CN105255877B - 猪6号染色体上用于溯源的snp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个猪6号染色体上用于溯源的SNP分子标记及其应用，所述的SNP分子标记是通过NCBI数据库序列比对获得的，该SNP分子标记由Eco72I限制性内切酶特异识别，共670bp，第284位碱基处有一个碱基替换，为284C或284T，其序列如SEQ ID NO.1所示，通过在包括10个猪品种或品系的试验群体中分析SNP分子标记在试验群体中等位基因的分布情况，发现本发明的SNP分子标记在不同的品种或品系中的等位基因频率接近，多态性丰富，品种或品系间等位基因频率分布差异小，并且杂合度都大于0.3，该SNP标记可用作猪肉产品DNA溯源。

Description

猪6号染色体上用于溯源的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明属于食品安全领域，具体涉及猪6号染色体上用于溯源的SNP分子标记及其应用。

背景技术

随着社会的发展，食品供应链中的环节在不断增加，从农场、牧场到食品企业的加工、包装、储藏、运输和销售，食品供应的各个环节存在食品的安全隐患，食品安全问题常有发生。因此，需要进行肉制品的可追溯管理，建立从产地到餐桌的各个环节的追溯体系，从而为消费者提供准确而详细的有关产品的信息，有利于生产经营者及时发现各环节中存在的不安全隐患。从20世纪90年代中期的食品安全危机开始，肉产品的追溯已经作为一种安全控制措施，受到世界多个国家的高度重视。肉产品追溯系统加强了政府部门对肉产品质量安全的监管能力，因此许多国家纷纷建立肉产品追溯系统用以降低肉产品质量安全中存在的风险。

肉产品溯源技术有标签溯源技术、同位素溯源技术、矿物元素指纹溯源技术、有机物溯源技术虹膜特征技术和DNA标记溯源技术(或DNA溯源技术)等，其中DNA溯源技术因为检测手段简单、快速、难以伪造等特点成为世界各国广泛应用的快速溯源技术。与其他标记方法相比，DNA标记具有特有放入优越性：它直接以DNA形式出现，在生物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受环境因素的影响，并且标记数量多，遍及生物体整个基因组。

SNP标记是第三代分子遗传标记，是指基因组同一位点上单个核苷酸的变异，一般表现为二等位基因，非常适宜高通量自动化分析，所以日益成为动物身份识别最受关注的分子标记。

但是用于肉产品溯源的SNP标记不同于一般的SNP标记，对于单个的SNP标记，它必须至少具有以下特征：(1)变异度高，在品种或品系中等位基因频率接近；(2)品种间等位基因分布频率差异小；(3)杂合度大于等于0.3。

在长期的育种工作中，研究者积累了大量的SNP标记，由于单个SNP溯源标记是无法完成溯源的，因此，需要一组相互独立的SNP标记才能实现溯源。以现有的13个已知SNP分子标记作为溯源标记组合，在经过高度选择引进的猪群体中，使用该组标记进行溯源时，会出现某些个体不能区分的情况。

另外，在长期的育种工作中，积累的大量的SNP标记往往集中分布在某些染色体上，而另外部分染色体，如5号，6号，8号，14号，15号和18号染色体等则缺乏SNP标记，容易导致分子标记间出现连锁现象，分子标记之间不能互相独立，缩小溯源实验的检测范围，导致实际可检测范围小于预期可检测范围。因此，为了满足对猪肉产品进行DNA溯源的要求，需要开发其他染色体上用于溯源的SNP标记，提高溯源检测范围及准确度。

发明内容

本发明的目的在于提供猪6号染色体上用于溯源的SNP分子标记及其应用，该SNP分子标记在商品猪培育中，可以广泛用于猪肉产品DNA溯源，特别是用于猪肉产品的安全性溯源，完善了现有标记组合，提高溯源检测准确度，扩大了溯源规模。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一个猪6号染色体上用于溯源的SNP分子标记，该SNP分子标记的DNA序列如SEQ IDNO.1所示，共670bp，第284位碱基处有一个碱基替换，为284C或284T。

进一步，所述的SNP分子标记由Eco72I限制性内切酶特异识别。

所述的SNP分子标记是通过NCBI数据库序列比对获得的，并在包括10个猪品种或品系的试验群体(共计246个个体)中，分析该SNP分子标记在试验群体中等位基因的分布情况，发现该分子标记在不同的品种和品系中的等位基因频率接近，多态性丰富，品种或品系间等位基因频率分布差异小，该SNP分子标记可用作猪肉产品DNA溯源。

