CN116004843A - 一种与猪体长相关的snp分子标记及其扩增引物和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与猪体长相关的SNP分子标记及其扩增引物和应用。该分子标记位于猪HHEX基因的5’UTR区前的启动子区第‑416位碱基和‑288位碱基(以ATG前的第一个碱基为‑1)，分别存在C‑T突变和G‑A突变，且完全连锁。本发明首次发掘了猪HHEX基因中的一对完全连锁SNP分子标记与猪的体长性状相关，因此可用于猪标记辅助选择育种，即提供了猪HHEX基因中一对完全连锁SNP分子标记在猪体长性状的标记辅助育种的新用途，实现了对猪体长性状的早期筛选，筛选方法简单快速。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记技术领域，尤其涉及一种与猪体长相关的SNP分子标记及其扩增引物和应用。
背景技术
我国是世界第一大猪生产和消费大国，猪肉在我国肉类消费中占比长期保持60％以上。体长性状是物种进化过程中最重要的数量性状之一，其在物种间以及物种内不同品种间均存在较大差异。已有研究表明体长性状遗传力为0.29-0.55，是中等以上遗传力性状，生物体的生长发育、健康以及疾病等正相关，是一个受多因素作用的综合复杂性状。在农用经济动物中，体长性状与动物的产肉量息息相关，因此一直是家畜养殖业的重要改良性状之一。研发出快速、简便、有效的猪体长性状的分子遗传标记，可以应用于大群体的检测，进行早期选种选育，增加体长的选择压，加快遗传改良工作进程。
HHEX(Hematopoietically expressed homeoboxprotein，造血表达同源框蛋白)是一种含DNA结合同源域的分歧同源蛋白类转录因子。研究显示，HHEX是一种在造血细胞、血管系统、肝脏、甲状腺、心脏、胰腺和皮肤发育过程中，通过调控细胞的增殖和分化而形成正常形态的关键转录因子。在软骨细胞中研究发现，HHEX在小鼠软骨细胞分化过程中可促进软骨细胞标志因子X型胶原蛋白(COL10)的表达，从而影响软骨发育。而软骨发育与体长性状直接相关，说明HHEX基因在体长发育中起到关键性的作用。HHEX及其家族成员在小鼠模型上的功能研究较为透彻，而在猪上的功能至今仍未有报道。此外，猪HHEX基因中是否存在于可用于猪体长性状选育的分子标记也尚不清楚。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种与猪体长相关的SNP分子标记及其扩增引物和应用。
本发明的第一个目的在于提供与猪体长性状相关的SNP分子标记。
本发明的第二个目的是提供检测该SNP分子标记的引物、试剂盒。
本发明的第三个目的是提供上述SNP分子标记、引物和试剂盒在选育长体长猪种中的应用。
本发明的第四个目的是提供利用所述的SNP分子标记鉴定猪体长的方法以及猪品种改良育种的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
首先以10头五指山猪和10头大白猪基因组为模板，利用PCR技术混池测序了猪HHEX基因启动子区段部分碱基序列，通过对HHEX基因的部分区段的序列分析，序列结果采用chromasPro v1.41软件进行分析寻找SNP突变位点，筛选出影响猪体长性状的SNP位点，发现在HHEX基因的5’UTR区前的启动子区第-416位碱基和-288位碱基(以ATG前的第一个碱基为-1)分别存在C-T突变和G-A突变，且完全连锁。
进一步，本发明通过大规模的SNP分型工作，以24头五指山猪(平均体长)、22头巴马香猪(平均体长)、24头藏猪(平均体长)、34头版纳小型猪(平均体长)、47头江口萝卜猪(平均体长)、37头隆林猪(平均体长)、36头民猪(平均体长)、14头雅南黑猪(平均体长)、35头黔北黑猪(平均体长)、35头撒坝猪(平均体长)作为中短体长品种验证群体同时30头长白猪(平均体长)、29头大白猪(平均体长)作为长体长品种验证群体(实验用猪体长数据来自于《中国畜禽遗传资源志·猪志》2011年5月)，发现TT和AA基因型群体的平均体长显著长于CC和GG基因型群体平均体长。