CN113215190B

CN113215190B - CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术制备柑橘纯合突变体的方法

Info

Publication number: CN113215190B
Application number: CN202110617137.1A
Authority: CN
Inventors: 彭爱红; 邹修平; 何永睿; 陈善春; 许兰珍; 雷天刚
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2021-06-03
Filing date: 2021-06-03
Publication date: 2022-09-27
Anticipated expiration: 2041-06-03
Also published as: CN113215190A

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种基于CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术获得柑橘纯合突变体的方法。所述方法包括以下步骤：将柑橘上胚轴茎段与农杆菌共培养，随即对上胚轴茎段进行热处理，然后将上胚轴茎段转入添加1 mg/L BA、0.5 mg/L IAA和40 mg/L Km的MS培养基中进行诱导。该方法能够提高纯合突变体的基因编辑效率。

Description

CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术制备柑橘纯合突变体的方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种基于CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术制备柑橘纯合突变体的方法。

背景技术

柑橘又名柑桔，为芸香科柑橘属植物，包含了柑、桔、橙、柚、柠檬等多个品种。柑橘果实营养丰富，含有黄酮类、柠檬苦素类、生物碱类、香豆素及维生素等多种活性成分，具有抗癌、预防心血管疾病等功效(“柑橘属中生物碱的研究进展”，赵雪梅等，中国药房，2008年第19卷第9期，第703页第1段第1-3行，公开日2008年5月29日；“芸香科柑桔数黄酮类成分质量研究”，史锐等，中华中医药学刊，2012年第30卷第6期，第585页左栏第1段第1-3行，公开日2012年6月30日)。

然而，我国在柑橘品种选育方面仍然面临巨大挑战。现阶段，普遍采用有性杂交、芽变选种、实生选种、诱变育种等方法进行优良品种选育。但是，这些方法需要时间较长。而基因工程能够特异地改造基因组。目前，人们采用CRISPR/Cas9系统进行柑橘育种研究(“柑橘原生质体瞬时转化体系优化及利用CRISPR/Cas9技术定点突变山金柑基因”，郭文武，华中农业大学硕士学位论文，第1页第2段第2-11行，2018年，公开日2018年9月18日)。然而，利用CRISPR/Cas9获得柑橘纯合突变体的效率较低。如Peng等(2017)和Jia等(2020) 分别从32个和8个含有CRISPR/Cas9系统的转基因植株中获得了1个纯合突变体，纯合突变体的基因编辑效率仅分别为3.1％(“Engineering canker-resistant plants through CRISPR/Cas9-targeted editing of the susceptibility gene CsLOB1 promoter in citrus”，Peng Aihong等，Plant Biotechnology Journal，第4页第2段第8行，2017年，公开日2017年3 月29日)和12.5％(“Generation of homozygous canker-resistant citrus in the T0generation using CRISPR-SpCas9p”，Jia Hongge等，Plant Biotechnology Journal，第2页第1段第3-4行，2020 年，公开日2020年3月13日)。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种制备柑橘纯合突变体的方法，以提高纯合突变体的基因编辑效率。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

制备柑橘纯合突变体的方法，包括以下步骤：

将柑橘上胚轴茎段与农杆菌共培养，随即对上胚轴茎段进行热处理，然后将上胚轴茎段转入添加1mg/L BA(苄氨基腺嘌呤)、0.5mg/L IAA(吲哚乙酸)和40mg/L Km(卡那霉素)的MS培养基中进行诱导。

本发明中，所述共培养为将上胚轴茎段置于含有p35SCas9/CsLOB1sgRNA质粒的农杆菌菌液中进行侵染；

然后将上胚轴茎段置于添加1mg/L 2-ip(异戊烯腺嘌呤)、0.5mg/L IAA(吲哚乙酸)、1 mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)和100μM AS(乙酰丁香酮)的MS固体培养基上进行共培养。

进一步，所述共培养是指于26℃的黑暗环境下培养60h。

进一步，所述热处理所采用的培养基为添加2mg/L BA(苄氨基腺嘌呤)、70mg/L Km(卡那霉素)和500mg/L Cef(头孢霉素)的MS培养基。

进一步，所述热处理是指先在37℃的黑暗环境下培养1d，接着在26℃的黑暗环境下培养1d；如此循环5次。

进一步，所述诱导是指将上胚轴茎段置于添加1mg/L BA、0.5mg/L IAA和40mg/LKm 的MS培养基上，并在16h的光周期、温度为28℃条件下诱导至上胚轴茎段两端的伤口上生出不定芽。

