CN118086298A - 扁蓿豆u6启动子及其应用 - Google Patents

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任卫波
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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体公开了4个来源于土默特扁蓿豆的包括snRNA基因及其上游约1100bp的DNA序列，分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。各截取snRNA基因上游约500bp左右序列，得到如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示的序列。这些启动子序列具启动子活性，可用于启动基因的表达等用途。

Description

扁蓿豆U6启动子及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体公开了来源于扁蓿豆的U6启动子及其应用。
背景技术
基因编辑是对生物基因组进行靶向修饰的一项新型生物技术，可以在不同物种中实现对目标基因的定点敲除、定点插入以及基因片段置换等基因定向编辑。目前基因编辑技术已在植物基因功能解析和作物遗传改良研究中得到广泛应用。常用的基因编辑技术主要有锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases,ZFNs)，TALEN核酸酶(Transcriptionactivator like effector nucleases,TALENs)，CRISPR/Cas(规律成簇间隔短回文重复序列clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associatedprotein)等。1996年，Kim等首先报道了将锌指蛋白连接到FokⅠ的DNA切割结构域可以产生1个新型的有活性的位点识别特异性锌指核酸酶，并且该人工改造的新型锌指核酸酶可以特异性地切割DNA序列，标志着ZFN基因编辑技术的出现。2009年后，ZFNs技术的不断发展，已成功在烟草、玉米、拟南芥、大豆等植物中实现了基因的定点修饰，然而ZFNs载体的构建的过程较为繁琐，耗时耗力，还会对基因组产生非特异性识别和切割，这些不利因素都制约了它在基因编辑上的广泛应用。随后出现的第二代人工改造核酸酶技术TALEN构成与ZFN相似，由TAL效应因子(Transcription activator-like effector)的DNA结合域与核酸酶FokⅠ的DNA切割结构域两部分组成。TALENs能够识别较长的DNA序列从而提高特异性来精确靶点。B.Yang等人在2012年首先利用TALENs技术成功地将水稻感病基因Os11N3启动子序列进行定点切割，增强了水稻的抗病能力。随TALENs技术相继在烟草、拟南芥、大麦等植物上成功实现靶向编辑。虽然TALEN技术在目标位点灵活性和较低的脱靶效应方面具有优势，但仍不够简单易用且成本较高。1987年大阪大学的研究人员报道了细菌基因组中存在成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)，随后发现在CRISPR附近区域还存在高度保守的CRISPR相关蛋白Cas，并证明Cas蛋白具有核酸酶活性，可以对DNA序列进行特异性切割。2012年Jinek等将tracrRNA和crRNA表达为一条嵌合的向导RNA(Single guide RNA，sgRNA)，并在体外证明sgRNA可以发挥tracrRNA和crRNA的功能。改造后的CRISPR/Cas9系统由剪切双链DNA断裂的Cas9蛋白和结合靶位点的单链向导RNA(single guide RNA,sgRNA)所组成。Cas9在sgRNA的指引下对基因组的PAM基序(Protospacer adjacent motifs)上游进行定点切割。通常PAM位点由3个保守的核苷酸NGG(N可以为任何氨基酸)组成。由于CRISPR的sgRNA识别序列一般仅需20个核苷酸左右，且Cas9蛋白不需要形成蛋白二聚体起作用，因此CRISPR/Cas9系统与ZFN、TALEN等技术相比具有构建简单、成本较低、编辑高效等优点。目前该系统已成功应用于植物中的拟南芥、棉花、玉米、水稻、烟草、甜橙、高粱、小麦、大豆等及成功应用于动物中的斑马鱼、果蝇、小鼠、人类细胞等。
