CN112746119B - 一套石蒜育性相关est-ssr标记的开发与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于转录组数据开发性状相关联分子标记的方法，属于分子标记研究领域。本发明根据石蒜近缘种——忽地笑转录组序列的GO功能注释，选择参与激素信号通路、花器官和种子形成以及控制生长模式转换的EST序列，开发了21个EST‑SSR标记。该套引物组来源于可能影响育性的功能基因，将其应用于石蒜种质的遗传分析，能够有效地将石蒜可育和不育材料区分开来，并且5个位点LrES4、LrES15、LrES17、LrES18和LrES21表现为与育性极显著的相关性，表明它们在开发石蒜育性选择标记的巨大潜力。
Description
技术领域
本发明涉及一套育性相关EST-SSR标记，属于分子标记技术领域。
背景技术
石蒜为石蒜科(Amaryllidaceae)石蒜属多年生草本植物，具有重要的药用价值和观赏价值。其不仅含有石蒜碱(lycorine)、加兰他敏(galanthamine)、水仙环素(narciclasine)等多种具有特定药理活性的石蒜科生物碱，还具有重要的观赏价值，夏可观花，秋可观叶。由于石蒜基因组庞大，且可供利用的分子标记很少，尚无任何公布的连锁标记，因而石蒜资源的品种改良和分子育种大大落后。因此，开发石蒜特定性状相关的分子标记是目前在不具备任何连锁图谱条件下挖掘性状关联标记的高效手段。
基于表达序列标签(Express Sequence Tag,EST)库或转录组测序数据开发的SSR标记(简单重复序列)，称之为EST-SSR标记。由于其来源于转录的功能基因，其对应基因的功能注释有利于挖掘性状相关联的EST-SSR标记，大大提高性状相关联分子标记的开发速度和效率，为石蒜资源开发利用以及分子育种提供研究基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一套开发特定性状相关EST-SSR标记的方法，进一步以石蒜育性为研究对象开发的一套育性关联的EST-SSR标记，该套标记包含8个与响应激素的标记，8个与花器官和种子形成有关的标记和5个参与营养生长和生殖生长的转换的标记。本发明提供了一套石蒜EST-SSR分子标记，所述石蒜EST-SSR标记是21个引物对。
该套引物序列依次如下，SEQ ID NO.:1至SEQ ID NO.:42。
表1与激素相关石蒜EST-SSR引物特征(SEQ ID NO.:1～16)
表2花和种子发育相关的石蒜EST-SSR引物特征(SEQ ID NO.:17～32)
表3与生长模式转换相关的EST-SSR引物特征(SEQ ID NO.:33～42)
本发明的21个石蒜EST-SSR标记是通过以下方法开发的：
(1)本发明基于石蒜近缘种——忽地笑的转录组数据库，根据序列的GO功能注释，选择参与激素调控、花器官和种子发育以及生长模式转换的EST序列，利用MISA软件寻找SSR位点，进而设计引物在石蒜中扩增验证；
(2)用CTAB(十六烷基三乙基嗅化铵，Hexadecyl trimethyl ammonium bromide)法提取石蒜基因组DNA；
(3)石蒜SSR分子标记的筛选：将(1)中设计的引物，以石蒜基因组DNA为模板进行PCR扩增验证：在20μL反应体系中分别加入10x Taq Buffer(含Mg2+)，1.6μL的2.5nM dNTP，5units/μL Taq DNA polymerase 0.1μL，正向引物4pmol，反向引物4pmol，10ng/μL DNA模板lμL，ddH2O补充体系至20μL；使用Eppendorf Mastercycler进行DNA扩增，具体步骤为：94℃预变性3min，然后94℃(30S)/58℃(30s)/72℃(30S)循环35次，最后72℃延伸10min；产物检测：在含有0.5％pg/μL EB的2％的琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察并照相记录结果；
(4)筛选条带清晰与目的产物预期大小一致的产物进行测序验证，通过验证最终获得21个石蒜EST-SSR标记，包含8个与激素代谢或响应相关的EST-SSR标记，8个与花器官和种子形成有关的EST-SSR标记以及5个参与生长模式转换的EST-SSR标记。
本发明基于石蒜近缘种——忽地笑的转录组，根据序列的GO功能注释，选择参与激素信号通路、花器官和种子形成以及控制生长模式转换的EST序列，用MISA软件寻找SSR位点，设计并合成引物，以石蒜为模板进行PCR扩增、测序验证，获得了21个EST-SSR标记，包含8个与激素代谢或响应相关的标记，8个与花器官和种子形成有关的标记以及5个参与生长模式转换的EST-SSR标记。本发明的有益之处是：(1)本发明以石蒜育性性状关联EST-SSR分子标记的挖掘为例，提供一种快速、高效的目标性状相关联EST-SSR分子标记开发的新思路，该思路可在应用于任何物种(只要其具有转录组数据信息或其近缘物种具有转录组数据)，开展任何性状(只要明确影响该性状的生物学通路)的相关联EST-SSR标记的开发。(2)本发明的21个分子标记，均来源于影响育性的功能基因，目标性强，组合使用能很好地将石蒜可育材料和不育材料区分开来，而且其中的5个标记与育性表现出极显著的相关性，表明该套标记应用于育性研究中的巨大潜力。(3)本发明的21个分子标记分为3个小类，可根据研究的目的性状，分别使用或组合应用，挖掘其他性状相关联的分子标记。
附图说明
图1为部分EST-SSR引物在34个石蒜材料中扩增产物的PAGE电泳图，紧随Marker(M)的为近缘种——忽地笑DNA的扩增检测，标记为La。图1-1为LrES15的PAGE电泳图谱，图1-2为LrES16的PAGE电泳图谱。
图2为基于21个EST-SSR标记构建的7个石蒜种群(包含34个个体)的遗传相似系数的UPGMA聚类图。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实例1：21个石蒜SSR标记是通过下述方法得到的：
(1)根据忽地笑转录组测序结果得到EST序列，根据GO功能注释，选择参与激素代谢、花和种子形成和生长模式转换的功能基因，使用软件Microsatellite(MISA)找出其中的SSR序列并设计引物，引物设计的原则为PCR产物长度100-350bp；GC含量40-70％，最适为50％；退火温度50-65℃；引物长度：19-22bp，引物委托上海生工生物工程有限公司合成；
(2)采石蒜幼嫩叶片，采用百泰克植物基因组DNA快速提取试剂盒提取待测样品的DNA，操作参照试剂盒说明书进行，获得的DNA，稀释50倍，用分光光度计法检测DNA浓度，用电泳法检测质量，调整DNA浓度为10ng/μL，作为工作液备用，其余DNA母液保存于-20℃；