本发明的有益效果在于：

本发明能够提高纯合突变体的基因编辑效率，采用本发明的方法制备纯合突变体，纯合突变体的基因编辑效率为26.4％。

附图说明

图1为实施例1制得的p35SCas9/CsLOB1sgRNA载体的结构示意图，其中，35S代表CaMV35S启动子；AtU6代表AtU6-1启动子；

图2为纯合突变体的基因编辑分析过程。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

(1)p35SCas9/CsLOB1sgRNA载体的构建

以柑橘晚锦橙基因组中的CsLOB1(Cs7g27640)为靶标基因，利用CRISPR-P 2.0(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)软件在CsLOB1基因的外显子上设计20个核苷酸的sgRNA序列5′-TCCTGTTTACGGCTGCGCCG-3′；在sgRNA序列5′端添加GATTG序列，获得5′-GATTGTCCTGTTTACGGCTGCGCCG-3′序列；在sgRNA反向互补序列的5′端添加AAAC 序列，3′端添加单碱基C，获得5′-AAACCGGCGCAGCCGTAAACAGGAC-3′序列；

上述序列由北京六合华大基因科技有限公司合成，序列合成后将其溶解成10μM的浓度，并将2个序列退火形成双链DNA；退火程序为：65℃变性30min，然后在室温和避光的条件下缓慢退火2h，-20℃备用。

用BbsI酶切pUC119-gRNA质粒。酶切反应体系为：BbsI 1μL，Buffer 2μL，pUC119-gRNA 质粒10μL，ddH₂O 7μL。上述反应液在37℃的条件下放置20min。酶切产物用凝胶回收试剂盒回收。

用T4-DNA连接酶将退火后的双链DNA载入酶切后的pUC119-gRNA质粒中，形成pUC119-CsLOB1sgRNA载体。连接反应体系如下：2×Buffer 5μL，酶切后的pUC119-gRNA 质粒1μL，双链DNA 3μL，T4 DNA连接酶1μL。在16℃条件下连接2h。连接产物转入大肠杆菌DH5α中。

用BamHI/SalI双酶切pUC119-CsLOB1sgRNA质粒。酶切反应体系为：BamHI 1μL，SalI 1 μL，Buffer 2μL，pUC119-CsLOB1sgRNA质粒10μL，ddH₂O 6μL。上述反应液在37℃的条件下放置20min。酶切产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，sgRNA片段用凝胶回收试剂盒进行回收。

用BamHI/SalI双酶切pCas9-GN质粒(该pCas9-GN质粒的制备方法具体参见“Engineering canker-resistant plants through CRISPR/Cas9-targeted editing ofthe susceptibility gene CsLOB1 promoter in citrus”，Peng Aihong等，PlantBiotechnology Journal，第9页第6段第1行，2017年，公开日2017年3月29日)，酶切反应体系和反应条件同上，酶切产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，用凝胶回收试剂盒回收线性化的pCas9-GN质粒；

用T4-DNA连接酶将回收的sgRNA片段插入线性化的pCas9-GN质粒中。连接反应体系如下：2×Buffer 5μL，pCas9-GN质粒1μL，sgRNA片段3μL，T4 DNA连接酶1μL。在16℃条件下连接2h。连接产物转入大肠杆菌DH5α中，获得p35SCas9/CsLOB1sgRNA载体(如图1 所示，由图1可知，sgRNA由AtU6-1启动子驱动，而Cas9基因由CaMV35S启动子驱动)。提取p35SCas9/CsLOB1sgRNA质粒，用BamHI/SalI进行双酶切验证，反应体系和条件同上。酶切产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，如果出现预期的sgRNA和pCas9-GN片段，则该 p35SCas9/CsLOB1sgRNA质粒是正确的。

提取正确的p35SCas9/CsLOB1sgRNA质粒，利用冻融法将p35SCas9/CsLOB1sgRNA质粒转入农杆菌菌株EHA105中。方法如下：取-80℃保存的农杆菌菌株EHA105置于冰水混合物中融化；将1μL的p35SCas9/CsLOB1sgRNA质粒加入50μL的农杆菌菌液中，用手轻轻拨打管底混匀；将上述农杆菌与质粒的混合物依次置于冰上5min，液氮中5min，37℃水浴5min，冰浴5min；加入700μL LB液体培养基于上述混合物中，在28℃、220r/min的条件下培养2h；将上述混合物在6000r/min的转速下离心1min，倒掉部分上清液，留取100μL，用手轻轻拨打管底混匀，均匀涂布于添加50mg/L Km的LB固体平板上，在28℃的培养箱中暗培养2d。挑选单菌落置于添加50mg/L Km的LB液体培养基中，在28℃、220r/min的条件下培养过夜。对菌液进行Cas9基因的PCR检测，上游引物序列为5′-AGAAGGACCTCATCATCAAGC-3′，下游引物序列为5′-GATGAGAGTAGCGTCGAGAACC-3′。PCR反应体系为10μL 2×Taq PCR MasterMix、1μL菌液、10μM的上、下游引物各0.5μL、灭菌的ddH₂O 8μL；PCR反应程序为94℃变性5min，95℃变性30s、60℃退火45s、72℃延伸30s，共30个循环，72℃延伸10min。 PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR扩增产物在500bp处出现特异性条带的菌液确定为正确的，正确的菌液保存于-80℃冰箱中。

