CN101812510A - Psma1基因中用于猪肉产品溯源的snp分子标记及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种PSMA1基因中用于猪肉产品溯源的SNP分子标记，采用PCR--RFLP方法进行检测，通过DNApool测序获得。在包括11个猪品种或品系的试验群体中，分析该SNP分子标记在试验群体中等位基因的分布情况，发现该分子标记在不同的品种和品系中的等位基因频率接近，多态性丰富，品种或品系间等位基因频率分布差异小，初步判定该SNP标记可用作猪肉产品DNA溯源。

Description

PSMA1基因中用于猪肉产品溯源的SNP分子标记及其检测方法

技术领域

本发明属食品安全领域，具体涉及一种PSMA1基因中一个新的可用于猪肉产品的DNA溯源的SNP分子标记及其检测方法。

背景技术

随着生活水平和保健意识的提高，人们越来越注重食品安全问题。猪肉制品作为人膳食中重要的蛋白质来源，如何确保其安全卫生，保障消费者的身体健康和生命安全已成为全球性的热点问题。世界各国政府纷纷采取一系列的技术措施来强化对肉产品的安全管理，以期最大程度上减少食品安全事件的发生。我国各大城市也纷纷建立了肉产品的追溯系统，通过肉制品的溯源管理，能够为消费者提供准确而详细的有关产品的信息，有利于生产经营者及时发现各环节中存在的不安全隐患，为消费者提供一个获取有效可靠信息的途径。更为重要的是，大大加强了政府部门对肉质品质量安全的监管，为国家迅速建立食品安全风险的应对机制提供有效信息，将有助于社会的安定。

但是我国肉产品追溯系统所采用的标签技术存在标签丢失、记录出差、标记图案模糊不清以及标签容易人为改换等缺点；而国外发达国家所采用的DNA溯源技术是基于个体DNA指纹图谱的生物学技术，有着绝对的不可更改性和唯一性，不受人为因素影响。而且因为DNA溯源技术容易分型、重复性好、检测手段简单快捷、成本低廉等成为目前国际上被公认为最具发展潜力和应用价值的快速溯源技术。

DNA溯源技术的产生源于DNA的遗传与变异，用于构建个体DNA指纹图谱的分子标记有AFLP标记(扩增片段长度多态性)、SSR标记(微卫星标记)和SNP标记(单核苷酸多态性)。

AFLP具有的高度可靠性和操作简便性，但是AFLP存在着对模板反应表现迟钝、谱带可能发生错配与缺失、成本相对比较高等缺点。相比SNP标记，微卫星标记的等位基因众多，多态丰富，但也正因如此，使得SSR标记的带型复杂，给DNA指纹识别自动化和规模化带来困难。SNP标记是第三代分子遗传标记，是指基因组同一位点上单个核苷酸的变异，包括置换、颠换、缺失和插入，但实际上只发生转换和颠换，并且一般表现为二等位基因，非此即彼，非常适宜高通量自动化分析，所以日益成为动物身份识别最受关注的分子标记。

但是用于肉产品溯源的SNP标记不同于一般的SNP标记，对于单个的SNP标记，它必须至少具有以下特征：(1)变异度高，在品种或品系中等位基因频率接近；(2)品种间等位基因分布频率差异小。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种在商品猪培育中，使用广泛的猪种和组合筛选PSMA 1基因中可以用于猪肉产品DNA溯源的SNP分子标记及其检测方法，用于猪肉产品的安全性溯源。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种PSMA1基因中用于猪肉产品溯源的SNP分子标记，是通过DNApool测序获得，并在包括11个猪品种或品系的试验群体(共计243各个体)中，分析该SNP分子标记在试验群体中等位基因的分布情况，发现该分子标记在不同的品种和品系中的等位基因频率接近，多态性丰富，品种或品系间等位基因频率分布差异小，初步判定该SNP标记可用作猪肉产品DNA溯源。

所述SNP分子标记的PSMA 1基因序列共475bp，其中包含部分第六内含子、第八外显子的序列，完整的第七外显子和第七内含子序列。

其中，上述PSMA1基因的DNA序列为SEQ ID NO：1，在其第237位碱基处有一个碱基突变237A-237G。并且，检测该碱基突变237A-237G的正、反向引物的DNA序列为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。