所述的猪6号染色体上的一个可用于溯源的SNP分子标记的获得方法，采用PCR-Eco72I-RFLP方法进行，包括以下步骤：

1)在NCBI上搜索猪6号染色体的DNA序列信息，设计正、反向引物分离猪6号染色体的DNA片段；

2)利用NCBI数据库在线进行序列比对，寻找存在碱基替代的位点；

3)建立PCR-Eco72I-RFLP检测方法及检测替换位点；

4)采集10个品种和品系的耳组织样，共计246个个体；

5)检测SNP分子标记在试验群体的分布，统计分析，并进一步试验验证是否适用于猪肉产品溯源中。

其中，上述获得SNP分子标记的方法中，所述的分离猪6号染色体的DNA片段的正、反向引物序列如下：

正向引物：5’-TCAGTCAGTGCCGTTTCA-3’(如SEQ ID NO.2所示)；

反向引物：5’-GACAGGCAGCAATGTTAGG-3’(如SEQ ID NO.3所示)。

在DNA溯源过程中，每增加一个溯源位点，就能进一步扩大检测样本的数目，准确性也就更高，理想的SNP位点应该是均匀分布在猪不同的染色体上，而现有的SNP位点中缺乏猪6号染色体上的溯源标记。

本发明通过NCBI数据库序列比对检测到猪6号染色体上的存在的SNP分子标记，在包括10个猪品种或品系的试验群体中，分析该SNP分子标记在试验群体中等位基因的分布情况，发现该分子标记在不同的品种或品系中的等位基因频率接近，多态性丰富，品种或品系间等位基因频率分布差异小，并且杂合度都大于0.3，初步判定该SNP标记可用作猪肉产品DNA溯源以及猪肉产品的安全性溯源中。

为了完善已有SNP分子标记组合，提高溯源实验的检测准确度，扩大溯源规模，将本发明获得的猪6号染色体上的新SNP分子标记位点与其它现有已公开的SNP分子标记位点结合在一起(共计14个SNP位点)进行溯源实验。

本发明在溯源实验中，增加商品猪来源，在屠宰场共挑选了来自不同猪场的300个个体，从300个个体中随机挑选100个个体，检测该100个个体中14个SNP位点的基因型，统计每个个体的基因型结果，发现100个个体均拥有各自不同的基因型，能实现个体区分；同时，随机在这100个个体中挑取20份肌肉样，同样检测统计14个SNP分子标记位点的基因型，然后跟100个个体的基因型进行比对分析，发现均能找到与20份肌肉样品基因型完全一致的个体，即通过溯源在100个个体中找到20份猪肌肉的来源个体，因此判定本发明的该SNP分子标记可以用于猪肉产品溯源。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明的SNP分子标记位于猪的6号染色体上，能进一步完善标记的检测覆盖面，提高溯源的准确性，并扩大已有分子标记的检测范围。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。

实施例1 分子标记的查找

(1)引物设计

以猪6号染色体的DNA序列(Genbank：FN673727)为模板，设计引物分离猪的DNA片段(以一头杜洛克猪的DNA为PCR扩增的模板)，引物如下：

正向引物：5’-TCAGTCAGTGCCGTTTCA-3’(如SEQ ID NO.2所示)

反向引物：5’-GACAGGCAGCAATGTTAGG-3’(如SEQ ID NO.3所示)

PCR反应总体积为20μl，其中猪基因组DNA约100ng，含1×buffer(Promega公司)，1.5mmol/L MgCl₂，dNTP(上海生工生物公司)终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0.2μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(Promega公司)。

PCR扩增：94℃4min，(94℃30s，60℃退火30s，72℃40s)循环30次，最后72℃延伸10min。

PCR反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。

(2)克隆测序分析

将得到的猪6号染色体的DNA片段按照如下方法进行克隆。

PCR产物的纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mlEpendorff管中，用PCR产物纯化试剂盒(天根生化科技有限公司)纯化。

连接反应：将纯化的PCR产物与pMD18-T载体(大连宝生物公司)连接，连接反应总体积是10μl，其中包括5μl solution I(大连宝生物公司)，0.5μl的T载体(大连宝生物公司)，2.5μl的纯化PCR产物，最后加入2μl灭菌水置4℃水浴过夜。

转化：无菌状态下取100-120μl感受态细胞(天根生化科技有限公司)于1.5mlEpendorff管中，将5μl的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s，其间不要摇动Ependorff管，取出后冰浴3-4min，加入400μl无抗生素的LB液体培养基，37℃平放1h后倒置培养。

