CN101988063B

CN101988063B - 石蒜微卫星分子标记

Info

Publication number: CN101988063B
Application number: CN201010536252A
Authority: CN
Inventors: 朱国萍; 宣守芹; 王晖; 郑基阳; 高鹏; 李雪
Original assignee: Anhui Normal University
Current assignee: Anhui Normal University
Priority date: 2010-11-09
Filing date: 2010-11-09
Publication date: 2012-09-19
Anticipated expiration: 2030-11-09
Also published as: CN101988063A

Abstract

本发明公开了石蒜微卫星DNA分子标记，包括石蒜微卫星(CT)n富集文库的构建，微卫星序列阳性克隆的筛选及测序，得到33个含有微卫星DNA的克隆，确定了10个多态性丰富的微卫星分子标记Lyra-1、Lyra-2、Lyra-3、Lyra-4、Lyra-5、Lyra-6、Lyra-7、Lyra-8、Lyra-9、Lyra-10。本发明可用于研究石蒜的遗传多样性保护，石蒜属植物种间和居群间的变异和进化关系及石蒜的品种鉴定；重复性好，是一种可靠有效地分子标记。

Description

石蒜微卫星分子标记

技术领域

本发明涉及分子标记技术，具体涉及一种石蒜微卫星分子遗传标记。

背景技术

微卫星DNA又称作短串连重复(Short Tandem Repeats，STRs)、简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSRs)、简单序列长度多态性(SSLP)。是指基因组中以1～6个核苷酸为单位串联组成的核苷酸序列。.根据重复单元的构成，微卫星DNA序列被分为3种类型：单一型，复合型(compound)和间断型(interrupted)。例如：

单一型：ATATATATATATATATATATATAT

复合型：ATATATCACACACACACACAC

间断型：ATATATCA ATATATCA ATATATA

微卫星DNA作为一种分子标记具有以下特点：广泛分布于真核生物的基因组中，据估计每6kb长度中就有1个微卫星位点；核心序列的重复次数在个体间呈高度变异性，多态性信息容量高：呈共显性，遵循盂德尔法则遗传；选择中性等等。

基于以上特点，微卫星DNA被广泛用于植物遗传图谱的构建、基因定位、品种鉴定和种质保存、数量性状基因的分析、辅助育种、构建指纹图谱、遗传多样性及物种进化与亲缘关系等方面的研究。

石蒜是石蒜科石蒜属为多年生的草本花卉植物。石蒜属植物不仅具有极高的观赏价值，还是一类重要的药用植物。石蒜属植物鳞茎有毒性，性甘温，《闽东本草》载“本品内服可清热、解毒、散结、消肿”。经研究，石蒜属鳞茎含有石蒜碱，石蒜胺碱、石蒜伦碱、加兰他敏、多花水仙碱、伪石蒜碱、类石蒜碱、二氢石蒜碱、雪花莲胺碱、石蒜酊、石蒜醇等十多种生物碱。

石蒜药理作用主要有如下几个方面：(1)作用于心血管系统；(2)作用于神经系统；(3)细胞毒作用；(4)抗癌抗肿瘤作用；(5)抗炎、抗菌抗病毒作用。我国天然药物研究人员从20世纪50年代开始石蒜科生物碱的研究和药物开发。1964年10月，新药氢溴酸加兰他敏通过临床鉴定，现已收入中国药典(二部)中。后来又研发出二氢加兰他敏，主要用于治疗小儿麻痹后遗症和外伤性截瘫等病症，其毒性比加兰他敏小，该药是我国具有创新性的胆碱酯酶抑制剂；1983年，抗肿瘤新药氧化石蒜碱(石蒜碱内铵盐)通过临床鉴定，用于多种肿瘤的治疗而毒副作用较低。石蒜中提出药物——加兰他敏的药效作用已获得了世界神经病学会的认可。2002年该药已获准在美国、加拿大上市，先前已在21个国家，含大多数的欧洲主要市场获得了批准和上市。石蒜鳞茎含有淀粉40％，可加工成浆糊和浆沙，或制成石蒜粉，用于建筑涂料；也可利用石蒜试制酒精，如果工艺成熟后运用到生产中，将在一定程度上减少对粮食的利用；提取的植物胶可代替阿拉伯胶；石蒜碱等毒性较大，将其提取制成高效杀虫、杀菌的低浓度生物农药，可用于防治农作物害虫，且不会产生环境污染。