表4石蒜种质资源信息
(3)选取(2)中19、20号DNA工作液为模板，进行PCR扩增，在20μL反应体系中分别加入2.0μL的10x Taq Buffer(含Mg2+)，1.6μL的2.5nM dNTP,5units/μL Taq DNA polymerase0.1μL，正向引物4pmol，反向引物4pmol，10ng/μL DNA模板lμL，ddH2O补充体系至20μL。使用Eppendorf Mastercycler进行DNA扩增，具体反应程序为：94℃预变性3min，然后94℃(30S)/58℃(30s)/72℃(30S)循环35次，最后72℃延伸10min。
(4)步骤(3)中的PCR产物在含有0.5％pg/μL EB的2％的琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察并照相记录结果,挑选条带清晰与目的产物大小差不多的条带，在UV2下用刀片切取凝胶，采用Axygene的凝胶回收试剂盒回收，具体操作按照说明书进行，获得的回收产物，通过电泳检测浓度后备用；
(5)步骤(4)中的回收产物与pclone007 simple Vector连接，连接反应按照说明书进行；
(6)将步骤(5)中的连接产物，与100μLtop10感受态细胞混匀，冰上静置30min，于42℃水浴热击45～90S，冰上静置2～5min，加入300μL液体LB培养基，37℃，120～150rpm/min复苏培养1h，后均匀涂布于氨苄浓度为：100mg/L的LB固体平板上，37℃培养16h；
(7)将步骤(6)中培养好的LB平板取出，挑取阳性克隆，接种于含有100mg/L氨苄的LB液体培养基中，37℃，2000rpm/min培养5h，进行菌落PCR，PCR反应体系为：10x TaqBuffer(含Mg2+)2μL，1.6μL的2.5nM dNTP,5units/μL Taq DNA polymerase 0.1μL，载体通用引物M13F 4pmol，M13R 4pmol，菌液1μL，ddH2O补充体系至20μL。使用EppendorfMastercycler进行DNA扩增，具体反应程序为：95℃预变性5min，然后95℃(30S)/56℃(30s)/72℃(30S)循环30次，最后72℃延伸10min；
(8)将步骤(7)中的PCR产物在含有0.5％pg/μL EB的2％的琼脂糖凝胶上电泳，确定是否为阳性克隆，将阳性克隆的菌液送生工测序，最终验证获得如下的21个EST-SSR标记。
表5石蒜EST-SSR标记特征
实例2：该21个标记组合应用于表2中石蒜材料的遗传分析
(1)提取表2中石蒜的基因组DNA，调整DNA浓度至10ng/μL；
(2)以上述DNA为模板，利用序列表1中SEQ ID NO.1～42所示引物进行PCR扩增，在20μL反应体系中分别加入2.0μL的10x Taq Buffer(含Mg2+)，1.6μ的2.5nMdNTP,5units/μLTaq DNA polymerase 0.1μL，正向引物4pmol，反向引物4pmol，10ng/μL DNA模板lμL，ddH2O补充体系至20μL。使用Eppendorf Mastercycler进行DNA扩增，具体反应程序为：94℃预变性3min，然后94℃(30S)/58℃(30s)/72℃(30S)循环35次，最后72℃延伸10min；
(3)将步骤(2)中的PCR扩增产物采用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电压180V，电泳4h～5h，通过银染显色见图1(部分引物PAGE电泳结果)，统计检测结果；
(4)将步骤(3)中统计的结果，按照Popgene32要求的格式导入软件，进行分析。
(5)聚类分析显示，可育株系与不育株系分别聚为独立的一支(图2)，表明该套引物可以有效地将上述材料按照育性进行划分，说明该套标记可应用于育性相关性状的研究中。
(6)将性状进行赋值，不育赋值为0，可育赋值为1，与(3)中电泳统计结果合并，利用SPSS2.0进行相关性分析，结果表明LrES4、LrES15、LrES17、LrES18和LrES21的基因位点与育性性状表现为极显著相关，表明上述5个标记具有开发育性选择标记的潜力。
显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏省中国科学院植物研究所
<120> 一套石蒜育性相关EST-SSR标记的开发与应用
<160> 42
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 1
gagcacggtg aggctacttc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 2
gagcacggtg aggctacttc 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 3
atagtaaacc ctccaagatt gcc 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 4
tttaaattgg tggaagttcc tga 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 5
cttttccagc aaaaacatac agg 23
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 6
aagaatcttt cacagccagt cc 22
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 7
cggcgatttt gtagttagta tcg 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 8
ttaacacccc acaaatactc cat 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 9
aaatgctacc tctttcatcc aca 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 10
gaaccaatct ccaaactctg gtc 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 11