菌落PCR鉴定：经菌落PCR鉴定后的菌株在LB培养基37℃培养过夜，随即挑取多个克隆子送到上海生工生物有限公司测序。

经测试，该经拼接后的猪6号染色体的DNA序列共670bp，序列如SEQ ID NO.1所示。经分析，发现其第284碱基处存在一个碱基替换，为284C或284T。通过分子生物学软件分析和NCBI数据库分析，发现该第284碱基处的碱基替换导致Eco72I-RFLP(RestrictionFragment Length Polymorphism，即Eco72I-RFLP位点)多态性。

(3)PCR-Eco72I-RFLP检测方法的建立及替换位点的检测

酶切反应总体积10μl，其中1×buffer 10μl，PCR产物3-5μl，限制性内切酶Eco72I为0.5μl(5U)，用H₂O补足10μl，37℃水浴4h，称取0.6g琼脂糖溶于15.75ml DEPC(上海生工生物公司)处理水中，稍冷却(60℃)，加入5ml的5×甲醛凝胶电泳缓冲液和4.25ml的37％甲醛溶液，混匀制胶，电泳后检测酶切结果。

结果发现：如SEQ ID NO.1所示序列中T等位基因只有670bp一个片段，C等位基因有283bp和387bp两个片段，这两个等位基因可组成三种基因型，CC，CT，TT，并且，在如SEQID NO.1所示序列的第284位碱基发生替换，碱基为C或T。

实施例2 等位基因的分布情况

(1)试验群体的设计

试验组：采集皮特兰(21头)、梅山(17头)、大白(43头)、申农(52头)、长申(16头)、杜申(23头)、皮大申(11头)、长大申(25头)、杜大申(17头)和杜皮大申(20头)个体的耳组织，提取DNA，共计246个DNA样本。

试验群体的目的在于检测SNP标记在不同品种中的分布情况。

(2)基因检测

正向引物：5’-TCAGTCAGTGCCGTTTCA-3’(如SEQ ID NO.2所示)；

反向引物：5’-GACAGGCAGCAATGTTAGG-3’(如SEQ ID NO.3所示)。

进行扩增(扩增条件同实施例1)，用相同的PCR-Eco72I-RFLP方法检测试验群体所有的个体基因型。

(3)统计分析

记录试验群体所有的个体基因型，并计算等位基因频率和杂合度，结果如下表1。

表1

从表1可知：本发明的SNP分子标记在各品种中的等位基因频率接近，多态性丰富；品种或品系间，等位基因频率C和T的分布差异小；所有品种或者品系的杂合度H均大于0.3，因此初步认为该SNP标记可以用于猪肉产品的DNA溯源中。

实施例3 SNP分子标记可用性溯源试验验证

本发明的SNP分子标记已被初步证实可用于溯源性标记中，为了确保在溯源标记中的可用性，本发明又在不同地点重新取样，与现有的13个SNP分子标记(如下述表2所示)结合使用(共14个SNP分子标记)，进行可用性溯源试验验证，同时，以仅用现有的13个SNP分子标记进行溯源试验验证作对比例。

在复兴屠宰场随机采集猪个体的耳组织和肌肉样各100份(每个猪个体均同时采集耳组织样和肌肉样)，耳组织样编号E1-E100，肌肉样编号M1-M100，分别提取肌肉样和耳组织样品的DNA备用。

在100个个体耳组织样中及随机挑选的20个肌肉样品中检测本发明的猪6号染色体的Eco72I SNP位点与现有已公开的13个SNP位点的基因型(共计14个SNP分子标记位点)，统计每个个体的基因型结果。按照酶切带型，一条带记为1，出现两条带记为2，三条带记为3。记录顺序按照表2位点顺序排列，如ADAMTS-1基因的PvuⅡ酶识别的SNP分子标记位点为1，其基因型记录结果就排在第一位，ADD1基因的Eam1104Ⅰ酶识别的SNP分子标记位点为2，其基因型记录结果就排在第二位，依次类推，本发明的猪6号染色体上的Eco72I SNP分子标记位点排在最后，其基因型结果就表示为从左往右的第14个数字，个体的基因型可以表示为：21232323311222。

表2

统计每个个体和肉样的14个SNP分子标记位点的基因型，100个个体和20份肌肉样品的基因型统计对比结果分别如下表3和表4。

在表3中，82号个体和91号个体的基因型非常相似，两个个体的前13位标记数值均一致，唯一的区别在于第14位标记不同。由此可见，仅利用现有的13个SNP分子标记进行溯源时，会出现基因型重复的情况，第14位标记为本发明提供的新SNP标记，说明加入本发明的SNP分子标记后，就可以顺利将该两中基因型进行区分，本发明的新SNP分子标记的加入进一步完善了溯源组合的溯源规模，提升了用SNP分子标记对猪肉DNA进行溯源的准确性。

