CN101654708B - 长梗黄精微卫星标记 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了长梗黄精微卫星标记，包括长梗黄精微卫星(CT)n富集文库的构建；含微卫星序列阳性克隆的筛选及测序，得到84个含有微卫星重复序列的克隆；筛选得到11个多态性高的微卫星分子标记Pt1、Pt2、Pt3、Pt4、Pt5、Pt6、Pt7、Pt8、Pt9、Pt10、Pt11；本发明的这11个微卫星标记能用于研究长梗黄精的遗传多样性、黄精属植物种间和居群间的变异和进化关系，具有重复性好，是一种可靠有效地分子标记。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记技术，具体涉及一种长梗黄精微卫星分子遗传标记。
背景技术
微卫星DNA又称作短串连重复(Short Tandem Repeats，STRs)、简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSRs)、简单序列长度多态性(SSLP)。是指基因组中以1～6个核苷酸为单位串联组成的核苷酸序列。根据重复单元的构成，微卫星DNA序列被分为3种类型：单一型，复合型(compound)和间断型(interrupted)。例如：
单一型：ATATATATATATATATATATATAT
复合型：ATATATCACACACACACACAC
间断型：ATATATCA ATATATCA ATATATA
微卫星DNA作为一种分子标记具有以下特点：广泛分布于真核生物的基因组中；核心序列的重复次数在个体间呈高度变异性，多态性信息容量高：呈共显性，遵循孟德尔法则遗传；选择中性等等。
基于以上特点，微卫星DNA被广泛用于植物遗传图谱的构建、基因定位、品种鉴定和种质保存、数量性状基因的分析、辅助育种、构建指纹图谱、遗传多样性及物种进化与亲缘关系等方面的研究。
黄精为百合科黄精属多年生草本植物，是我国特有植物，为药用黄精原植物中的一种。药用黄精的肉质根状茎具有补气养阴、健脾润肺、益肾生津等功效，被视为传统的中药材，并誉有“血气双补之土”之称。另外长梗黄精还具有食用，保健和观赏价值。
近年来，人们对黄精及其黄精属植物的研究不断深入，现代药理研究证实，其化学成分主要有：黄精多糖、粘液质、淀粉、甾体皂苷、蒽醌类化合物、生物碱、强心苷、木脂素、维生素和多种对人体有用的氨基酸等化合物。目前有研究表明黄精多糖能增强机体的免疫、延缓衰老、抗菌、抗病毒和降脂、降糖作用。李循等研究发现黄精多糖能活化巨噬细胞、活化淋巴细胞、提高NK细胞和LAK细胞的活性、促进有丝分裂作用、增强网状内皮系统、促进细胞因子分泌、增强红细胞免疫等作用而提高宿主免疫功能。黄精甾体皂苷具有去痰止咳之功效，还具有抗炎、抗肿瘤、抗真菌等作用。
黄精属药用植物包括长梗黄精、黄精、湖北黄精、安徽黄精、多花黄精、玉竹等。研究发现它们的性状和药用功效存在一定差异，有些不能混用，如黄精和玉竹在临床上就是不能混用的。
黄精种属的分子标记研究起步很晚，目前报道的只是RAPD分子标记，ISSR分子标记，但RAPD分子标记稳定性，重复性差，ISSR分子标记通常为显性标记，不能区分纯和基因型和杂合基因型，相比而言微卫星标记是共显性标记，具有更丰富的多态性，实验结果且稳定性好，可重复性高。但长梗黄精的微卫星标记尚未见报道。
发明内容
本发明解决的技术问题：分离克隆长梗黄精的微卫星DNA分子标记，建立长梗黄精微卫星DNA技术体系并用这些分子标记研究长梗黄精遗传多样性，黄精属植物种间和居群间的变异和进化关系以及进行长梗黄精品种鉴定。
实现上述发明的技术方案：包括长梗黄精微卫星(CT)n富集文库的构建；含微卫星序列阳性克隆的筛选及测序，得到84个含有微卫星重复序列的克隆；筛选得到11个多态性高的微卫星分子标记Pt1、Pt2、Pt3、Pt4、Pt5、Pt6、Pt7、Pt8、Pt9、Pt10、Pt11；Pt1为250个核苷酸，Pt2为370个核苷酸，Pt3为277个核苷酸，Pt4为905个核苷酸，Pt5为729个核苷酸，Pt6为343个核苷酸，Pt7为247个核苷酸，Pt8为403个核苷酸，Pt9为297个核苷酸，Pt10为298个核苷酸，Pt11为319个核苷酸。
附图说明
图1：Pt1位点的特异性引物扩增21个长梗黄精的DNA的银染PAGE图。
图2：Pt2位点的特异性引物扩增21个长梗黄精的DNA的银染PAGE图。
图3：Pt3位点的特异性引物扩增21个长梗黄精的DNA的银染PAGE图。
图4：Pt4位点的特异性引物扩增21个长梗黄精的DNA的银染PAGE图。
图5：Pt5位点的特异性引物扩增21个长梗黄精的DNA的银染PAGE图。
图6：Pt6位点的特异性引物扩增21个长梗黄精的DNA的银染PAGE图。
图7：Pt7位点的特异性引物扩增21个长梗黄精的DNA的银染PAGE图。
图8：Pt8位点的特异性引物扩增21个长梗黄精的DNA的银染PAGE图。
图9：Pt9位点的特异性引物扩增21个长梗黄精的DNA的银染PAGE图。
图10：Pt10位点的特异性引物扩增21个长梗黄精的DNA的银染PAGE图。
图11：Pt11位点的特异性引物扩增21个长梗黄精的DNA的银染PAGE图。
具体实施方式
实施例1：
1、长梗黄精微卫星DNA富集文库的构建
1.1基因组的提取与酶切：