石蒜的分子标记研究起步很晚，目前报道的只是RAPD分子标记，ISSR分子标记，微卫星标记尚未见报道。但RAPD分子标记稳定性，重复性差，ISSR分子标记通常为显性标记，不能区分纯和基因型和杂合基因型。

发明内容

本发明解决的技术问题：分离克隆石蒜的微卫星DNA分子标记，建立石蒜微卫星DNA技术体系并用这些分子标记研究石蒜遗传多样性保护，石蒜属植物种间和居群间的变异和进化关系以及进行石蒜品种鉴定。

实现上述发明的技术方案：包括石蒜微卫星(CT)_n富集文库的构建；含微卫星序列阳性克隆的筛选及测序，得到33个含有微卫星重复序列的克隆；筛选得到10个多态性高的微卫星分子标记Lyra-1、Lyra-2、Lyra-3、Lyra-4、Lyra-5、Lyra-6、Lyra-7、Lyra-8、Lyra-9、Lyra-10；Lyra-1为328个核苷酸，Lyra-2为469个核苷酸，Lyra-3为439个核苷酸，Lyra-4为538个核苷酸，Lyra-5为432个核苷酸，Lyra-6为422个核苷酸，Lyra-7为547个核苷酸，Lyra-8为400个核苷酸，Lyra-9为410个核苷酸，Lyra-10为416个核苷酸。

附图说明

图1：Lyra-1位点的特异性引物扩增21个石蒜的DNA的银染PAGE图

图2：Lyra-2位点的特异性引物扩增21个石蒜的DNA的银染PAGE图

图3：Lyra-3位点的特异性引物扩增21个石蒜的DNA的银染PAGE图

图4：Lyra-4位点的特异性引物扩增21个石蒜的DNA的银染PAGE图

图5：Lyra-5位点的特异性引物扩增21个石蒜的DNA的银染PAGE图

图6：Lyra-6位点的特异性引物扩增21个石蒜的DNA的银染PAGE图

图7：Lyra-7位点的特异性引物扩增21个石蒜的DNA的银染PAGE图

图8：Lyra-8位点的特异性引物扩增21个石蒜的DNA的银染PAGE图

图9：Lyra-9位点的特异性引物扩增21个石蒜的DNA的银染PAGE图

图10：Lyra-10位点的特异性引物扩增21个石蒜的DNA的银染PAGE图

具体实施方法

实施例1：

1、石蒜微卫星DNA富集文库的构建

1.1基因组的提取与酶切

用Doyle J介绍的CTAB法(Doyle J.DNA protocols for plants-CTAB totalDNA isolation A.In Hewitt GM，Johnston【A】(eds.)，Molecular Techniquesin Taxonomy【M】.Berlin：Springer，1991，283-293)提取石蒜基因组。用限制性内切酶Sau3AI(购自TaKaRa公司)酶切基因组。酶切产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳，紫外光下切下300bp-900bp的DNA片段并用胶回收试剂盒(购自上海生工)纯化回收。

1.2加接头：

将纯化回收的胶回收产物加入接头：

LA(5’-GGCCAGAGACCCCAAGCTTCG-3’)，

LB(5’-P04-GATCCGAAGCTTGGGGTCTCTGGCC-3’)，

在T4连接酶(购于Promega公司)作用下16℃水浴连接过夜。

1.3PCR检测接头连接：

以LA为引物，以1.2工序制的连接产物为模板进行PCR，(50μl反应体系如下：25μlTaqGreen(购于Promega公司)，5μl引物LA，5μl连接产物，加水补至50μl。PCR反应程序如下：94℃预变性5分钟，94℃变性50秒，56℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，变性至退化三个步骤重复25次。最后72℃充分延伸10分钟。)PCR产物用纯化试剂盒(购于Axygen公司)进行纯化。

1.4磁珠富集：

将1.3所制纯化产物与杂交探针(CT)₁₅在70℃下杂交一个半小时。将杂交液加入已平衡好的磁珠，室温放置30分钟。将离心管依次用6×SSC，2×SSC，1×SSC于60℃下洗两次，最后用0.1×SSC室温下洗一次。加入TE缓冲液，在PCR机上95℃变性15分钟，收集上清。

1.5PCR富集：

以磁珠富集产物为模板，LA为引物进行PCR扩增，25μl反应体系如下：TaqGreen12.5μl，LA 1.5μl，富集后的DNA2.5μl，加水补至25μl。PCR反应程序如下：94℃预变性3分钟，94℃变性35秒，60℃退火35秒，72℃延伸1分钟，变性至退火三个步骤重复25次。最后72℃充分延伸12分钟。PCR产物用纯化试剂盒进行纯化。