作为CRISPR/Cas9基因编辑体系中的重要元件，Cas9蛋白和sgRNA的精确和高效转录影响着该体系的特异性和编辑效率，二者的高效精确转录依赖于合适的启动子。Cas9蛋白常用组成型启动子驱动其转录，主要有CaMV 35S启动子、CaMV 2×35S启动子和Ubi启动子，少数研究者还使用Actin1启动子来驱动Cas9蛋白的转录。sgRNA的序列上存在与靶点互补配对的序列，它的精确转录对提高CRISPR/Cas9基因编辑体系的编辑效率和降低脱靶效率具有重要的作用。使用U3动子驱动sgRNA的转录常用于单子叶植物，而使用U6启动子驱动sgRNA的转录则常用于双子叶植物中，也有部分研究者使用CaMV 35S启动子来驱动sgRNA的转录。无论使用上述何种启动子驱动Cas9蛋白和sgRNA的转录，均有成功靶向基因的研究，但是不同的启动子在驱动sgRNA转录时，编辑的效率通常也不同。
U6启动子驱动转录的U6snRNA是一种非编码小RNA，序列保守约为100nt，被RNA聚合酶Ⅲ所识别和转录，可以用来产生大量的人工RNA，参与mRNA前体的变异剪切和成熟。U6启动子具有高效的转录性和明确的转录起始位点G，可以精确转录sgRNA，减少sgRNA表达时对其他序列转录的影响，增强sgRNA中与靶位点序列配对的准确性，从而减少脱靶效应的产生。因此，U6启动子成为双子叶植物的CRISPR/Cas9系统中常用的理想启动子。而具备转录活性的U6启动子，需同时具有2个保守的核心区序列元件，即-30bp位点处的TATA-like box和-60bp处的上游序列元件(upsteam sequence element,USE)。其中TATA Box是RNA聚合酶Ⅲ识别和结合以及驱动转录的关键元件，而USE作为另一个核心区元件常调控U6启动子的转录活性。雷建峰等利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术体系构建了以拟南芥AtU6启动子驱动抗旱负调控基因GGB编辑sgRNA的基因编辑表达载体，并将构建的载体通过农杆菌介导法转化到野生型拟南芥，获得了GGB基因敲除突变体，T1代的突变效率高达84.8％。Hyun等构建了由拟南芥AtU6启动子驱动sgRNA转录，靶向修饰拟南芥FT基因和SPBPlike-4基因的Cas9/sgRNA编辑载体，并在转基因后代中检测到靶位点存在突变，在T1植物的分析组织中，约90％的独立染色体DNA片段携带突变。Thomas等克隆了大豆GmU6启动子，成功构建了靶向敲除绿色荧光蛋白基因GFP的CRISPR/Cas9基因编辑载体，结果检测到了95％的靶向DNA突变。Jiang等在水稻中用克隆的水稻OsU6启动子驱动sgRNA的转录构建了表达载体，并成功转入水稻原生质体中，定点编辑了OsSWEET14和OsSWEET11两个基因。U6启动子通常具有物种特异性，亲缘关系较远的物种之间并不通用，植物自身内源U6启动子具有更高的转录活性。如在棉花中，使用棉花GbU6启动子的CRISPR/Cas9体系的编辑效率比使用拟南芥AtU6启动子时高4-6倍。在大豆中，使用大豆GmU6启动子的基因编辑载体的突变率比使用拟南芥AtU6启动子的载体高10％。除了在拟南芥、水稻、大豆、棉花上的应用，目前还在小麦、玉米、番茄等多种植物中利用植物自身的U6启动子建立CRISPR/Cas9基因组编辑系统，实现目的基因的高效编辑。
扁蓿豆，又名花苜蓿，为豆科苜蓿属多年生草本植物，其多分布于我国西北、内蒙古、华北寒旱地区。扁蓿豆多分枝，叶量丰富，富含蛋白质，多种维生素和矿物质，营养价值较高，是一种优质牧草。虽然相比较紫花苜蓿，其植株矮小，产量偏低，但是其具有较强的抗寒、抗旱、耐贫瘠、耐风沙等环境适应性。因此扁蓿豆不仅可作为饲喂动物的优质牧草具有经济价值，也是用于草原生态修复的重要遗传资源而具有重要的生态价值。此外，它是人工草场建设和自然草场改良的理想材料，在牧草抗性育种上提供了较好的原始材料和优良的基因资源并且对防治水土流失、生态修复有重要意义。除了传统杂交育种方法，改良扁蓿豆的品质也可采用分子育种，基因编辑技术的效率与U6启动子息息相关，然而关于扁蓿豆U6启动子的研究尚未见报道，严重制约了扁蓿豆基因编辑技术的开展。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的在于提供5个扁蓿豆U6启动子，并进一步公开其克隆方法和应用，本发明的另一目的在于提供扁蓿豆U6启动子基因在转基因技术领域中的应用。本发明通过PCR及农杆菌侵染烟草叶片瞬时转化的方法克隆并筛选高转录活性的扁蓿豆U6启动子，对于构建扁蓿豆CRISPR/Cas9基因编辑系统，实现扁蓿豆的分子育种具有重要意义。
