CN111850160B - 一种鉴别萝卜叶形的InDel引物及其应用 - Google Patents

一种鉴别萝卜叶形的InDel引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于萝卜育种技术领域，特别是涉及一种鉴别萝卜叶形的InDel引物及其应用。本发明提供一种鉴别萝卜叶形的InDel引物，所述InDel引物包括InDel593引物和InDel594引物；所述InDel593引物的上游引物如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述InDel593引物的下游引物如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；所述InDel594引物的上游引物如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，所述InDel594引物的下游引物如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。本发明提供的引物与控制萝卜叶型的基因有连锁关系，能够准确鉴定萝卜叶的叶型。

Description

一种鉴别萝卜叶形的InDel引物及其应用
技术领域
本发明属于萝卜育种技术领域，特别是涉及一种鉴别萝卜叶形的InDel引物及其应用。
背景技术
叶形作为农作物重要的农艺性状，影响株型、群体的通风透光性和光能利用率，也与农作物适应逆境有关。例如鸡爪叶棉花和复叶番茄能够显著提高群体的光合效率；叶缘裂刻深的叶片能更有效的通过对流散热来抵御高温伤害，并能调控水分胁迫；此外叶片形态还可以通过调节库源关系、地上与地下生长平衡来增加作物的产量和生物量。
萝卜(RaphanussativusL.)是原产于我国的一种重要蔬菜，年栽培面积1800万亩，占我国蔬菜面积的6％。萝卜用途广泛，生态类型丰富，同时由于其具有重要的保健与药用价值，已经成为世界上重要的蔬菜作物。叶形也是萝卜重要的农艺性状之一，不同的叶形对产量、肉质根的生长速度、开花期及光能利用率等都有影响。同时叶形还是维持萝卜地下与地上生长平衡的关键因素之一。萝卜的叶形、叶缘和叶裂刻变异丰富，且存在高纬度和低纬度类型差异。按叶缘分裂程度不同，萝卜的叶形可分为无裂刻(板叶)、浅裂和深裂(近板叶)及全裂刻(花叶)。萝卜叶形主要由遗传因素决定，但调控机制较为复杂，在不同材料中花叶相对于板叶表现为显性、不完全显性或隐性。例如花叶心里美萝卜在营养生长期叶缘表现全裂，但在生殖生长期叶缘表现无裂刻。开发控制萝卜叶形的分子标记有助于对萝卜叶形进行精准鉴别。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种鉴别萝卜叶形的InDel引物及其应用。本发明提供的鉴别方法能够精准的鉴定萝卜叶形。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明提供了一种鉴别萝卜叶形的InDel引物，所述InDel引物包括InDel593引物和/或InDel594引物；所述InDel593引物的上游引物具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述InDel593引物的下游引物具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；所述InDel594引物的上游引物具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，所述InDel594引物的下游引物具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
本发明还提供了上述引物在鉴别萝卜叶型中的应用。
优选的，所述鉴别的方法包括以下步骤：
(1)提取待检测萝卜材料的基因组DNA；
(2)以萝卜材料的DNA为模板，利用InDel593引物和InDel594引物分别对萝卜材料的DNA进行PCR扩增，得到PCR产物；
(3)对PCR产物进行电泳，当仅利用InDel593引物进行PCR时，扩增得到的PCR产物片段大小为179bp，则表明检测的萝卜材料为花叶品种；扩增得到的PCR产物片段大小为163bp，则表明检测的萝卜材料为板叶品种；扩增得到的PCR产物片段大小同时包含179bp和163bp，则表明检测的萝卜材料为花叶品种；
当仅利用InDel594引物进行PCR扩增时，得到的PCR产物片段大小为185bp，则表明检测的萝卜材料为花叶品种；扩增得到的PCR产物片段大小为179bp，则表明检测的萝卜材料为板叶品种；扩增得到的PCR产物片段大小同时包含185bp和179bp，则表明检测的萝卜材料为花叶品种；