用Doyle J介绍的CTAB法(Doyle J.DNA protocols for plants-CTAB totalDNA isolation[A].In Hewitt GM，Johnston A(eds.)，Molecular Techniquesin Taxonomy[M].Berlin：Springer，1991，283-293)提取基因组，用限制性内切酶Sau3AI(购自TaKaRa公司)酶切基因组，酶切产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，紫外光下切下300-900bp大小的DNA片段并用胶回收试剂盒(购自上海生工)纯化回收的酶切产物。
1.2加接头：
将纯化回收的酶切产物的两端加入接头：
LA(5’-GGCCAGAGACCCCAAGCTTCG-3’)
LB(5’-PO4-GATCCGAAGCTTGGGGTCTCTGGCC-3’)，
在T4连接酶(购自Promega公司)作用下16℃水浴连接过夜。
1.3PCR检测接头连接：
以LA为引物，以1.2工序制的连接产物为模板进行PCR，(50μl反应体系如下：25μl TaqGreen(购自Promega公司)，5μl引物LA，5μl连接产物，加水H2O补至50μl。PCR反应程序如下：94℃预变性5分钟，94℃变性50秒，56℃退火一分钟，72℃延伸2分钟，变性至退火三个步骤重复25次，72℃充分延伸10分钟。PCR产物用纯化试剂盒(购于Axygen公司)进行纯化。
1.4磁珠富集：
将1.3所制的纯化产物与杂交探针(CT)15在70℃下杂交一个半小时。将杂交液加入已平衡好的磁珠，室温放置30分钟。将离心管依次用6×SSC，2×SSC，1×SSC于60℃洗两次，最后用0.1×SSC室温洗一次。加入TE缓冲液，在PCR机上95℃变性15分钟，收集上清。
1.5PCR富集：
以磁珠富集产物为模板，LA为引物进行PCR扩增，25μl反应体系如下：
TaqGreen 12.5μl，LA 1.5μl，富集后的DNA2.5μl，加水补至25μl。PCR反应程序如下：94℃预变性3分钟，94℃变性35秒，60℃退火35秒，72℃延伸1分钟，变性至退火三个步骤重复25次，72℃充分延伸12分钟。PCR产物用纯化试剂盒进行纯化。
1.6感受态细胞的制备：
将1mL过夜培养的E.coli DH5α培养液接于50mL液体LB培养基中，37℃振荡培养2小时至对数生长期(OD600≈0.3-0.6)时取出。将菌液于4℃离心10分钟。弃上清，加入1mL 0.1mol/L预冷的Cacl2重新悬浮细胞，用枪头轻轻打匀。4℃离心10分钟。弃上清，加入预冷的甘油/CaCl2混合物重新悬浮菌体，用枪头打匀，-80℃保存。
1.7倒平板：
将LB固体培养基完全融化，冷却至50℃左右，配成LB/Amp/X-Gal/IPTG平板培养基(比例为：LB固体培养基100mL；Amp青霉素100μl；20％异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)7μl；2％5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)40μl)，混合均匀后倒入一只培养皿里，待培养基凝固后放入37℃烘箱，晾干水蒸气。
1.8连接转化：
取1.5工序所制的PCR富集后的纯化产物加入pMD19-T载体(购自TaKaRa公司)于16℃水浴连接2小时，制成连接产物。
取出感受态细胞，冰上复苏至液态，加入上述连接产物，混匀。冰浴30分钟后放入42℃水浴锅，热激90秒，立即放入冰中冰浴2分钟，加入新鲜的LB培养基，37℃振荡培养1-1.5小时。取70μl培养液涂布于LB/Amp/X-gal/IPTG培养基上，37℃倒置培养过夜。
2.阳性克隆的筛选：
将平板上的白色单菌落分别放入事先装有LB/Amp培养基的EP管中。37℃振荡培养至菌液浑浊。15μl PCR反应体系包括：Taq酶0.075U(购自TaKaRa公司)，10×Buffer1.5μl，dNTP0.2μM，mg2+1.5μM，引物0.4μM(LA，primer-c(CT15))，水。反应程序：94℃预变性3分钟，94℃变性50秒，56℃退火35秒，72℃延伸1分钟，变性至延伸三个步骤重复30次。最后72℃充分延伸12分钟，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
3.阳性克隆测序及引物设计：阳性克隆送生物公司测序，共得到84条含有微卫星DNA的序列。根据微卫星DNA两侧的序列，利用软件primerprimer5设计引物，如表1所示。
实施例2：
2.1筛选有多态性的引物：
用1.1的CTAB法提取长梗黄精基因组。用设计的引物(表1)扩增基因组。反应程序：94℃预变性4分钟，94℃变性45秒，退火30秒(退火温度见表1)，72℃延伸35秒，变性至退火三个步骤重复35次。最后72℃充分延伸8分钟。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物用PAGE电泳进行检测，共得到11个有多态性的微卫星标记；Pt1为250个核苷酸，Pt2为370个核苷酸，Pt3为277个核苷酸，Pt4为905个核苷酸，Pt5为729个核苷酸，Pt6为343个核苷酸，Pt7为247个核苷酸，Pt8为403个核苷酸，Pt9为297个核苷酸，Pt10为298个核苷酸，Pt11为319个核苷酸。