(2)上胚轴茎段的准备

选取成熟的晚锦橙果实，清水洗净，用酒精表面消毒后，在无菌的超净工作台上取出种子，剥去内外种皮，接种在已消毒的添加8g/L的琼脂，30g/L的蔗糖，且pH为5.8的MS固体培养基上，于28℃暗环境中培养2周，然后转入16h的光周期下培养1周，获得柑橘实生苗；

将实生苗的上胚轴在无菌的条件下横切成1cm左右的茎段。

(3)工程菌液的制备

将含有p35SCas9/CsLOB1sgRNA质粒的农杆菌菌株EHA105涂布于添加50mg/L Km的LB固体平板上，在28℃的黑暗环境下培养2d；挑选单菌落，接种于含有50mg/L Km的LB液体培养基中，于28℃的黑暗环境下220r/min振荡培养至OD₆₀₀为0.8-1.0；

将培养后的菌液用含有50mg/L Km的LB液体培养基稀释至OD₆₀₀为0.1，继续振荡培养至 OD₆₀₀为0.5；将菌液在28℃且5000r/min的条件下离心10min；去除上清液，用添加30g/L蔗糖且pH为5.4的MS液体培养基重新悬浮农杆菌。

(4)上胚轴茎段的感染。

将步骤(3)重新悬浮的农杆菌液倒入放置上胚轴茎段的培养皿中，使所有的茎段均浸入农杆菌菌液中，浸染15min；然后将上胚轴茎段用镊子夹入含有滤纸的培养皿中；用滤纸吸干上胚轴茎段表面多余的农杆菌菌液。

(5)共培养

将经感染处理的上胚轴茎段放在添加1mg/L 2-ip、0.5mg/L IAA、1mg/L 2,4-D和100μM AS的MS固体培养基上；在26℃的黑暗环境下共培养60h。

(6)热处理

将共培养后的上胚轴茎段转入添加2mg/L BA、70mg/L Km和500mg/L Cef的MS固体培养基中，在37℃的黑暗环境中培养1d，接着在26℃的黑暗环境中培养1d，如此循环5次，共10d。

(7)不定芽的诱导

热处理结束后，将上胚轴茎段转入添加1mg/L BA、0.5mg/L IAA、40mg/L Km和500mg/L Cef的MS固体培养基中；在光照16h/暗环境8h的光周期、28℃条件下培养至上胚轴茎段两端的伤口上诱导出不定芽。

实施例2

不定芽的GUS组织化学染色

对上胚轴茎段两端伤口上萌发的不定芽利用GUS染液(含有如下成分：100mMNaH₂PO₄， 100mM Na₂HPO₄，0.5mM K₄[Fe(CN)₆]，0.5mM K₃[Fe(CN)₆]，10mM EDTA-Na₂，1mM X-gluc，0.1％Sodium azide，0.1％Triton-100)进行GUS组织化学染色。

染色结果显示，GUS染色呈蓝色，即为GUS阳性芽。

实施例3

GUS阳性芽微嫁接和田间二次嫁接

待GUS阳性芽的茎长约0.5cm时，水平切下，微嫁接在枳橙砧木上；

待嫁接口充分愈合后，从枳橙砧木的基部水平切下GUS阳性芽，按照田间切接的方法将其嫁接在田间枳橙砧木上，用塑料袋保湿2周，待其成活后去除塑料袋。

实施例4

GUS阳性植株的分子生物学鉴定

提取实施例3的GUS阳性植株的DNA，利用实施例1中Cas9基因的扩增引物、PCR反应体系和反应程序对Cas9基因进行PCR检测。扩增出相应目的条带的，即可确定为转基因柑橘。

转基因柑橘的基因编辑分析

在靶标位点上游215bp处设计上游引物5′-CGCCTCCCATCTTCTCAAGA-3′，在靶标位点下游203bp处设计下游引物5′-GCTGATCCAATACCATTGTC-3′，上、下游引物均由北京六合华大基因科技有限公司合成；