1.6感受态细胞的制备：

将1mL过夜培养的E.coli DH-5a培养液接于50mL液体LB培养基中，37℃振荡培养12小时至对数生长期(OD₆₀₀≈0.3-0.6)时取出。将菌液于4℃离心10分钟，弃上清，加入1mL0.1mol/L预冷的Cacl₂重新悬浮细胞用枪头轻轻打匀。4℃离心10分钟。弃上清，加入预冷甘油/Cacl₂混合物重新悬浮菌体，用枪头打匀，-80℃保存。

1.7倒平板：

将LB固体培养基完全融化，冷却至50℃左右，配成LB/Amp/X-Gal/IPTG平板培养基(比例为：LB固体培养基100mL；Amp青霉素100μl；20％异丙基一β-D一硫代半乳糖昔(IPTG)7ul；20％5-嗅-4一氯一3-吲哚一β-D一半乳糖昔(X-Gal)40μl)混合均匀后倒入一只培养皿里，待培养基凝固后放入37℃烘箱，晾干水蒸气。

1.8连接转化：

取1.5工序所制的PCR富集后的纯化产物加入pMD19-T载体(购自TaKaRa公司)于16℃水浴连接2小时，制成连接产物。

取出感受态细胞，冰上复苏至液态，加入上述连接产物，混匀。冰浴30分钟后放入42℃水浴锅，热激90秒，立即放入冰中冰浴2分钟，加入新鲜的LB培养基，37℃振荡培养1-1.5小时。取70u l培养液涂布于LB/Amp/X-Gal/IPTG培养基上，37℃倒置培养过夜。

2、阳性克隆的筛选：

将平板上的白色单菌落分别放入事先装有LB/Amp培养基的EP管中。37℃振荡培养至菌液浑浊。

15ul PCR反应体系包括：Taq酶0.075U(购自TaKaRa公司)，10X Buffer 1.5ul，dNTP0.2uM，mg²⁺1.5uM，引物0.4uM(LA，primer-c(CT₁₅))，水。反应程序：94℃预变性3分钟，94℃变性50秒，56℃退火35秒，72℃延伸1分钟，变性至延伸三个步骤重复30次。最后72℃充分延伸12分钟，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

3、阳性克隆测序及引物设计：阳性克隆送生物公司测序，共得到33条含有微卫星DNA的序列。根据微卫星DNA两侧的序列，利用软件primerprimer5设计引物，如表1所示。

实施例2：

2.1筛选有多态性的引物：

用1.1的CTAB法提取石蒜基因组。用设计的引物(表1)扩增基因组。反应程序：94℃预变性4分钟，94℃变性45秒，退火30秒(退火温度见表1)，72℃延伸35秒，变性至退火三个步骤重复35次。最后72℃充分延伸8分钟。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物用PAGE电泳进行检测，共得到10个多态性的微卫星标记；Lyra-1为328个核苷酸，Lyra-2为469个核苷酸，Lyra-3为439个核苷酸，Lyra-4为538个核苷酸，Lyra-5为432个核苷酸，Lyra-6为422个核苷酸，Lyra-7为547个核苷酸，Lyra-8为400个核苷酸，Lyra-9为410个核苷酸，Lyra-10为416个核苷酸。

2.2结果分析：

使用Cervus3.0软件计算期望杂合度和观察杂合度。使用Genepop3.4软件计算哈代一温伯格以及连锁不平衡的值，以此来描述10个石蒜微卫星DNA多态位点的特征。

由附图1-10看出，本发明的10个微卫星序列的长度在供试的21个石蒜中都出现了多样性，由此可见，本发明的这10个微卫星标记能用于研究石蒜的遗传多样性保护，石蒜属植物种间和居群间的变异和进化关系及石蒜品种的鉴定，具有重复性好的特点，是一种可靠有效的分子标记。

表1引物特性表：

表1中S表示5’端引物，A表示3’端引物。

序列表

<110>安徽师范大学

<120>石蒜微卫星分子标记

<130>1

<160>10

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>328

<212>DNA

<213>石蒜(Lycoris radiata)

