往往集中分布在某些染色体上，如1号染色体，12号染色体等，而另外部分染色体，如4号，8号，14号，18号染色体等则缺乏SNP标记，因此为了满足对猪肉产品进行DNA溯源的要求,我们进行新SNP标记的研究工作。
猪AMY2(amylase，alpha 2B)基因称为胰腺淀粉酶基因，位于猪的第4号染色体上。AMY2基因在人类，羊和鸡中已有研究，该基因跟代谢途径存在关联。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供猪AMY2基因的一个可用于溯源的SNP分子标记及其检测方法，该SNP分子标记在商品猪培育中，可以广泛用于猪肉产品DNA溯源及其检测，特别是用于猪肉产品的安全性溯源。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
所述的猪AMY2基因的一个可用于溯源的SNP分子标记，共1060bp，包含部分第五外显子，部分第七外显子和完整的第五内含子，第六外显子和第六内含子序列，且第104位碱基处有一个碱基突变104C→104T，其DNA序列具体如SEQ ID NO.1所示。
所述的SNP分子标记编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述的SNP分子标记是通过DNA池(pool)测序获得，并在包括10个猪品种或品系的试验群体(共计235个个体)中，分析该SNP分子标记在试验群体中等位基因的分布情况，发现该分子标记在不同的品种和品系中的等位基因频率接近，多态性丰富，品种或品系间等位基因频率分布差异小，初步判定该SNP标记可用作猪肉产品DNA溯源。
所述的猪AMY2基因的一个可用于溯源的SNP分子标记的检测方法，采用PCR-Eco91I-RFLP方法进行，包括以下步骤：
(1)构建猪的DNA池(pool)；
(2)设计正、反向引物分离AMY2基因的DNA片段，测序并分析；
(3)PCR-Eco91I-RFLP检测方法的建立及突变位点的检测；
(4)采集10个品种和品系的耳组织样，共计235个个体；
(5)检测SNP分子标记在试验群体的分布，统计分析，并进一步试验验证是否适用于猪肉产品溯源。
其中，上述检测方法中，分离AMY2基因的DNA片段的正、反向引物序列如下：
正向引物：5'-GCAAGTGGAGTGGAGAGAAG-3'(序列SEQ ID NO.3)
反向引物：5'-ACTCGTGTGAATCCGTAAGG-3'(序列SEQ ID NO.4)
本发明采用DNA池检测到猪AMY2基因存在的一个SNP分子标记，在包括10个猪品种或品系的试验群体中，分析该SNP分子标记在试验群体中等位基因的分布情况，发现该SNP分子标记在不同的品种或品系中的等位基因频率接近，多态性丰富，品种或品系间等位基因频率分布差异小，并且杂合度都大于0.3，初步判定该SNP分子标记可用作猪肉产品DNA溯源以及猪肉产品的安全性溯源中。
由于单个SNP分子标记是无法完成溯源的，因此在溯源模拟试验中，将本发明获得该AMY2基因的SNP分子标记的位点与其它现有已公开的SNP分子标记位点结合在一起进行溯源实验(共计12个SNP位点)，在屠宰场随机挑选的100个个体中，检测每个个体12个SNP位点的基因型，统计每个个体的基因型结果，发现100个个体均拥有各自不通的基因型，能实现个体区分；同时，随机在这100个个体中挑取20份肌肉样，同样检测统计12个SNP分子标记位点的基因型，然后跟100个个体的基因型进行比对分析，发现均能找到与20份肌肉样品基因型完全一致的个体，即通过溯源在100个个体中找到20份猪肌肉的来源个体，因此判定本发明的该SNP分子标记可以用于猪肉产品溯源。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。
实施例1 分子标记的查找
(1)DNA池(pool)的构建
分别随机采集杜洛克猪、梅山猪个体各2头(不分性别)的耳组织，提取DNA后，等量吸取4个个体的DNA放入同一离心管中，混匀待用。
(2)引物设计
以猪AMY2基因的DNA序列(Genbank：NC_010446)为模板，设计引物分离猪AMY2基因(以一头申农猪的DNA为PCR扩增的模板)，引物如下：
正向引物：5'-GCAAGTGGAGTGGAGAGAAG-3'(SEQ ID NO.3)
反向引物：5'-ACTCGTGTGAATCCGTAAGG-3'(SEQ ID NO.4)
PCR反应总体积为20μl，其中猪AMY2基因组DNA约100ng，含1×buffer(Promega公司)，1.5mmol/L MgCl2，dNTP(上海生工生物公司)终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0.2μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(Promega公司)。
PCR扩增程序为：94℃4min，(94℃30s，62℃退火40s，72℃40s)循环30次，最后72℃延伸10min。
PCR反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。
(3)克隆测序分析
将得到的猪AMY2基因PCR产物按照下述方法进行克隆。
PCR产物的纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5ml Ependorff管中，用PCR产物纯化试剂盒(天根生化科技有限公司)纯化。
连接反应：将纯化的PCR产物与pMD18-T载体(大连宝生物公司)连接，连接反应总体积是10μl，其中包括5μl solution I(大连宝生物公司)，0.5μl的T载体(大连宝生物公司)，2.5μl的纯化PCR产物，最后加入2μl灭菌水置4℃水浴过夜。