本发明挖掘到5个扁蓿豆U6启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。分别来源于扁蓿豆第1条染色体、第3条染色体、第3条染色体、第4条染色体、第7条染色体。其中，SEQ ID NO：1的1 -1020bp为启动子区域，1021-1127bp为snRNA基因，1128-1167bp为snRNA基因下游DNA序列；SEQ ID NO 2的1-1075bp为启动子区域，1076-1180bp为snRNA基因，1181-1226bp为snRNA基因下游DNA序列；SEQ ID NO：3的1-1044bp为启动子区域，1045-1151bp为snRNA基因，1152-1203bp为snRNA基因下游DNA序列；SEQ ID NO：4的1-1032bp为启动子区域，1033-1138bp为snRNA基因，1139-1166bp为snRNA基因下游DNA序列；SEQ ID NO：5的1-1036bp为启动子区域，1037-1145bp为snRNA基因，1146-1189bp为snRNA基因下游DNA序列。
经过验证，其中4个扁蓿豆U6启动子具有启动子活性，因此本发明提供一种扁蓿豆U6启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第1至1020bp所示、SEQ ID NO.3的第1至1044bp所示、SEQ ID NO.4的第1至1032bp所示、SEQ ID NO.5的第1至1036bp所示的任意之一；
或对其进行截短但仍然具有启动子活性的核苷酸序列，其中截短后的启动子的核苷酸序列分别含有SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10任一所示的核苷酸序列。
本发明提供所述的扁蓿豆U6启动子在目的基因的表达中的应用。
具体地，其是在扁蓿豆基因编辑中的应用。优选地，应用于扁蓿豆CRISPR/Cas9编辑系统，用于驱动sgRNA的表达。
本发明进一步提供一种基因表达的载体，其含有所述的扁蓿豆U6启动子。
具体地，所述载体的出发载体是pGreenⅡ-0800。
另外地，其是一种基因编辑载体。
本发明要应提供一种表达盒，其含有所述的扁蓿豆U6启动子及与其可操作连接的目的基因。
进而提供所述的载体或表达盒在扁蓿豆基因编辑中的应用。其应用于扁蓿豆CRISPR/Cas9编辑系统，用于驱动sgRNA的表达。
本发明首次克隆得到5个包含snRNA基因及其上游约1100bp扁蓿豆U6启动子约1200bp的DNA片段。构建了5个MrU6-pGreenⅡ-0800-LUC融合表达载体，分别命名为pMrU6-1P-LUC、pMrU6-2P-LUC、pMrU6-3P-LUC、pMrU6-4P-LUC、pMrU6-5P-LUC。在5个启动子中，有4个启动子具有转录活性，其中MrU6-3P转录活性最高，适用于扁蓿豆CRISPR/Cas9编辑系统，可用于启动sgRNA引导序列的表达。
本发明以扁蓿豆基因组DNA为模板，克隆并筛选出具有较高转录活性的扁蓿豆U6启动子。采用PCR方法，从扁蓿豆基因组中克隆到5个包含MrU6启动子和snRNA基因的DNA片段，长度分别为1167bp、1226bp、1203bp、1166bp、1189bp，PlantCARE分析发现5个启动子中均含有TATA框以及USE框等典型的启动子顺式元件，并经验证其中4条具有启动子活性。本发明初步筛选出转录活性的扁蓿豆U6启动子，为扁蓿豆CRISPR/Cas9基因组编辑技术的建立奠定了基础。
附图说明
图1：5个扁蓿豆启动子及snRNA基因的PCR扩增。其中，M:2K DNA Marker；1-5：分别5个启动子及snRNA基因的扩增片段
图2：扁蓿豆U6基因与拟南芥U6基因的盒式位置比对
图3：5个扁蓿豆启动子的PCR扩增。其中，M:2K DNA Marker；1-5：分别5个启动子扩增片段
图4：扁蓿豆不同MrU6启动子驱动LUC的融合表达载体构建示意图。
图5：不同MrU6融合表达载体的酶切鉴定。
图6：不同MrU6启动子在烟草原生质体中瞬时表达的荧光素酶活性。
图7：不同MrU6启动子在烟草叶片中瞬时表达的荧光信号图片。其中，A：阳性对照pGreenⅡ-0800-LUC-CaMV35S；B：pMrU6-1P；C：pMrU6-2P；D：pMrU6-3P；E：pMrU6-4P；F：pMrU6-5P；G：阴性对照pGreenⅡ-0800-LUC。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例：扁蓿豆U6启动子的研究
1.材料与方法
1.1试验材料
扁蓿豆为土默特扁蓿豆，种子为中国农业科学院草原研究所王照兰研究员惠赠、本氏烟草种子为中国科学院遗传发育所陈凡研究员惠赠，扁蓿豆和本氏烟草均培于内蒙古农业大学生命科学学院植物功能研究实验室。