2.2结果分析：
使用Cervus3.0软件计算期望杂合度和观察杂合度。使用Genepop3.4软件计算哈代-温伯格以及连锁不平衡的值，以此来描述11个长梗黄精微卫星DNA多态位点的特征。
由附图1-11可看出，本发明的11个微卫星序列的长度在供试的长梗黄精中都出现了多样性，由此可见，本发明的这11个微卫星标记能用于研究长梗黄精的遗传多样性、黄精属植物种间和居群间的变异和进化关系，具有重复性好，是一种可靠有效地分子标记。
表1：引物特性表
表1中F表示5’端引物，R表示.3’端引物。
序列表
<110>安徽师范大学
<120>长梗黄精微卫星标记
<130>1
<160>11
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>250
<212>DNA
<213>长梗黄精(Polygonatum filipes Merr)
<400>1
ccctaaatct cccaatcctc cttcaattgg tcgtcctagt ggagcatcgc ggacaacgcc 60
gaggagtcca ccgctacctc caggtccttc ccccgttact ccgcccccct cccctctctc 120
tctctctctc tctctctctc tctctgtctc tctctcctcc tgtcatcgtc ccgctgttct 180
ctctcccccg tcagtcatcg gtgacgtcgc cctgtcctcc ttagcagctc aacaaccacc 240
tccgccctct 250
<210>2
<211>370
<212>DNA
<213>长梗黄精(Polygonatum filipes Merr)
<400>2
ctcccttaac cgaaatgtat gtgtcccata ccacatttag atcagttaag ttcaagttac 60
aatggaacta agaaataaga gacgggacgt agttcgagaa gtgtagatgg agagagagag 120
agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag aacaactgtg aaattccctg 180
agaggtacct atagttacat caggcgaaga ccagggaccg aagccaccat tccttccctt 240
gtggggattt caaagcatgg ggagagagaa aagaaggcca aagaaacaac tgttgttacc 300
tgagaggtac tgttgagcac gttaggtcta tgaccaggtg tcaagactgt cctgatcgca 360
gtaggactat 370
<210>3
<211>277
<212>DNA
<213>长梗黄精(Polygonatum filipes Merr)
<400>3
cgggggagat gccatgaaag agatggagag agaaaatgaa gagagaaaga gaaagagatg 60
atagagaggc aatggaggga tggagagaga gaagggggag agaaggagag agagataatt 120
agagagagaa agaggatgag agacaaaggg agttatagag agagagagag agagagaaac 180
accgacgagg ggggcggctg ccagtggtta ttggctatgg ctaagcacgg ccccaagtgg 240
ggaggcggcc acctatggga gagaggggaa gtgggga 277
<210>4
<211>905
<212>DNA
<213>长梗黄精(Polygonatum filipes Merr)
<400>4
gtgaggttac gacggcagtg attcgagctc ggtacccggg gatcctctag agattggcca 60
gagaccccaa gcttcggatc caaatctaac tagctaaagt aagctaacta atacaactga 120
tgaacaaaga aatcgatttc attttctttt cttttctttc cttttacatt gctctgtctc 180
acaaactcac tctctctctc tctctctctt tctctctctc tctctctgaa ccaagcgcag 240
cagcacccct agctcttctg accccaagga acccaccaac ttccctgttc cccctcgtgg 300
aacactacaa tctcccctac cagaacaacc actccacccc caactcctcc tccaccactg 360
cagctcgacc gtaccacccc catcaccact gccttcaaga cctcaccctc gcctacgctt 420
ccccatcaac cacttgatcc gaagcttggg gtctctggcc aatcgtcgac ctgcaggcat 480
gcaagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca 540
attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg 600
agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg 660
tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tatttgggcg 720
cttcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 780
tatcagcctc actcaaaggc gggaattcgg ttatccacag aatcagggat aacgcagaaa 840
aaacatgtga gcaaaaggca gtaaaggtca ggaaccgtaa aaggccgcgt tgttggcgtt 900
tttct 905
<210>5
<211>729
<212>DNA
<213>长梗黄精(Polygonatum filipes Merr)
<400>5
cggagtttac gacagcagtg aattcgagct cggtacccgg ggatcctcta gagattggcc 60
agagacccca agcttcggat cagagggcgg gggtggttgt tgagctgcta aggaggacag 120
ggcgacgtca ccgatgactg acgggggaga gagaacagcg ggacgatgac aggaggagag 180
agagagagag agagagagag agagagagag agaggcgggg ggcggattaa cgggggaagg 240
acctggaggt agcggtggac tcctcgtcct tgtccgcgat gctccactag gacgccctct 300
tgaaggagga atcgaatctt gtggtctctg gctctttcgt cgacctgtag gcatgcaagc 360
ttggagtaac ttgggtctaa ctgtatcctg tgtgttcttg ttatcctctc gctattcctt 420
acaacattct agccgcaata acaaattgta aagcttgagg tgtcttttga tgatcttaac 480
tcccatttac ttgcgtagca ctcatgactg ttttcctggc ggcaacctga ttgccttctg 540
ttttatgtat ctgccacgtg cggctgaaag gggattttta ttttttttct tctttgtttc 600
tttttcatta atcttgcgct tgttcttcag ctactacata ttattctatc tatttttttc 660
ttatttcttt ttttttttat tctttgtttt ttttctatat tatattttat gtctcttact 720
gtcattatc 729
<210>6
<211>343
<212>DNA
<213>长梗黄精(Polygonatum filipes Merr)
<400>6
cggaaaacaa tgtagcagag tctcacctac tgagttgtcg acatgggttg ttccttattg 60
ataggctcat atacataact atcgtatgga agcctccctg tcgatatgta agagagactc 120
aaattcgagg gcttgtttta ggacccaatt ttaatggtta taaaaggatg ttttgtaatc 180
ttagttagta tgcatttttt tagagcaatc aattagagag agagagagag agagagagag 240
agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agattatggc ctttgtaagg 300
attgtgagag actaggttgt cttggtgtga gcaaagtaag tga 343
<210>7
<211>247
<212>DNA
<213>长梗黄精(Polygonatum filipes Merr)
<400>7
caccagacgt tttccctttc tcttcttctt ttgtcgccag acctccttgt cgccagaaca 60
ccccgagtct ccgcgtcgcc agacattagc tctctctctc tctctctctc tctctctctc 120
tctctctctc tctctccttt tcttctgccg tcgctagacg aggaaaactg agcctctaag 180
gcttggttat ttcttttgtg tagaagctgt tgagctgggc ttttaatatt ctagttgggc 240
tcttatt 247
<210>8
<211>403
<212>DNA
