CN101705232A - 猪的snp分子标记及其引物 - Google Patents

Abstract

本发明通过在商品猪培育中使用广泛的猪种和组合中筛选PSMB6基因，寻找到可以用于猪肉产品DNA溯源的SNP分子标记，在该基因第428位有一(C/G)复等位基因SNP的分子标记。本发明还提供了一组用于鉴定猪PSMB6基因序列中SNP分子标记的引物及其方法。分析该SNP位点等位基因的分布情况，可以用于猪肉产品DNA的溯源。

Description

猪的SNP分子标记及其引物

技术领域

本发明涉及基因生物工程领域；进一步来说利用猪的PSMB6的基因，在商品猪广泛使用的猪种中鉴定到新的SNP分子标记，将此分子标记可用于猪肉产品的DNA溯源。

背景技术

民以食为天，随着生活水平和保健意识的提高，人们越来越注重食品安全问题。猪肉制品作为人膳食中重要的蛋白质来源，成为食品安全的重要组成部分。肉制品的安全隐患主要是药物残留超标和人畜共患病携带。因此实现对肉制品的可追溯管理，包括养殖、运输、屠宰、分割、销售等各个环节。通过对肉制品的溯源管理，能够为消费者提供准确而详细的有关产品的信息，有利于生产经营管理者及时发现各环节中存在的不安全隐患，为消费者提供一个获取有效可靠信息的途径，更为重要的是，大大加强了政府部门对肉质品质量安全的监管，为国家迅速建立食品安全风险的应对机制提供有效信息，将有助于社会的安定。

肉制品的溯源方法可以分为物理方法(标签溯源技术，如条形码、电子标签等)、化学方法(包括同位素溯源技术、矿物元素指纹溯源技术、有机物溯源技术等)和生物方法(虹膜特征技术和DNA溯源技术)。由于标签溯源技术存在标签丢失、记录出差、标记图案模糊不清以及标签容易人为改换等缺点，而指纹溯源技术、有机物溯源技术、虹膜特征溯源技术分别因为检测时间长，检测过程比较复杂，无法规模化而不易推广，而DNA溯源技术因为其易分型、重复性好、检测手段简单快捷、成本低廉等成为目前国际上被公认为最具发展潜力和应用价值的快速溯源技术。

DNA溯源技术的产生源于DNA的遗传与变异。每个个体所拥有独一无二的DNA序列，通过分子生物学方法所显示出来的DNA图谱也就独一无二，因此可以把DNA作为像指纹那样的独特特征来识别不同的个体。DNA指纹鉴定早已作为一种法医学物证分析方法运用到人类的刑事案件侦破以及亲子鉴定中。同样，DNA指纹鉴定也适用于肉制品的溯源乃至所有食品的溯源。用于构建个体DNA指纹图谱的分子标记，早期的有AFLP标记(扩增片段长度多态性)、SSR标记(微卫星标记)，以及新兴的SNP标记(单核苷酸多态性)。

AFLP具有的高度可靠性和操作简便性，但是AFLP存在着对模板反应表现迟钝、谱带可能发生错配与缺失、成本相对比较高等缺点。相比SSR标记和SNP标记来讲，AFLP标记更适于品种指纹的鉴定、品种质量和纯度的检测。相比SNP标记，微卫星标记的等位基因众多，多态丰富，研究表明，每个微型卫星标记的信息容量至少相当于3个SNPs甚至更多SNPs获得的信息容量，但也正因如此，使得SSR标记的带型复杂，给DNA指纹识别自动化和规模化带来困难。

SNP标记是美国学者Lander E于1996年提出的DNA遗传标记，是指基因组同一位点上单个核苷酸的变异，从理论上来说每一个SNP位点都可以有4种不同的变异形式，包括置换、颠换、缺失和插入，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者之比为2∶1，并且大部分表现为二等位基因，非此即彼.SNP标记因分布广泛，遗传稳定，并且适宜高通量自动化分析，所以日益成为动物身份识别最受关注的分子标记，并将逐步取代AFLP标记和SSR标记.