试验所用pGreenⅡ-0800-LUC载体由中国科学遗传与发育生物学研宄所惠赠；植物基因组DNA提取试剂盒、通用型DNA纯化回收试剂盒和质粒小提试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)；pMDTM19-T Vector Cloning Kit、T4 DNA连接酶、限制性内切酶SalⅠ和BamHⅠ(宝日医生物技术(北京)有限公司)；DNA分子量MakerDL2000(天根生化科技(北京)有限公司)；E.coli DH5αCompetent Cells(宝日医生物技术(北京)有限公司)；GV3101感受态细胞(北京华越洋生物科技有限公司)；引物由华大基因生物技术有限公司负责合成。
1.2方法
1.2.1扁蓿豆U6启动子的克隆
取约100mg扁蓿豆叶片和茎组织，在液氮中研磨成粉末状，采用植物基因组DNA提取试剂盒提取扁蓿豆基因组DNA，用p300超微量分光光度计检测其浓度和纯度，并用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA。使用拟南芥U6 snRNA基因与扁蓿豆基因组数据进行比对，获得98％以上同源性的扁蓿豆U6 snRNA的染色体定位，设计包含扁蓿豆U6 snRNA及其上游约1100bp的DNA扩增引物，共5对(如表1)。PCR扩增反应体系为ddH2O 36μL、10×TransTaq@HiFi Buffer I 5μL、2.5mM dNTPs 4μL、TransTaq@HiFi DNA Polymerase 1μL、DNA模板2μL、上下游引物各1μL，共50μL体系。PCR扩增反应条件为：94℃5min；94℃30s，59℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃保存。
用1％琼脂糖凝胶电泳检测扁蓿豆U6启动子扩增片段检测，采用PCR产物纯化回收获得目的DNA片段，这些扩增片段分别命名为MrU6-1P1、MrU6-2P1、MrU6-3P1、MrU6-4P1、MrU6-5P1(分别见SEQ ID NO：1至5)。将这些片段与pMD19-T载体在16℃连接0.5h，用氯化钙热激转化法将连接产物导入DH5α感受态细胞，经氨苄青霉素抗性、蓝白斑筛选、菌落PCR和测序鉴定。
表1扩增启动子所使用引物序列
引物 上游引物(5’-3’) 下游引物(5’-3’)
MrU6-1P1 ggaagacacaggtgaaggaattgaag actattcgaagatgactggcggc
MrU6-2P1 gcagaaagaagaacctatctgaactcc ttgaagaagattgtgtctaccctgtagt
MrU6-3P1 ggaagaaactcagaaatcgaaaatggc ccggagaaaacttgagagaacgt
MrU6-4P1 cttgaaccaaattatcccctgttggtg tagaattacggtgttggatcaccatgt
MrU6-5P1 ccttaacggagaaaacttacgagtgagaaat aaacatttgtagctatgtcatcttatagacactc
1.2.2启动子顺式作用元件分析
使用在线启动子分析软件PlantCARE，对获得的扁蓿豆U6扩增序列中的启动子顺式作用元件进行分析。
1.2.3融合表达载体的构建
根据获得的扁蓿豆U6扩增片段序列设计带SalⅠ酶切位点的上游引物与带BamHⅠ酶切位点的下游引物，引物见表2，分别扩增snRNA基因上游约500bp的扁蓿豆U6启动子。PCR扩增体系为ddH2O 8μL、Ex Taq酶10μL、质粒模板0.2μL、上下游引物各1μL，共20μL体系。PCR扩增反应条件为：94℃5min；94℃30s，65℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min；16℃保存。用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，分别命名为MrU6-1P、MrU6-2P、MrU6-3P、MrU6-4P、MrU6-5P(分别见SEQ ID NO：6至10)。并用PCR纯化试剂盒对扩增产物进行纯化。用SalⅠ和BamHⅠ对5个扩增片段和pGreenⅡ-0800-LUC进行双酶切，使用凝胶回收目的片段，用T4 DNA连接酶4℃过夜连接，后使用氯化钙热激转化法将连接产物导入DH5α感受态细胞，经卡那霉素抗性、菌落PCR、酶切、测序鉴定，验证正确后，对含有正确的融合表达载体重组菌，加入甘油(甘油占总含量约16％)保存于-80冰箱。