然后采用R语言中GenABLE软件包的线性模型进行了分析发现，这一SNP位点显著关联于个体体长性状。采用中国地方猪种五指山猪、巴马香猪、藏猪、版纳小型猪、江口萝卜猪、隆林猪、民猪、雅南黑猪、黔北黑猪和撒坝猪为中短体长猪种与长体长型大白猪和长白猪进行该SNP等位基因频率分析，发现两个SNP位点等位基因T和A在中国地方猪种中基因频率较低，均低于0.30，而在大白猪和长白猪基因频率极高，均高于0.90。根据这一情况进一步证实了上述的关联分析观点：这两个SNP位点显著关联于猪体长性状，其中等位基因T和A为正相关于长体长性状，等位基因C和G正相关于中短体长性状。
具体地，本发明提供了一种与猪体长相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记包括SNP1位点和/或SNP2位点；所述SNP1位点为位于猪HHEX基因启动子区的第-416位碱基处的C/T突变；所述SNP2为位于猪HHEX基因启动子区的第-288位碱基处的G/A突变；其中，以ATG前的第一个碱基为第-1位。
进一步地，本发明提供了扩增所述SNP分子标记的引物。
其中，所述的引物，其特征在于，包括：
核苷酸序列如SEQ ID NO1～2所示的上、下游引物，或核苷酸序列如SEQ ID NO3～4所示的上、下游引物，
本发明还提供一种鉴定猪体长的试剂盒，包括SEQ ID NO1～2所示的上、下游引物，以及EagI内切酶。
本发明还提供另一种鉴定猪体长的试剂盒，包括SEQ ID NO2～3所示的上、下游引物。
本发明还提供了所述的SNP分子标记，所述的引物，或所述的试剂盒，在选育长体长猪种中的应用；当SNP1位点和SNP2位点的基因型分别为CC和GG，或分别为CT和GA时，待测猪为中短体长个体；当SNP1位点和SNP2位点的基因型分别为TT和AA时，待测猪为长体长个体。
本发明还提供一种所述的SNP分子标记鉴定猪体长的方法，其特征在于，包括以下步骤：
利用SEQ ID NO.1-2所示的上下游引物对待测猪基因组DNA进行PCR扩增；
用EagI内切酶对PCR产物进行酶切，根据酶切结果确定SNP1位点和SNP2位点的基因型，进而判定猪的体长；
所述确定SNP1位点和SNP2位点的基因型，判定猪的体长的方法为：若酶切产物为165bp，则SNP1位点和SNP2位点的基因型分别为TT和AA，待测猪为长体长个体；
若酶切产物为108bp和57bp，则SNP1位点和SNP2位点的基因型分别为CC和GG，若酶切产物为165bp、108bp和57bp，则SNP1位点和SNP2位点的基因型分别为CT和GA；若基因型为CC和GG、或为CT和GA，则待测猪为中短体长个体。
本发明还提供一种所述的SNP分子标记鉴定猪体长的方法，其特征在于，包括以下步骤：
利用SEQ ID NO.3-4所示的上下游引物对待测猪基因组DNA进行PCR扩增，检测SNP1位点和SNP2位点的基因型；
当SNP1位点和SNP2位点的基因型分别为CC和GG时，待测猪为中短体长个体；当SNP1位点和SNP2位点的基因型分别为TT和AA时，待测猪为长体长个体。
在本发明的实施例中，上述PCR扩增的反应程序为：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃15s，共35个循环；72℃10min。
本发明还提供一种猪品种改良育种的方法，利用所述的鉴定猪体长的方法对待测猪品种的体长进行鉴定，以长体长个体为亲本进行育种。
本发明的有效效果如下：
本发明首次公开了与猪体长性状相关的SNP分子标记，用于区别中短体长和长体长个体，适用于中国猪种和国外猪种，适应猪种范围广。本发明的检测SNP分子标记基因型的方法能够早期、快速、低成本、有效的预测猪体长，在猪品种品系的改良方面有广阔的应用前景，并能够取得优异的经济价值。
附图说明
图1为不同猪种突变位置序列比对；
图2-A、图2-B分别为五指山猪和大白猪HHEX基因的5’UTR区前启动子区第-416位置处测序峰图；图2-C、图2-D分别为五指山猪和大白猪HHEX基因的5’UTR区前启动子区第-288位碱基突变位置处测序峰图；
图3为EagI创造内切酶分析示意图；