猪的育种工作者在长期的研究过程中，积累了大量的SNP标记信息，但并非所有的SNP标记都可以用作溯源，可以用于溯源的SNP标记具有以下特点：(1)变异度高，等位基因频率接近；(2)品种间等位基因分布差异小；(3)SNP侧翼序列不存在任何变异。

专利200410013385.1公开了PSMB6基因，并指出该基因主要参与泛素-蛋白酶体途径的蛋白水解，还参与其他的代谢途径。虽然已有的技术对其进行了RFLP分析，但RFLP用于品种指纹的鉴定、品种质量和纯度的检测，对上述的基因的SNP标记研究和用于溯源研究尚未有报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，在商品猪培育中使用广泛的猪种和组合中筛选PSMB6基因中以寻找可以用于猪肉产品DNA溯源的SNP分子标记。

本发明还提供了一组用于鉴定猪PSMB6基因序列中SNP分子标记的引物。

本发明还提供了用于鉴定猪PSMB6基因序列中SNP分子标记方法。

为了解决上述问题本发明的技术方案是这样的：

猪PSMB6基因中的SNP分子标记，该分子标记是通过DNApool测序获得，并根据该SNP标记在试验群体中等位基因的分布情况，可用于猪肉产品溯源。

所述的猪PSMB6基因的DNA序列，共587bp，其中包含完整内含子1的序列，部分外显子1和部分的外显子2的序列。

一种分离核酸，具有序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列，在第428位有一个碱基突变(C/G)的复等位基因的SNP标记，在SEQ ID NO.1序列中用n表示该位点，所述的SNP导致Csp6I-RFLP(Restriction Fragment LengthPolymorphism)多态性。

一组鉴定猪PSMB6基因中的SNP分子标记的引物，其特征在于，具有如序列表SEQ ID NO.2和序列表SEQ ID NO.3所示的碱基序列。

一种鉴定猪PSMB6基因中SNP分子标记的方法，其特征在于，通过PCR-Csp6I-RFLP的方法检测猪PSMB6基因。

猪PSMB6基因的mRNA序列，GenBank号码是NM_001144926。

PSMB6基因的SNP位点是通过DNApool测序比较获得，通过在试验群体中检测分析SNP标记的分布情况来筛选适于用于猪肉产品溯源的SNP标记，包括步骤：

(1)构建猪的DNApool；

(2)设计引物分离PSMB6基因的DNA片段，测序并分析；

(3)采集9个品种和品系的耳组织样，大约300个个体；

(4)检测SNP标记在试验群体的分布，筛选适用于猪肉产品溯源的SNP标记。

本发明通过鉴定猪PSMB6基因筛选获得一个新的SNP分子标记，并分析该SNP标记428位(C/G)在试验猪群中的分布，可以用于猪肉产品DNA溯源的SNP分子标记。

附图说明

图1是PSMB6基因Csp6I-RFLP酶切图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。

如图1所示的是PSMB6基因Csp6I-RFLP酶切图。序列分析结果表明第428位碱基处的碱基突变(428C-428G)，导致Csp6I-RFLP多态性。该基因座由两个等位基因控制，C等位基因只有587bp一个片段，G等位基因有428bp+159bp两个片段。这两个等位基因可组成三种基因型CC，CG，GG(见图1)。图片泳道自左至右依次为DNA Marker，GG基因型个体、CG基因型个体、CC基因型个体和CG基因型个体。

实施例1

1.分子标记的查找

(1)DNApool的构建

分别随机采集大白猪、梅山猪、杜洛克个体各2头(不分性别)的耳组织，提取DNA后，等量吸取6个个体的DNA放入同一离心管中，混匀待用；

(2)引物设计

用人PSMB6基因cDNA(GenBank收录号：NM_002798)为信息探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank猪EST数据库中做同源序列筛选，获得一系列同源性为90％以上的ESTs(片段长度大于100bp)，然后用DNAstar中的ASSEMBLY程序构建猪EST-重叠群。根据EST拼接序列设计扩增引物。

表1用于分子标记查找的引物、退火温度和预计长度

PCR反应总体积为20μl，其中猪基因组DNA约100ng，含1×buffer(Promega)，1.5mmol/L MgCl2，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0.2μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(Promega)。PCR扩增程序是：94℃ 4min，然后循环35次94℃ 30s，退火30s(温度参见表1)，72℃ 20s，最后72℃延伸5min。PCR反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

(3)测序分析：将得到的PSMB6基因PCR产物按照常规方法进行克隆，随即挑取多个克隆子进行测序，结果发现引物1扩增的DNA序列的428碱基处存在一个碱基突变(428C-428G)，通过分子生物学软件分析，发现428碱基处的碱基突变导致Csp6I-RFLP(Restriction Fragment LengthPolymorphism)多态性

(4)RFLP检测条件：酶切反应体积是10μl，其中1×buffer 10μl，PCR产物3～5μl，限制性内切酶Csp6I为0.5μl(5U)，用H2O补足10μl，37℃水浴4h，用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。C等位基因只有587bp一个片段，G等位基因有428bp和159bp两个片段，这两个等位基因可组成三种基因型CC，CG，GG。