所述PSMA1基因中用于猪肉产品溯源的SNP分子标记采用用PCR--RFLP方法进行检测，具体包括以下步骤：

(1)构建猪的DNApool；

(2)设计引物分离PSMA1基因的DNA片段，测序并分析；

(3)突变位点检测引物的重新设计及检测方法的建立；

(4)采集11个品种和品系的耳组织样，共计243个个体；

(5)检测SNP标记在试验群体的分布，筛选适用于猪肉产品溯源的SNP标记。

本发明采用DNA池测的方法检测到猪PSMA 1基因存在的SNP标记，并通过SNP标记在试验猪群中变异度的筛选，初步认为该SNP分子标记可用于猪肉产品的DNA溯源，该方法可应用于猪肉产品的安全性溯源。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。

实施例1

分子标记的查找

(1)DNApool的构建

分别随机采集大白猪、二花脸猪个体各2头(不分性别)的耳组织，提取DNA后，等量吸取4个个体的DNA放入同一离心管中，混匀待用。

(2)引物设计

以人类PSMA1基因的cDNA序列(NM 148976)为模板，设计引物分离猪的PSMA1基因部分基因组序列，引物如下：

正向引物：5′-CTCTGCCTGTGTCTCGTCTT-3′

反向引物：5′-GTACGAGCTGATTGAGAACG-3′

PCR反应总体积为20μl，其中猪基因组DNA约100ng，含1×buffer(Promega)，1.5mmol/L MgCl₂，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0.2μmol/L，2UTaq DNA聚合酶(Promega)。

PCR扩增程序为：94℃4min，然后循环30次94℃30s，58℃退火30s，72℃40s，最后72℃延伸10min。PCR反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。

(3)克隆测序分析

将得到的PSMA1基因PCR产物按照以下常规方法进行克隆。

PCR产物的纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5ml Ependorff管中，用PCR产物纯化试剂盒(华舜公司)纯化。连接反应：将纯化的PCR产物与pMD18-T载体连接，连接反应总体积是10μl，其中包括5μl solution I，0.5μl的T载体，2.5μl的纯化PCR产物，最后加入2μl灭菌水置4℃水浴过夜。

感受态细胞购自天根生化科技有限公司。

转化：无菌状态下取100～120μl感受态细胞于1.5ml Ependorff管中，将5μl的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s，其间不要摇动Ependorff管，取出后冰浴3～4min，加入400μl无抗生素的LB液体培养基，37℃平放1h后倒置培养。

菌落PCR鉴定：经菌落PCR鉴定后的菌株在LB培养基37℃培养过夜，随即挑取多个克隆子送到上海生工生物有限公司测序。

序列经拼接后为1487bp，并分析发现扩增得的DNA序列的1249碱基处存在一个碱基突变(1249A-1249G)，通过分子生物学软件分析，发现1249碱基处的碱基突变导致Alw26I-RFLP(Restriction Fragment LengthPolymorphism)多态性。

(4)突变位点检测引物的重设计

为了提高检测效率，以(3)的测序结果为模板，重新设计了用于检测1249A-1249G的正向引物，反向引物同(1)

正向引物-新：5′-CTTATGCCTCAGGTGTGGTC-3′。

PCR反应总体积为20μl，其中猪基因组DNA约100ng，含1×buffer(Promega)，1.5mmol/LMgCl₂，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0.2μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(Promega)。

PCR扩增程序为：94℃4min，然后循环30次94℃20s，58℃退火20s，72℃20s，最后72℃延伸10min。PCR反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，产物大小为475bp，突变位点位于第237位碱基，即237A-237G。

(5)RFLP检测方法的建立

酶切反应总体积10μl，其中1×buffer 10μl，PCR产物3～5μl，限制性内切酶Alw26I为0.5μl(5U)，用H₂O补足10μl，37℃水浴4h，用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。结果发现：G等位基因只有475bp一个片段，A等位基因有228bp和247bp两个片段，这两个等位基因可组成三种基因型AA，AG，GG。

实施例2

等位基因的分布情况

(1)试验群体的设计

试验组：采集二花脸猪(23头)、小梅山猪(33头)、上海白猪(11)、清平猪(26头)、沙乌头猪(30头)、东北民猪(19头)、大白猪(28头)、长白猪(13头)、皮特兰(15头)、杜洛克(15头)和培养品种申农(30)个体的耳组织，提取DNA，共计414个DNA样本。