atggcagaga gaacacattc att 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 12
accagatttc ttggcatcag taa 23
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 13
gaagaagcga aggagaaatt gtt 23
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 14
cgttggaggt atcgaaggc 19
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 15
ggtggtagtg gtgggagaga t 21
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 16
ccctggttat tatagcagtc cct 23
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 17
attcacagtc atggtgtggt tt 22
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 18
acttgcactg gtctaactgg aag 23
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 19
ttaagaaaat gcacatccag ctc 23
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 20
agaaagagca ggagcaagtg at 22
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 21
atagtgatgg tgatggtgat ggt 23
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 22
attcaaattg tcatcccctt tct 23
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 23
tgaattccac tctcagcaaa ttc 23
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 24
ggcagtagga gcaacagttc taa 23
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 25
tggttgaagt cagtgtagaa gca 23
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 26
gaccacaaga ccgtacgaag ac 22
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 27
ctcggagaat tgaagggaaa tta 23
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 28
acctcatcaa actcaaaccg taa 23
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 29
gccataagca cttcattcat ctc 23
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 30
agtgcatcac tgcataaaag gtt 23
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 31
agagagaatc gacgatgatg aag 23
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 32
tatctcaatc tagggcaaga gca 23
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 33
aaatctcagg tcaaacagat cca 23
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 34
tcaaaccaag ctttccagaa cta 23
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 35
gaaggagatt aggatggaga tgg 23
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 36
agcaacatgg aaaacacaaa act 23
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 37
gaatgaaacc ctaaccctag cat 23
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 38
aggactcact gcatagaaac gag 23
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 39
tgaaaatcgg tttactggaa gaa 23
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 40
gtcaagtggt tgttgctgac at 22
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 41
cactctgaaa gcaacgacta aca 23
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 石蒜(Lycoris radiata)
<400> 42
gttagagccg ctaaatatcc cat 23
Claims (2)
1.一套石蒜EST-SSR标记，其特征在于，该标记是一组引物对，其序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:42所示。
2.根据权利要求1所述的EST-SSR引物组在石蒜育性研究中的应用。
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