提取转基因柑橘和野生型植株的DNA，利用设计的上、下游引物用高保真酶分别对转基因柑橘和野生型植株的DNA进行PCR扩增；PCR反应体系为25μL 2×PrimeSTARMaxPremix、 3μL DNA、10μM的上、下游引物各1.0μL、灭菌的ddH₂O 20μL；PCR反应程序为94℃变性 5min，95℃变性30s、60℃退火45s、72℃延伸30s，共32个循环，72℃延伸10min。

扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，利用凝胶回收试剂盒回收，回收产物载入pGEM-T载体中；

挑选150个单菌落分别放入添加50mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，在28℃、220 r/min的条件下培养过夜；

利用上述设计的上、下游引物对菌液进行PCR扩增。PCR反应体系为10μL 2×TaqPCR MasterMix、1μL菌液、10μM的上、下游引物各0.5μL、灭菌的ddH₂O 8μL；PCR反应程序为94℃变性5min，95℃变性30s、60℃退火45s、72℃延伸30s，共30个循环，72℃延伸10min。PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。随机挑选能扩增出相应目的条带的100个菌液送北京六合华大基因科技有限公司进行测序；

将转基因柑橘的测序结果与野生型柑橘的测序结果进行比对，比对结果有差异的确定为发生了基因编辑的转基因柑橘；统计发生了基因编辑的转基因柑橘靶标位点核苷酸突变的类型，初步确定转基因柑橘是嵌合突变、双等位基因突变或纯合突变。

对初步确定为纯合突变的转基因柑橘，在靶标位点上游125bp处设计单引物 5′-CAGTCATCCATATTTGCACAC-3′，利用单引物对上述转基因柑橘和野生型植株的PCR回收产物分别进行测序；

将转基因柑橘的测序结果与野生型植株的测序结果进行比对，若测序结果为纯合峰且与野生型对照存在差异，则编辑位点发生了纯合突变，相对应的转基因柑橘为纯合突变体(如图2所示)。

纯合突变体的基因编辑效率按照公式

进行计算，重复3次，以3次试验的平均值作为检测结果；

第一次试验从17个转基因植株中获得4个纯合突变体，纯合突变体的基因编辑效率为 23.5％；

第二次试验从13个转基因植株中获得4个纯合突变体，纯合突变体的基因编辑效率为 30.8％；

第三次试验从20个转基因植株中获得5个纯合突变体，纯合突变体的基因编辑效率为 25.0％。故纯合突变体的基因编辑效率＝(23.5％+30.8％+25.0％)/3＝26.4％。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

<110> 基于CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术制备柑橘纯合突变体的方法

<120> 西南大学

<160>6

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 双链DNA

<400>1

gattgtcctg tttacgctg cgccg 25

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 双链DNA

<400>2

aaaccggcgc agccgtaaac aggac 25

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>阳性植株上游扩增序列

<400>3

agaaggacct catcatcaag c 21

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>阳性植株下游扩增序列

<400>3

gatgagagta gcgtcgagaa cc 22

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>靶标位点上游215 bp处上游扩增引物

<400>5

cgcctcccat cttctcaaga 20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>靶标位点上游215 bp处下游扩增引物

<400>6

gctgatccaa taccattgtc 20

Claims

1.一种基于CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术制备柑橘纯合突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将柑橘上胚轴茎段与含有p35SCas9/CsLOB1sgRNA质粒的农杆菌共培养，随即对上胚轴茎段进行热处理，然后将上胚轴茎段转入添加1 mg/L BA、0 .5 mg/L IAA和40 mg/L Km的MS培养基中进行诱导；所述热处理是指先在37℃的黑暗环境下培养1 d，接着在26℃的黑暗环境下培养1 d；如此循环5次；所述CsLOB1sgRNA序列为5′-TCCTGTTTACGGCTGCGCCG-3′。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述共培养是指于26℃的黑暗环境下培养60 h。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述热处理所采用的培养基为添加2mg/L BA、70 mg/L Km和500 mg/LCef的MS培养基。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述诱导是指将上胚轴茎段置于添加1mg/L BA、0 .5 mg/L IAA和40 mg/L Km的MS培养基上，并在16 h的光周期、温度为28℃条件下诱导至上胚轴茎段两端的伤口上生出不定芽。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述诱导是指将上胚轴茎段置于添加1mg/L BA、0 .5 mg/L IAA和40 mg/L Km的MS培养基上，并在16 h的光周期、温度为28℃条件下诱导至上胚轴茎段两端的伤口上生出不定芽。