当利用InDel593引物和InDel594引物同时进行PCR扩增时，利用InDel593引物进行PCR扩增得到的PCR产物片段大小为179bp，且利用InDel594引物进行PCR扩增得到的PCR产物片段大小为185bp，则表明检测的萝卜材料为花叶品种；利用InDel593引物进行PCR扩增得到的PCR产物片段大小同时包含179bp和163bp，且利用InDel594引物进行PCR扩增得到的PCR产物片段大小同时包含185bp和179bp，则表明检测的萝卜材料为花叶品种；利用InDel593引物进行PCR扩增得到的PCR产物片段大小为163bp，且利用InDel594引物进行PCR扩增得到的PCR产物片段大小为179bp，则表明检测的萝卜材料为板叶品种。
优选的，所述PCR扩增的反应体系为：100ng萝卜材料的DNA，1μl 10×PCR Buffer，0.8μl dNTPs，浓度为10μmol的上述InDel引物各0.2μl，1U Taq酶，加ddH2O补足至10μl。
优选的，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性4min；94℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸30s；35个循环；72℃延伸l0min。
本发明提供了一种鉴别萝卜叶形的InDel引物，所述InDel引物包括InDel593引物和InDel594引物；所述InDel593引物的上游引物具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述InDel593引物的下游引物具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；所述InDel594引物的上游引物具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，所述InDel594引物的下游引物具有如SEQID NO:4所示的核苷酸序列。本发明提供的引物与控制萝卜叶型的基因有连锁关系，能够准确扩增获得如SEQ ID NO:5～8所示的核苷酸序列，因此具有扩增特异性高的特点。
本发明提供的上述引物在鉴别萝卜叶型中的应用，通过判断比较扩增得到的核苷酸序列片段长度，能够准确的判断萝卜叶型。利用InDel593引物进行PCR扩增得到的PCR产物片段大小为179bp，则表明检测的萝卜材料为花叶品种，如果扩增得到的产物片段大小为163bp，则表明检测的萝卜材料为板叶品种，如果扩增得到的产物片段同时包含179bp和163bp，则表明检测的萝卜材料为花叶品种。
利用InDel594引物进行PCR扩增得到的PCR产物片段大小为185bp，则表明检测的萝卜材料为花叶品种，如果扩增得到的产物片段大小为179bp，则表明检测的萝卜材料为板叶品种，如果扩增得到的产物片段同时包含185bp和179bp，则表明检测的萝卜材料为花叶品种。
当利用InDel593引物和InDel594引物同时进行PCR扩增时，利用InDel593引物进行PCR扩增得到的PCR产物片段大小为179bp，且利用InDel594引物进行PCR扩增得到的PCR产物片段大小为185bp，则表明检测的萝卜材料为花叶品种；利用InDel593引物进行PCR扩增得到的PCR产物片段大小同时包含179bp和163bp，且利用InDel594引物进行PCR扩增得到的PCR产物片段大小同时包含185bp和179bp，则表明检测的萝卜材料为花叶品种；利用InDel593引物进行PCR扩增得到的PCR产物片段大小为163bp，且利用InDel594引物进行PCR扩增得到的PCR产物片段大小为179bp，则表明检测的萝卜材料为板叶品种。由实施例可知，本发明提供的检测方法准确率高达100％。
附图说明
图1为亲本和F1的叶片表型；
图2为萝卜遗传连锁图谱和叶形控制基因LS初定位区间结果图，其中，A为当LOD值设为4.0时，利用Joinmap 4.0软件构建的含有9条连锁群的遗传图谱；B为当LOD值设为3.0时，在LG6连锁群末端InDel 32和SSR80之间检测到极强的QTL信号；
图3为萝卜叶形调控基因LS精细定位图。
具体实施方式
本发明提供了一种鉴别萝卜叶形的InDel引物，所述InDel引物包括InDel593引物和/或InDel594引物；所述InDel593引物的上游引物具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述InDel593引物的下游引物具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；所述InDel594引物的上游引物具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，所述InDel594引物的下游引物具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列：
GCTCTTGCTATAGCTAGTCTGCA，SEQ ID NO:1