实施例2

2.等位基因的分布情况

(1)试验群体的设计：

试验组：采集梅山猪(33头)、通城猪(50头)、清平猪(38头)、藏猪(28头)、民猪(23头)、二花脸猪(43头)、大白猪(28头)、长白猪(15头)、皮特兰(12头)、杜洛克(14头)、申农(31头)、皮申(42头)、大申(34头)和杜申(23头)个体的耳组织，提取DNA，共计414个DNA样本。试验群体目的在于检测SNP标记在不同品种中的分布情况。

(2)基因型检测：利用在上一步检测有分子标记的引物1，用相同的方法检测试验群体所有的个体基因型。

(3)统计分析：记录所有个体的基因型，并计算等位基因频率。

表2PCR-RFLP-Csp6I多态性在13个猪品种或品系中的分布

分析该SNP位点等位基因的分布情况，发现第428位G/C分子标记在不同的品种和品系中的等位基因频率接近，多态性丰富；品种或品系间，等位基因频率C和G的分布差异小；并且，序列分析结果显示该标记位点上下游100bp序列以内不存在变异，从而不影响该标记的检测结果。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

序列表

<110>上海市农业科学院

<120>猪的SNP分子标记及其引物

<130>TXPI092153

<160>3

<210>1

<211>587

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>gene

<222>(1)...(587)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(428)

<223>n＝c或t

<220>

<221>exon

<222>(1)...(118)

<223>

<220>

<221>intron

<222>(119)...(520)

<223>

<220>

<221>exon

<222>(521)...(587)

<223>

<400>1

<401>

gtaacggagg atgaag atg gcg gcc acc tta gta gct gct cgg gga gcc         49

                  Met Ala Ala Thr Leu Val Ala Ala Arg Gly Ala

                   1                5                 10

ggg ctg gca cca gcc tgg ggg cat gag gcc att acc ccc gac tgg gaa       97

Gly Leu Ala Pro Ala Trp Gly His Glu Ala Ile Thr Pro Asp Trp Glu

                15                  20                  25

aac cgg gaa gtc tcc acc ggg                                          118

Asn Arg Glu Val Ser Thr Gly

         30

gtgagcaagg acgcggggtt caggagatgc tcacaaggct tgaaatggtg gaaggataaa    178

acctggctgg gttgggagaa ctgggtggag cggagagagg tgatgtgctt aagcaggggg    238

agaggtatct taaggatgct ggagtgatgt gatgggaggt ggaaggtaag gctgaagcgt    298

gtaattctgg agtatgcagg acgaaagctt aaggccaggg tgggcctttg agaatttgag    358

gattggaaat ctggtattct gcggcccccg tgaggattta ataatgagtt agtggcgcac    418

gacattctcn tactcttgag actgaatata cagatcattg aggtttgcga atgctgtaga    478

atatggaggg gctccgattc acccctttct cctttttccc ag acc act atc atg       532

                                               Thr Thr Ile Met

                                               35

gcc gtg caa ttc gat ggg ggc gtg gtt cta gga gcc gac tcc aga aca      580

Ala Val Gln Phe Asp Gly Gly Val Val Leu Gly Ala Asp Ser Arg Thr

    40                  45                  50

acc act g                                                            587

Thr Thr

55

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)...(20)

<223>

<400>2

gtaacggagg atgaagatgg                                                20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)...(20)

<223>

<400>3

cagtggttgt tctggagtcg                                                20

Claims (6)

1.一种分离核酸，具有序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列，在第428位有一个碱基突变(C/G)的复等位基因的SNP标记，在SEQ ID NO.1序列中用n表示该位点。

2.根据权利要求1所述的一种分离核酸，其特征在于，所述的SNP导致Csp6I-RFLP多态性。

3.一组鉴定猪PSMB6基因中的SNP分子标记的引物，其特征在于，具有如序列表SEQ ID NO.2和序列表SEQ ID NO.3所示的碱基序列。

4.一种鉴定猪PSMB6基因中SNP分子标记的方法，其特征在于，通过PCR-Csp6I-RFLP的方法检测猪PSMB6基因。

5.根据权利要求4所述的鉴定猪PSMB6基因中SNP分子标记的方法，其特征在于，PSMB6基因的SNP位点是通过DNApool测序比较获得，包括步骤：

(1)构建猪的DNApool；

(2)设计引物分离PSMB6基因的DNA片段，测序并分析；

(3)采集至少9个品种和品系的耳组织样，至少300个个体；

(4)检测SNP标记在试验群体的分布，筛选适用于猪肉产品溯源的SNP标记。

6.一种猪的SNP分子标记用于猪肉产品的溯源。

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