对融合表达载体重组菌活化，于37℃进行过夜震荡培养，用质粒小提试剂盒从重组菌培养液中提取质粒。对质粒进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测和p300超微量分光光度计检测其浓度和纯度。
表2带SalⅠ酶切位点的上游引物与带BamHⅠ酶切位点的下游引物的序列
1.2.4不同启动子在烟草原生质体中的转录活性分析
播种烟草种子若干，25℃12h/12h光照/黑暗培养，培养2-3周即可用于实验。取叶片若干，加入5-10mL酶解液，全部浸泡组织。24℃静置酶解3h。40μm滤网过滤后300rpm离心3min，去上清。加入5-10mL W5溶液重悬，然后置于冰上静置30min，300rpm离心4min，尽量去除全部上清。根据原生质体量加入适量(3-10mL)MMG溶液悬浮(每个样品，用100μL原生质体)，至浓度为2×105个/mL，镜检显示原生质体圆润，破裂较少。取100μL原生质体悬液加10μL质粒(质粒质量：8-10μg)，取与质粒和原生质体体积之和相等的PEG溶液(110μL)，轻柔均匀混合，室温静置10min。用1mL的W5稀释终止反应。300rpm离心3min收集原生质体，去上清。加入1mL W5洗涤1-2次。最后贴壁加入100μL W5溶液，轻揉混匀，转移至六孔细胞培养板(提前加入1mL WI)，23℃暗培养18-24h。离心收集原生质体，加入适量(100μL)的1×CellLysis Buffer，室温静置或振摇裂解5min，吹打并吸取细胞裂解产物至1.5mL离心管中，12000g常温离心2min，取上清用于后续检测。将100μL平衡至室温的Luciferase Substrate加入检测管中，小心吸取20μL细胞裂解上清至检测管中，迅速混匀后立即于荧光检测仪(Luminometer中检测Firefly luciferase报告基因活性。在以上反应液中加入100μL新鲜配制的Renilla底物工作液，迅速混匀后立即于荧光检测仪中检测Renilla luciferase报告基因活性，每个检测做3个重复。在以海肾荧光素酶(REN)为内参的情况下，用萤火虫荧光素酶(LUC)测定得到的值除以海肾荧光素酶(REN)测定得到的值，即实验结果为Luc/Ren。
1.2.5不同启动子在烟草叶片中的转录活性分析
将含质粒的农杆菌GV3101菌株进行鉴定，正确后进行菌体保存，使用前于含50μg/mL卡那霉素和利福平的液体LB培养基中摇至OD600值为0.5—0.7，3000r/min离心10min收集菌体，重悬浮于注射缓冲液中(50mmol/L MES+2mmol/LNa3PO4+5g/L D-葡萄糖+100μmol/L乙酰丁香酮，AS的母液浓度为1mol/L，使用DMSO配制)，重悬2次后确保各菌液OD600的值约为0.5。使用10mL注射器吸取制备好的等量菌液后去掉针头，从背面将菌液注射到烟草叶片中，做好标记，避光培养72h后进行检测，每片叶为一次重复，共3次重复。将瞬时转化的植物材料与100mmol/L荧光素钠盐进行反应，烟草叶片浸泡3-5min。通过激光共聚焦显微镜进行荧光信号图像拍摄。根据荧光信号强弱判断不同启动子的转录活性。
2.结果与分析
2.1扁蓿豆启动子克隆
成功提取浓度和纯度较好的扁蓿豆基因组DNA，并从扁蓿豆基因组DNA中成功扩增出共5个包含snRNA基因及其上游约1100bp启动子的DNA片段(图1)，片段大小均约为1200bp，分别命名为MrU6-1P1、MrU6-2P1、MrU6-3P1、MrU6-4P1、MrU6-5P1。将这些片段分别与pMD19-T连接，用氯化钙热激转化法将连接产物导入DH5α感受态细胞，经氨苄青霉素抗性、蓝白斑筛选、菌落PCR鉴定后选择3个阳性克隆进行序列测定。测序结果显示5个序列均正确。
2.2启动子序列分析
通过序列比对分析，结果显示扁蓿豆U6启动子扩增片段MrU6-1P1、MrU6-2P1、MrU6-3P1、MrU6-4P1、MrU6-5P1中均含有TATA框以及USE框等典型的启动子顺式元件(图2)。同时还会含有其他启动子顺式元件CAAT框、脱落酸反应顺式作用元件ABRE(ACGTG)、防御和应激反应顺式作用元件TC-rich repeats(ATTCTCTAAC)、光反应相关元件G-box(TACGTG)、Box 4(ATTAAT)等(表3～表7)。
表3 MrU6-1P1启动子顺式作用元件分析
表4 MrU6-2P1启动子顺式作用元件分析
表5 MrU6-3P1启动子顺式作用元件分析
表6 MrU6-4P1启动子顺式作用元件分析
表7 MrU6-5P1启动子顺式作用元件分析
2.3融合表达载体的构建