图4为三种基因型EagI酶切后琼脂糖电泳结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种与猪体长相关的SNP分子标记及其扩增引物和应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明实施例中所用的各品种猪种质资源来自各个原产地地区的保种场，如实施例中的五指山猪来源于海南省农业科学院五指山猪资源保种场，大白猪来源于北京养猪育种中心。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1与体长性状相关的SNP分子标记的获得
以10头五指山猪和10头大白猪基因组为模板，为上述验证，利用PCR技术混池测序了猪HHEX基因启动子区段部分碱基序列，补充了部分基因组序列。
通过对HHEX基因的部分区段的序列分析，序列结果采用chromasProv1.41软件进行分析寻找SNP突变位点，筛选出影响猪体长性状的SNP位点，发现在HHEX基因的5’UTR区前的启动子区第-416位碱基和-288位碱基(以ATG前的第一个碱基为-1)分别存在C→T突变和G→A突变，且完全连锁。
根据NCBI公布的猪HHEX基因序列(NM_001244579.1)显示，HHEX基因位于猪第14号染色体，由4个外显子组成，全长1190bp。设计引物扩增猪HHEX基因mRNA和启动子区序列，本实施例的引物序列见表1，能够扩增猪HHEX基因启动子区的一段长为654bp的片段。
表1 HHEX基因SNP检测特异性引物
通过上述引物，首先在体长差异极显著的五指山猪和大白猪群体中进行SNP的筛选，采用各个软件(chromasPro v1.41、VectorNTI.Advance11等)结合比对和关联统计分析筛选，发现两处疑似影响猪体长性状的SNP位点，位于5’UTR前面的启动子区第-416位碱基和-288位碱基(以ATG前的第一个碱基为-1)分别存在C→T突变和G→A突变(见图1)。根据测序峰图确认该位置确实存在G/A的突变(见图2A-图2D)。
采用中国地方猪种五指山猪、巴马香猪、藏猪、版纳小型猪、江口萝卜猪、隆林猪、民猪、雅南黑猪、黔北黑猪和撒坝猪为中短体长猪种与长体长型大白猪和长白猪进行该SNP等位基因频率分析，发现两个SNP位点等位基因T和A在中国地方猪种中基因频率较低，均低于0.30，而在大白猪和长白猪基因频率极高，均高于0.90。这一结果进一步证实了上述的关联分析观点：本发明在猪HHEX基因5’UTR前面的启动子区第-416位碱基的C→T突变和-288位碱基的G→A突变(以ATG前的第一个碱基为-1)与猪体长性状显著关联，其中等位基因T和A为正相关于长体长性状，等位基因C和G正相关于中短体长性状。
实施例2检测与猪体长性状相关的SNP分子标记方法的建立
1、利用RFLP限制性内切酶检测SNP位点群体水平
根据实施例1的研究结果以及序列的特性选择利用限制性内切酶长度多态性(RFLP,Restriction Fragment Length Polymorphism)对实施例1的SNP分子标记进行群体水平检测。由于两个SNP位点完全连锁，当第一个位点(即HHEX基因的5’UTR区前的启动子区第-416位)碱基为C时，第二个位点碱基(即HHEX基因的5’UTR区前的启动子区第-288位)则为G，第一个位点碱基为T时，第二个位点碱基则为A。因此，在突变位置上游利用特异性引物引入突变创造EagI内切酶位点(见表2)，当第一个SNP位点处碱基为C时则能被EagI酶切，为T时则不能被EagI酶切，借此用于分型(如图3)。利用表2引物进行PCR扩增。
具体的，若酶切产物为165bp，两个突变处碱基分别为TT和AA，若酶切产物为108bp和57bp，则两个突变处碱基分别为CC和GG，若酶切产物为165bp、108bp和57bp，则两个突变处碱基分别为CT和GA。
表2利用EagI酶切检测G/A突变特异性引物
表3 pstI酶切反应体系
| 试剂 | 体积(ul) |
| PCR产物 | 5 |
| 10*Buffer | 2 |
| EagI | 0.5 |