<400>1

gatcagacct tactgcaagg atggaatttt gaggggtcga tatacaaaat gtctgtcttc 60

tcaacttaaa ctctcaaaac tctctctctc tctctctcat ctctctttcc cgctcttttc 120

tctctccatc tctgttcacc tttaccctct cactctctct ctctctctct ctctctctct 180

ctctactctc aagacagctc aagatggctg cggagacaag ggtctaagag cttgagatgt 240

tgggttcgtg gtgaagtggt cggggaaggt cggcgtggga gctcgagatt ggagttgagg 300

ctgtggggct gagctgggac tgaaggat 328

<210>2

<211>469

<212>DNA

<213>石蒜(Lycoris radiata)

<400>2

gatcaagatt tgtttcatgc taatttaacc ctaaaaccca agatctacct agccctagat 60

gctgtcgccg accctttctt atgcccatcg ccgctactat caccataatc ccccttgctg 120

tgtgcatgcc cctcccttct ttttctcctc atcttctctc tctctctctc tctctctttc 180

tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctcccctcc attatcttct 240

ctctcttctg tccttgcgtc gcaccccttt gcgtcgccga tctgtagttg ataccctctt 300

ctcctttgcc ttcgatcgct tcctaccccc aaagattgag gctgctacca taaaacccta 360

ggttcccctc gatctttatg cacgtgcact tgtgcacccc cttcatggaa atcccgatgc 420

ccccttcatg caagtttcga tgccctttca tgtcactccc gctctaagt 469

<210>3

<211>439

<212>DNA

<213>石蒜(Lycoris radiata)

<400>3

aatcagacac cccacggatc caaacattgt tccagagcct tctcccccaa tgttcactac 60

caccccagct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctccct 120

ctccccctcc aaccctagta gcttaagctt caaggtggtc aggccaggct cgaacagcag 180

cagaagctct ctctctctct ctctctcacc cttcttgctg aatttagaac agcttaagga 240

agtctgccca tataaagctg ccacattatc caccgagtac tcctgaaacc aaaaccttca 300

tttcaaaaca ttattagact gagaatatca tcaattataa gattcagtgg tctacatatg 360

ttttgaaaca atcttttatt tctttcgccc cgcaaaccgt aagcacaggc caaaacacat 420

gtatcatatc tgcccctct 439

<210>4

<211>538

<212>DNA

<213>石蒜(Lycoris radiata)

<400>4

gatcatcttc cccaagcctt ttttctcgag tccttgctca cgactccttt actctttctc 60

tctcatatca ctctctctta ccattttctc tcagctcgat ctctctctct ctctctttct 120

ctatctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct cttccgcacg ctctcttctc 180

tcatatctca ctgtgaactt actctcttac tcctctctcc tcaccattct ttgctctcac 240

ggcttcaact actcctcctt tctctcgcat acattctcac ttcatgggtt tgatggcaag 300

cttggaggtt gagctcatag ggactttgag atgaaggtgg caacagcatt gggggtgctc 360

gagctcaagc tgaggatggt atgaggtggt ggagcttcga gagatgaagt tgaaggagga 420

gatgggtcag aactatgctg gtggagttca tcaaagttgg gttcaagctc gactgtgaga 480

aaaactcgat aaggaagaag ctcgagttgg ggtagtgagt tgcagacgaa ttcgactt 538

<210>5

<211>432

<212>DNA

<213>石蒜(Lycoris radiata)

<400>5

gatcatcatc gtgtttgcta gttatttgcc agtccttata tagaagaatg acagggaaga 60

aagagtttcg actttcgagt ttatggttac tcttaccttc tttggctact cacatgcttg 120

tcactttctt tgtatacagc ctacactgat actctctagc catttctcag ggtacaatct 180

ctctctctct ctctctctct ccctctctct ctctctcatt ttggaacatt ttgttaaact 240

ttttagtagc tcgccctctt attttataac ttttgttaaa attttaagta gcatcttttg 300

gagaagagcg tagtagcttt gacgggatcc ttgcgatttt tacgcttggt caatagcgtt 360

atgcaagagg atggactgac tgtgaggcta gcaggataac tcgatatgat tagacaaagg 420

cggagaacaa gt 432

<210>6

<211>422

<212>DNA

<213>石蒜(Lycoris radiata)

<400>6

gatcaattgg ctaggacttg taaaatgaat tttagaattg tcctctttag tccctaaacc 60

ttcgtgcgtc cgctacgcca ttaaattgtt tagaaatcct ctaccaaaac ccaacatccc 120

ctccccgaac tatgccgcca ccgaaaaacc aaccaactcc tctagccagc ggcaagcccc 180

cctcctttgt tgtcgtcgaa ggcggcaccc ccttgtcgtc tctctctctc tctctctctc 240

tctccctaaa cctattttcc ttttctttct ttagttttgg tttggtccat gagttcacat 300

ctctctctct ctctctcaaa gcagcaaatc caactccatt ctcatctctc tctctctctc 360

tctctctctc tctctctctc tcatccaacg agtaaattag cggcggtgag aagcgaaaca 420

at 422

<210>7

<211>547

<212>DNA

<213>石蒜(Lycoris radiata)