CTACCAGAGGGATACAACACAGG，SEQ ID NO:2；
TTTCACGCCGTCTCTTTAGGTTA，SEQ ID NO:3；
AGTGTCGTCGTCGTCATTAAGAT，SEQ ID NO:4。本发明提供的引物与控制萝卜叶型的基因有连锁关系，能够准确扩增获得如SEQ ID NO:5～8所示的核苷酸序列：
GCTCTTGCTATAGCTAGTCTGCACATTTTGCCATTTGTTAACAACAACACTATATGAAACTGGTTTTGGATCTTTAATGGAAGAAACAAATAATCACTCTTCTTGACCAACCTCTGTCTCTGGCCTCCGCTTAAGCTTGAACCCCTGGGACCTATTCCTGTGTTGTATCCCTCTGGTAG，SEQ ID NO:5；
GCTCTTGCTATAGCTAGTCTGCACATTTTGCCATTGTTAACAACAACACTATATGAAACTGGTTTTGGATGAAATAATCACTCTTCTTGACCAACCTCTGTCTCTGGCCTCCGCTTAAGCTTGAACCCCTGGGACCTATTCCTGTGTTGTATCCCTCTGGTAG，SEQ ID NO:6；
TTTCACGCCGTCTCTTTAGGTTATAAAAACTCAATTGATCATCGCCGATTAGTCTTCAAAATCGAGAAATTGAAGCTCTTCTTCTTTCTCTCTGTCTCAGGTGAAGGAATGGCTGCCGTTCCGGTGATCAGACGATGCAATGAGATGAAGCCGGAGATGACTATCTTAATGACGACGACGACACT，SEQ ID NO:7；
TTTCACGCCGTCTCTTTAGGTTATAAAAACTCAATTGATCATCGCCGATTAGTCTTCAAAATCGAGAAATTGAAGCTCTTCTTCTCTCTCTCAGGTGAAGGAATGGCTGCCGTTCCGGTGATCAGACGATGCAATGAGATGAAGCCGGAGATGACTATCTTAATGACGACGACGACACT，SEQ ID NO:8，因此具有扩增特异性高的特点。本发明对所述引物的合成方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规引物合成公司进行合成即可。
本发明还提供了上述引物在鉴别萝卜叶型中的应用。通过判断比较扩增得到的核苷酸序列片段长度，能够准确的判断马尔和二年子萝卜的叶型，准确率高达100％，当本发明提供的引物在鉴别其它品种的萝卜叶型时，准确率可达95％。
在本发明中，所述鉴别的方法优选包括以下步骤：
(1)提取待检测萝卜材料的基因组DNA；
(2)以萝卜材料的DNA为模板，利用InDel593引物和InDel594引物分别对萝卜材料的DNA进行PCR扩增，得到PCR产物；所述PCR扩增的反应体系优选为：100ng萝卜材料的DNA，1μl 10×PCR Buffer，0.8μl dNTPs，浓度为10μmol的上述InDel上下游引物各0.2μl，1U Taq酶，加ddH2O补足至10μl；所述PCR扩增的程序优选为：94℃预变性4min；94℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸30s；35个循环；72℃延伸l0min；4℃保存；
(3)对PCR产物进行电泳，当仅利用InDel593引物进行PCR时，扩增得到的PCR产物片段大小为179bp，则表明检测的萝卜材料为花叶品种；扩增得到的PCR产物片段大小为163bp，则表明检测的萝卜材料为板叶品种；扩增得到的PCR产物片段大小同时包含179bp和163bp，则表明检测的萝卜材料为花叶品种；
当仅利用InDel594引物进行PCR扩增时，得到的PCR产物片段大小为185bp，则表明检测的萝卜材料为花叶品种；扩增得到的PCR产物片段大小为179bp，则表明检测的萝卜材料为板叶品种；扩增得到的PCR产物片段大小同时包含185bp和179bp，则表明检测的萝卜材料为花叶品种；
当利用InDel593引物和InDel594引物同时进行PCR扩增时，利用InDel593引物进行PCR扩增得到的PCR产物片段大小为179bp，且利用InDel594引物进行PCR扩增得到的PCR产物片段大小为185bp，则表明检测的萝卜材料为花叶品种；利用InDel593引物进行PCR扩增得到的PCR产物片段大小同时包含179bp和163bp，且利用InDel594引物进行PCR扩增得到的PCR产物片段大小同时包含185bp和179bp，则表明检测的萝卜材料为花叶品种；利用InDel593引物进行PCR扩增得到的PCR产物片段大小为163bp，且利用InDel594引物进行PCR扩增得到的PCR产物片段大小为179bp，则表明检测的萝卜材料为板叶品种。