<213>长梗黄精(Polygonatum filipes Merr)
<400>8
cgagactcag ggagatataa tggtgctcga gcgtagcacg tggcagagtg ttgccgggca 60
gtacggaggt tagtgtggag gggttggtaa ccgtcgaggt tgatggatca ttgtcgatgt 120
tgtttctgag gagcttgagc cacgggtgag ctagcagcgg tcgaagccat caacaggggg 180
tcgtggggct ggctgctcgt gacttttcaa agaaagaagc tttgatcgtt agtggaggca 240
gagggtgctc gagctggggt tgcagggaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga 300
gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagcaaca gctaggattg agcatggaga 360
caggctaggg ttagggttag gttttgaata aattgagaga gaa 403
<210>9
<211>297
<212>DNA
<213>长梗黄精(Polygonatum filipes Merr)
<400>9
ccaggcacca ccctggggct tcgacgacag tcgatggtcg atgatgatga gaccataggc 60
gactcatctt cagtcgttga tgatcgagag agagagagag agagagagag agagagagag 120
agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agatccattg tcggtgacat 180
cgtagtcgtc gaggaatgag gctggaagag agatttattc gatgtcatcg tcattgtcaa 240
ggatcgaggc tggacgagag aggtcaattc aatgtcgatg tcgtcatcat cattgag 297
<210>10
<211>298
<212>DNA
<213>长梗黄精(Polygonatum filipes Merr)
<400>10
cttgaggtcg ttgccgctgc cgccttgcgg agggtccgga ggcagaccgg gaggaggatg 60
ccgtggcggc attggggtcg acggtgagca ggggtttgat ctgagagaga ggcatagggg 120
gaatttgaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga 180
gagagagaga gagagaacaa gagctcataa atgagcaaat aatgggttat ataccctagg 240
tcaatctttg gagtaatcta ggccgtccat accaattccc aacgaatcct agccttag 298
<210>11
<211>319
<212>DNA
<213>长梗黄精(Polygonatum filipes Merr)
<400>11
aaggggctgc tgctagggta tggcgacata agagggtttg gcgatgctga gagagagaga 60
gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga agtatctggc gtcggtgact 120
cgaaggtcga gtcaggcaac ggggagtatg gcgacaagcg gggggttcaa atgggtgtct 180
ggcaatccag tgacaggcga gtagctaggt caggcaacga gattcgagtg ggtacggcga 240
tgcaagggtt gagcttggag gcggggtctg gcgacgctga tccttgggtc cggcgacgat 300
ggatatgatg ttgtttggc 319
Claims (1)
1.用于长梗黄精微卫星标记的引物，其特征在于：所述的引物序列为：
F：5’-GAT TAG GTG CCG AGA TGA-3’
R：5’-CGC ATG TCT GTC TAT CCC-3’。
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2009
- 2009-09-21 CN CN2009101450438A patent/CN101654708B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
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|---|
| 周晔等.RAPD标记法鉴定中药黄精及长梗黄精的研究.《时珍国医国药》.2007,第18卷(第09期), * |
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