| <![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> | 12.5 |
| 总体积 | 20 |
经过酶切之后将20μl酶切产物用于4％的琼脂糖凝胶电泳100v，50min后，可根据电泳条带位置具体进行分型如图4。结果发现两个SNP位点C和G基因型在中国地方猪种中频率较高,而T和A基因型在国外猪种中如长白和大白猪中频率较高，具体分布频率如下表4:
表4第一个SNP位点不同猪种基因型频率和等位基因频率分布
2、群体水平关联分析
将上述368头猪的SNP分型数据与体长性状表型数据(体长数据来自于《中国畜禽遗传资源志·猪志》2011年5月)进行整理，见表5。
表5不同猪群体体长性状表型统计量
群体基因分型结果显示，本发明中两个SNP等位基因T和A在长白猪和大白猪等长体型型猪品种分布频率较高，显著高于中国中短体型猪品种如五指山猪、藏著、版纳小型猪等。进一步构建个体TA基因型与体长表型之间的线性回归模型，最终得到两者之间的线性回归模型为Y＝74.24X+90.45，P＝0.040，表明本发明的SNP分子标记中TA基因型与猪长体长性状呈现显著正相关，综上所述，C→T和G→A位点与猪体长性状相关，可作为标记用于选育长体长群体改良工作。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种与猪体长相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记包括SNP1位点和/或SNP2位点；所述SNP1位点为位于猪HHEX基因启动子区的第-416位碱基处的C/T突变；所述SNP2为位于猪HHEX基因启动子区的第-288位碱基处的G/A突变；其中，以ATG前的第一个碱基为第-1位。
2.扩增权利要求1所述的SNP分子标记的引物。
3.根据权利要求2所述的引物，其特征在于，包括：
核苷酸序列如SEQ ID NO1～2所示的上、下游引物，或核苷酸序列如SEQ ID NO3～4所示的上、下游引物。
4.一种鉴定猪体长的试剂盒，其特征在于，包括SEQ ID NO1～2所示的上、下游引物，以及EagI内切酶。
5.一种鉴定猪体长的试剂盒，其特征在于，包括SEQ ID NO2～3所示的上、下游引物。
6.权利要求1所述的SNP分子标记，权利要求2或3所述的引物，或权利要求4或5所述的试剂盒，在选育长体长猪种中的应用；当SNP1位点和SNP2位点的基因型分别为CC和GG，或分别为CT和GA时，待测猪为中短体长个体；当SNP1位点和SNP2位点的基因型分别为TT和AA时，待测猪为长体长个体。
7.一种利用权利要求1所述的SNP分子标记鉴定猪体长的方法，其特征在于，包括以下步骤：
利用SEQ ID NO.1-2所示的上下游引物对待测猪基因组DNA进行PCR扩增；
用EagI内切酶对PCR产物进行酶切，根据酶切结果确定SNP1位点和SNP2位点的基因型，进而判定猪的体长；
所述确定SNP1位点和SNP2位点的基因型，判定猪的体长的方法为：若酶切产物为165bp，则SNP1位点和SNP2位点的基因型分别为TT和AA，待测猪为长体长个体；
若酶切产物为108bp和57bp，则SNP1位点和SNP2位点的基因型分别为CC和GG；若酶切产物为165bp、108bp和57bp，则SNP1位点和SNP2位点的基因型分别为CT和GA；若基因型为CC和GG、或为CT和GA，则待测猪为中短体长个体。
8.一种利用权利要求1所述的SNP分子标记鉴定猪体长的方法，其特征在于，包括以下步骤：
利用SEQ ID NO.3-4所示的上下游引物对待测猪基因组DNA进行PCR扩增，检测SNP1位点和SNP2位点的基因型；
当SNP1位点和SNP2位点的基因型分别为CC和GG时，待测猪为中短体长个体；当SNP1位点和SNP2位点的基因型分别为TT和AA时，待测猪为长体长个体。
9.一种猪品种改良育种的方法，其特征在于，利用权利要求7或8所述的方法对待测猪品种的体长进行鉴定，以长体长个体为亲本进行育种。
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