扁蓿豆不同U6启动子驱动LUC基因的融合表达载体示意图如图4所示。根据已获得的扁蓿豆U6序列，设计特异性带SalⅠ酶切位点的上游引物与带BamHⅠ酶切位点的下游引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测显示扩增片段大小与预期基本相符(图3)，分别为503bp、544bp、510bp、509bp、505bp,并将这些片段分别命名为MrU6-1P、MrU6-2P、MrU6-3P、MrU6-4P、MrU6-5P。用SalⅠ和BamHⅠ对5个扩增片段和pGreenⅡ-0800-LUC进行双酶切，凝胶回收目的片段，用T4 DNA连接酶4℃过夜连接，后使用氯化钙热激转化法将连接产物导入DH5α感受态细胞，经卡那霉素抗性、菌落PCR、酶切(图5)和测序鉴定，验证正确，表明融合表达载体构建成功，分别命名为pMrU6-1P-LUC、pMrU6-2P-LUC、pMrU6-3P-LUC、pMrU6-4P-LUC、pMrU6-5P-LUC。
2.4不同启动子转录活性分析
将融合表达载体pMrU6-1P-LUC、pMrU6-2P-LUC、pMrU6-3P-LUC、pMrU6-4P-LUC、pMrU6-5P-LUC、阳性对照pGreenⅡ-0800-LUC-CaMV35S、阴性对照pGreenⅡ-0800-LUC通过PEG介导法转染烟草原生质体，并进行荧光值检测，结果表明克隆的5个MrU6启动子中有4个能驱动报告基因LUC的表达，与阴性对照pGreenⅡ-0800-LUC相比，pMrU6-3P、pMrU6-4P、pMrU6-5P差异极显著且有较高的转录活性；pMrU6-3P的转录活性最强，pMrU6-1P转录活性较弱，pMrU6-2P基本无转录活性(图6)。将融合表达载体pMrU6-1P-LUC、pMrU6-2P-LUC、pMrU6-3P-LUC、pMrU6-4P-LUC、pMrU6-5P-LUC、阳性对照pGreenⅡ-0800-LUC-CaMV35S、阴性对照pGreenⅡ-0800-LUC通过农杆菌介导法转染烟草叶片，并进行荧光信号图像拍摄，发现各烟草叶片均检测到荧光信号，其中pMrU6-3P的荧光信号最强，pMrU6-4P、pMrU6-5P稍次于pMrU6-3P，而pMrU6-1P、pMrU6-2P的荧光信号均较弱(图7)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此作为本发明专利范围的限制。因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。应当指出，在本发明技术领域的技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可做出若干改进，这些改进也应当视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.扁蓿豆U6启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第1至1020bp所示、SEQ ID NO.3的第1至1044bp所示、SEQ ID NO.4的第1至1032bp所示、SEQ ID NO.5的第1至1036bp所示的任意之一；
或对其进行截短但仍然具有启动子活性的核苷酸序列，其中截短后的启动子的核苷酸序列分别含有SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10任一所示的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的扁蓿豆U6启动子在目的基因的表达中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，其是在扁蓿豆基因编辑中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：应用于扁蓿豆CRISPR/Cas9编辑系统，用于驱动sgRNA的表达。
5.一种基因表达的载体，其特征在于：含有如权利要求1所述的扁蓿豆U6启动子。
6.如权利要求5所述的载体，其特征在于，其是一种基因编辑载体。
7.权利要求6所述的载体，其特征在于，所述载体的出发载体是pGreenⅡ-0800。
8.一种表达盒，其特征在于：含有如权利要求1所述的扁蓿豆U6启动子及与其可操作连接的目的基因。
9.权利要求5或6或7所述的载体或如权利要求8所述的表达盒在扁蓿豆基因编辑中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：应用于扁蓿豆CRISPR/Cas9编辑系统，用于驱动sgRNA的表达。
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