把20份肌肉样的14个SNP分子标记位点的基因型结果跟该100个个体的基因型进行比对分析(比对结果参看表4)，发现均能找到与该20份肌肉样品基因型完全一致的个体，即通过溯源在100个个体中找到20份猪肌肉的来源个体，实现肉样到个体的准确溯源。

结合表3和表4说明，利用14个SNP分子标记进行溯源试验，100个个体、20份肌肉样用14个SNP分子标记检测均拥有不同的基因型，能实现个体区分。

表3

编号	基因型	编号	基因型	编号	基因型
						E1	33332332132313	E35	33333232131332	E68	23311222133231
E2	21211233132122	E36	31333132311133	E69	23313333333222
						E3	33333232331123	E37	22213233131323	E70	21231233333213
E4	23311232111312	E38	32311312313312	E71	22112133233311
						E5	23113332231332	E39	22333231121221	E72	21231122211122

E6	23332221321321	E40	33332223111332	E73	31313113323223
						E7	33231232321332	E41	21233113113322	E74	12313322311133
E8	23332222131123	E42	33311312333122	E75	21211333311323
						E9	33312333332133	E43	21233112131323	E76	23333333321312
E10	23333333111331	E44	31211313213331	E77	23311232333321
						E11	21211332123111	E45	21312233331233	E78	22131232333333
E12	12121313131112	E46	21232212131121	E79	12133233222321
						E13	33312232313213	E47	21211211333222	E80	31211212311133
E14	32112212111321	E48	21232312331232	E81	21231222322323
						E15	23113132231111	E49	33333232133222	E82	21231233333332
E16	23132311121122	E50	31133211131323	E83	21211212111331
						E17	33231311321232	E51	33332333331231	E84	33331332333323
E18	32132231321323	E52	21133232323223	E85	31311222112211
						E19	21213132321113	E53	21232132123111	E86	12132112133221
E20	21211212331333	E54	21232332321113	E87	23223212322221
						E21	23313332323313	E55	21213232131212	E88	23311312333112
E22	33312233233211	E56	33132122332312	E89	13133212313113
						E23	23111212323112	E57	33132312131133	E90	23311222132223
E24	22111222323313	E58	33333332333212	E91	21231333233333
						E25	32113232321112	E59	31332333113311	E92	31212212123111
E26	21222223333332	E60	21313232321131	E93	33311232311132
						E27	33312232132113	E61	31313133231331	E94	32131332233332
E28	32111222322221	E62	32132211313332	E95	23312332323113
						E29	32311213123112	E63	33313233213331	E96	13332223323113
E30	32113213123222	E64	21321332221313	E97	21211132323331
						E31	32311333123112	E65	32112213231223	E98	21332212132211
E32	21213232323322	E66	23333112321312	E99	11332212311322
						E33	32131132333223	E67	33312312333231	E100	23313231323331
E34	31222212111133

表4

编号	基因型	对应个体	编号	基因型	对应个体
						M1	31313133231331	E61	M11	33333232133222	E49
M2	31333132311133	E36	M12	23311312333112	E88
						M3	33231311321232	E17	M13	33332223111332	E40
M4	23332222131123	E8	M14	21232132123111	E53

M5	21211332123111	E11	M15	21232212131121	E46
						M6	22111222323313	E24	M16	33312232132113	E27
M7	31313113323223	E73	M17	23313333333222	E69
						M8	33311312333122	E42	M18	22112133233311	E71
M9	21133232323223	E52	M19	23113132231111	E15
						M10	13133212313113	E89	M20	32131132333223	E33

Claims (4)

1.猪6号染色体上用于溯源的SNP分子标记，该SNP分子标记的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，共670bp，第284位碱基处有一个碱基替换，为284C或284T。

2.根据权利要求1所述的猪6号染色体上用于溯源的SNP分子标记，其特征在于，该SNP分子标记由Eco72I限制性内切酶特异识别。

3.用于扩增权利要求1所述的猪6号染色体上用于溯源的SNP分子标记的引物对，其特征在于，其包括正向引物、反向引物，具体碱基序列如下：

正向引物：如SEQ ID NO.2所示；

反向引物：如SEQ ID NO.3所示。

4.如权利要求1或2所述的猪6号染色体上用于溯源的SNP分子标记或权利要求3所述的引物对在猪肉产品DNA溯源中的应用。