试验群体目的在于检测SNP标记在不同品种中的分布情况。

(2)基因型检测

利用正向引物-新：5′-CTTATGCCTCAGGTGTGGTC-3′

反向引物：5′-GTACGAGCTGATTGAGAACG-3′

进行扩增，用相同的RFLP方法检测试验群体所有的个体基因型。

(3)统计分析

记录所有个体的基因型，并计算等位基因频率，结果如下表1所示。

表1

分析该SNP位点等位基因的分布情况，发现该分子标记除了在培育品种申农中A等位基因频率占优势外，在其它品种中的等位基因频率接近，多态性丰富；品种或品系间，等位基因频率A和G的分布差异小，因此认为该SNP标记可以用于猪肉产品的DNA溯源。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

附：本发明所涉及的序列表序列分别如下：

<110>上海市农业科学院

<120>PSMA1基因中用于猪肉产品溯源的SNP分子标记及其检测方法

<160>3

<210>SEQ ID NO：1

<211>475

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>gene

<222>(1)...(475)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(237)

<223>n＝a或g

<220>

<220>

<221>intron

<222>(1)...(202)

<223>

<221>exon

<222>(203)...(273)

<223>

<220>

<221>intron

<222>(274)...(380)

<223>

<220>

<221>exon

<222>(381)..(475)

<223>

<400>1

<401>

cttatgcctc aggtgtggtc ctcaaaagac aaaagaaaaa aaaaaaagaa aaacaaaaga    60

aggaaatgtt tttctgtttt attctttctg tagtggatta tgcagcaatt aagcaatcaa    120

atctctttgt taataatgta taatttgaaa ataaagatag tactttattc cttgttagaa    180

tggactcttt aactagttta ag                                             202

aa  acc cag ata cca acg caa cga tat ggc cgg agn ccg tat ggt gtt      249

Gln Thr Gln Ile Pro Thr Gln Arg Tyr Gly Arg Arg Pro Tyr Gly Val

    1                5                   10                 15

ggg cta ctt att gct ggt tat gat                                      273

Gly Leu Leu  Ile Ala Gly Tyr Asp

                  20

gtaagttcgt aatgttatat tttaataatt ttttaaaact gaccagaaat tttccaattt    333

ttagctcaaa gtcagattta cgtagtctgt ttttcttcta tttatag                  380

gat atg ggc cct cac att ttc cag act tgt cca tct gct aac tat ttc      428

Asp Met Gly Pro His Ile Phe Gln Thr Cys Pro Ser Ala Asn Tyr Phe

    25                  30                  35

gac tgc aga gcc atg tcc att gga gct cgt tct caa tca gct cgt ac       475

Asp Cys Arg Ala Met Ser Ile Gly Ala Arg Ser Gln Ser Ala Arg

40                  45                  50

<210>SEQ ID NO：2

<211>20

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)...(20)

<223>

<400>2

cttatgcctc aggtgtggtc    20

<210>SEQ ID NO：3

<211>20

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)...(20)

<223>

<400>3

gtacgagctg attgagaacg    20

Claims (5)

1.一种PSMA1基因中用于猪肉产品溯源的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记是通过DNApool测序获得，并在包括11个猪品种或品系的试验群体中，分析该SNP分子标记在试验群体中等位基因的分布情况，来判定该SNP标记用作猪肉产品的DNA溯源。

2.如权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，所述该分子标记的PSMA1基因序列共475bp，其中包含部分第六内含子、第八外显子的序列，完整的第七外显子和第七内含子序列。

3.如权利要求2所述的SNP分子标记，其特征在于，所述PSMA1基因的DNA序列为SEQ ID NO：1，其第237位碱基处有一个碱基突变237A-237G。

4.如权利要求2所述的SNP分子标记，其特征在于，检测碱基突变237A-237G的正、反向引物的DNA序列为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。

5.如权利要求1所述的SNP分子标记的检测方法，其特征在于，采用用PCR--RFLP方法进行检测，具体包括以下步骤：

(1)构建猪的DNApool；

(2)设计引物分离PSMA1基因的DNA片段，测序并分析；

(3)突变位点检测引物的重新设计及检测方法的建立；

(4)采集11个品种和品系的耳组织样；

(5)检测SNP标记在试验群体的分布，筛选适用于猪肉产品溯源的SNP标记。