转化：无菌状态下取100-120μl感受态细胞(天根生化科技有限公司)于1.5ml Ependorff管中，将5μl的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s，其间不要摇动Ependorff管，取出后冰浴3-4min，加入400μl无抗生素的LB液体培养基，37℃平放1h后倒置培养。
菌落PCR鉴定：经菌落PCR鉴定后的菌株在LB培养基37℃培养过夜，随即挑取多个克隆子送到上海生工生物有限公司测序。
经测试，该经拼接后的猪AMY2基因的DNA序列共1060bp，包含部分第五外显子，部分第七外显子和完整的第五内含子，第六外显子和第六内含子序列，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。且分析发现该DNA序列的第104碱基处存在一个碱基突变(104C→104T)，通过分子生物学软件分析，发现该第104碱基处的碱基突变导致Eco91I-RFLP(Restriction FragmentLength Polymorphism，即Eco91I-RFLP位点)多态性。该DNA序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
(4)PCR-Eco91IRFLP检测方法的建立及突变位点的检测
酶切反应总体积10μl，其中1×buffer 10μl，PCR产物3-5μl，限制性内切酶Eco91I为0.5μl(5U)，用H2O补足10μl，37℃水浴4h，称取0.6g琼脂糖溶于15.75ml DEPC(上海生工生物公司)处理水中，稍冷却(60℃)，加入5ml的5×甲醛凝胶电泳缓冲液和4.25ml的37％甲醛溶液，混匀制胶，电泳后检测酶切结果。结果发现：SEQ ID NO.1序列中T等位基因只有1060bp一个片段，C等位基因有98bp和962bp两个片段，这两个等位基因可组成三种基因型：CC，CT，TT。且该序列的第984位碱基，发生C→T的替代。
实施例2 等位基因的分布情况
(1)试验群体的设计
试验组：采集皮特兰(21头)、申农(17头)、大白(43头)、大申(52头)、长申(16头)、杜申(23头)、皮大申(11头)、长大申(25头)、杜大申(7头)和杜皮大申(20头)个体的耳组织，提取DNA，共计235个DNA样本。
试验群体的目的在于检测SNP标记在不同品种中的分布情况。
(2)基因型检测
正向引物：5'-GCAAGTGGAGTGGAGAGAAG-3'(序列SEQ ID NO.3)
反向引物：5'-ACTCGTGTGAATCCGTAAGG-3'(序列SEQ ID NO.4)
进行扩增(条件如实施例1)，用相同的RFLP方法检测试验群体所有的个体基因型。
(3)统计分析
记录所有个体的基因型，并计算等位基因频率和杂合度，结果如下表所示。
表1
从表1可以看出：本发明的该SNP分子标记在各品种中的等位基因频率接近，多态性丰富；品种或品系间，等位基因频率C和T的分布差异小；所有品种或者品系的杂合度H均大于0.3，因此初步认为该SNP标记可以用于猪肉产品的DNA溯源和安全性溯源中。
实施例3 SNP分子标记可用性溯源试验验证
上述SNP标记已被初步证实可用于溯源性标记中，为了确保在溯源标记中的可用性，本发明又在不同地点重新取样，进行可用性溯源试验验证。
在复兴屠宰场随机采集猪个体的耳组织和肌肉样各100份(每个猪个体均同时采集耳组织样和肌肉样)，耳组织样编号E1-E100，肌肉样编号M1-M100，分别提取肌肉样和耳组织样品的DNA备用。
在100个个体耳组织样中及随机挑选的20个肌肉样品中检测猪AMY2基因的Eco91I SNP位点与如下表2现有已报道的11个SNP位点的基因型，共计12个SNP位点，统计每个个体的基因型结果，按照酶切带型，一条带记为1，出现两条带记为2，三条带记为3，记录顺序按照表二位点顺序排列，如ADAMTS-1基因的PvuⅡ酶识别的SNP位点为1，其基因型记录结果就排在第一位，ADD1基因的Eam1104Ⅰ酶识别的SNP位点为2，其基因型记录结果就排在第二位，依次类推，AMY2基因的Eco91I SNP位点排在最后，其基因型结果就表示为从左往右的第12个数字，个体的基因型可以表示为：212323233112。
表2
统计每个个体和肉样的12个SNP位点的基因型，结果显示100个个体、12份肌肉样均拥有不同的基因型，能实现个体区分。同时，把该20份肌肉样12个SNP位点的基因型结果跟该100个个体的基因型进行比对分析，发现均能找到与20份肌肉样品基因型完全一致的个体，即通过溯源在100个个体中找到20份猪肌肉的来源个体，实现肉样到个体的溯源(结果参看表4)。100个个体、20份肌肉样品的基因型分别如下表3、表4，其中排在数字第12位且用粗体标识的是本发明的AMY2基因的SNP位点的基因型结果。
表3 100个个体的基因型
表4 20份肌肉样的基因型及与比对结果
Claims (3)
1.猪AMY2基因的一个可用于溯源的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记是通过DNA池测序获得，共1060bp，其包含部分第五外显子，部分第七外显子和完整的第五内含子，第六外显子和第六内含子序列，且第104位碱基处有一个碱基突变104C→104T；所述SNP分子标记的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
3.权利要求1所述的猪AMY2基因的SNP分子标记在猪肉产品的DNA溯源中的应用。
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