<400>7

gatcagagat tagtataacg attccatcta aataatgaac caaaatgatt aaatgtaaag 60

tgggtgatga aatgaactgg ataaataaag gcttgaatat catcaacaag ggaaccctac 120

taagactatt aaagcagctt aggaatttta agagagaaat gttactctaa gtcaatgcat 180

tcaattctgt cagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga ataataataa 240

cagggcgacg aattatggtt agccggcgat gaactcaaca atgcgggagg ggaggggagg 300

ggagggtggc aataggagta cctgttgaag aaaagagtgg gtattgagct taaacaacca 360

ttgagatagt agagaaagag aaagggcaat tcgatctaaa gtcaatgggg tattgggcaa 420

cggagcaaat attaagggtg cttttaaaca tcaagtgaat gtcaaggtag tttctagaca 480

ttaggcctaa aagtaggatg gtttttggat aataccccat ttatgttatc aaattgctag 540

tttggat 547

<210>8

<211>400

<212>DNA

<213>石蒜(Lycoris radiata)

<400>8

gatcagccct atcaccacca ttagagctcg accttattaa tgaccattac tatggtgacc 60

tctgaacctc atcaactcca accacccttt aaccattgca ctaagctcag tcgctaaact 120

aagccctatc ttcaacatga actccaccac ctcaatggca gacctctctc attcttcaaa 180

gcttcaaacc cctaatccat gagcttgcac ttcccatcca tgatccatgc tgaagagaga 240

gagagaggga gagggagagg gagagggaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga 300

gagaacttag tagtagagag aagaaaaatg aaatcaagtg agagagaaag aggaaggcaa 360

gttgtgggtg cactttagct gagggcatga tggagaagat 400

<210>9

<211>410

<212>DNA

<213>石蒜(Lycoris radiata)

<400>9

gatcagccct atcaccacca ttagagctcg accttattaa tgaccattac tatggtgacc 60

tctgaacctc atcaactcca accacccttt aaccattgca ctaagctcag tcgctaaact 120

aagccttatc ttcaacatga actccaccac ctcaatggca gacctctctc attcttcaaa 180

gcttcaaacc cctaatccat gagcttgcac ttcccatcca tgatccatgc tgaagagaga 240

gggagaggga gagggagagg gagagggaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga 300

gagagagaga gagaacttag tagtagagag aagaaaaatg aaatcaagtg agagagaaag 360

aggaaggcaa gttgtgggtg cactttagct gagggcatga tggagaagat 410

<210>10

<211>416

<212>DNA

<213>石蒜(Lycoris radiata)

<400>10

gatcaaagaa ataggaaaga gtacacctga attcaaactt ctccgttata tgtaataaat 60

cgctcaactt acctctacag agattctctc aaacaaaatc tcgatctttt cctctggatc 120

tccaatggtt gcccttgatc tcccttgtaa aactctctct ctctctctct ctctctctct 180

ctctctctct ctctcttcct ttcttgattt ttcttgagac tatatcttaa ctagggttga 240

aaatcccttt tataaacctt aaacacgtaa ccagacatcc accgttggat tagaagcatg 300

gaggaatcaa aaccatcgaa aatgggtccc aaacgtgcaa gttcgacccg aacccgtgaa 360

actgatctgc gactagtcgc ttagtagatg cgaccggccg cccgccggtc gctcgt 416

Claims

1.一种石蒜微卫星DNA分子标记，其特征在于，所述微卫星标记的标号为：Lyra-1，其核苷酸序列为：

Lyra-1：

gatcagacct tactgcaagg atggaatttt gaggggtcga tatacaaaat gtctgtcttc 60

tcaacttaaa ctctcaaaac tctctctctc tctctctcat ctctctttcc cgctcttttc 120

tctctccatc tctgttcacc tttaccctct cactctctct ctctctctct ctctctctct 180

ctctactctc aagacagctc aagatggctg cggagacaag ggtctaagag cttgagatgt 240

tgggttcgtg gtgaagtggt cggggaaggt cggcgtggga gctcgagatt ggagttgagg 300

ctgtggggct gagctgggac tgaaggat 328。