在本发明中，所述电泳时优选使用聚丙烯酰胺质量百分为8％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。
在本发明中，如无特殊说明，本发明提取萝卜材料DNA的方法、电泳PCR扩增产物的方法均为本领域技术人员公知的常规方法。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种鉴别萝卜叶形的InDel引物及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
利用来自中国南方的马尔萝卜(板叶、无裂刻、早抽薹)和来自日本的二年子(花叶、全裂刻、晚抽薹)为亲本构建双亲BC1(89株和87株)和F2群体(183株)。
分别于2016播种于北京蔬菜研究中心农场，叶片莲座期性状调查结果显示，F1植株表现为叶片全裂刻(见图1)，F2分离群体中，花叶(全裂刻，AA或Aa)和板叶(无裂刻，aa)材料分别为131株和52株，分离比例符合3:1(χ2＝1.14,P＝0.286)。在BC1-P1群体中全部表现为花叶(AA或Aa)，在BC1-P2群体中花叶(Aa)与板叶(aa)分离比例符合1:1(χ2＝0.01，P＝0.915，见表1)。
表1世代群体形状观察
Figure BDA0002658025780000071
结果表明萝卜花叶叶形性状受显性单基因控制，命名为Leaf shape(LS)。
实施例2
利用IlluminaHiseq 2500测序平台对亲本“马耳”和“二年子”进行全基因组重测序，以‘Aokubi DH’为参考基因组检测双亲的多态性。通过GATK软件分析，双亲间检测到大约534,000个InDel变异。根据参考基因组信息，每300～800kb设计1对InDel标记，同时考虑分布在尽可能的scaffold上。初步设计500对InDel标记，引物设计的原则包括退火温度在58～60℃，双亲间的碱基差异在3～8bp，扩增片段大小在100～200bp。
利用626对EST-SSR标记及500个InDel标记检测亲本“马耳”和“二年子”之间的多态性，其中34对EST-SSR引物和97对InDel引物在双亲之间具有多态性，可作为遗传图谱的构建。图2显示的是萝卜遗传连锁图谱和叶形控制基因LS初定位区间结果，其中，图2中的A为当LOD值设为4.0时，利用Joinmap 4.0软件构建的含有9条连锁群的遗传图谱，结果显示，当LOD值设为4.0时，利用Joinmap4.0软件可以构建一张含有9条连锁群的遗传图谱，该图谱总共包含99个SSR和InDel标记，遗传图谱总长度为934.5cM，平均间距9.44cM；图2中的B为当LOD值设为3.0时，在LG6连锁群末端InDel32和SSR80之间检测到极强的QTL信号，结果显示，利用MapQTL6.0软件进行QTL分析，当LOD值设为3.0时，检测到与萝卜叶形相关的QTL，在LG6连锁群末端InDel 32和SSR80之间检测到极强的QTL信号。LOD值为69.85～90.95，可解释82.4％～89.9％的表型变异。
实施例3
根据初步定位的结果，进一步利用F2大群体(1656株)进行精细定位，InDel32和SSR80定位区间位于“XYB36-2”参考基因组的R07：25,100,327～25,490,368位置。在区间内基于双亲基因组数据每间隔50～100Kb，设计49个InDel标记(InDel548-InDel596)，构建了局部加密的连锁图谱(见图3)。遗传连锁分析将萝卜叶形基因LS定位在Indel593(R07：25,182,138)和Indel594(R07：25,227,193)之间45kb区间内(见图3)。
应用例1
利用Indel593引物(上游引物如SEQ ID NO:1所示，下游引物如SEQ ID NO:2所示。)和Indel594引物(上游引物如SEQ ID NO:3所示，下游引物如SEQ ID NO:4所示。)对183个萝卜单株(二年子×马耳的F2群体)进行标记分型鉴定。鉴定方法如下：取183个萝卜单株分别进行DNA提取，以提取到的萝卜DNA为模板，利用InDel593引物和InDel594引物分别对萝卜材料的DNA进行PCR扩增，扩增得到PCR产物。扩增的反应体系为：100ng萝卜材料的DNA，1μl 10×PCR Buffer，0.8μl dNTPs，浓度为10μmol的InDel上下游引物各0.2μl，1U Taq酶，加ddH2O补足至10μl。PCR扩增的程序为：94℃预变性4min；94℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸30s；35个循环；72℃延伸l0min；4℃保存。使用聚丙烯酰胺质量百分为8％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，通过检测PCR产物片段长度来鉴定萝卜的叶型。
鉴定结果如表1所示。
表1 183份萝卜材料InDel593引物和InDel594引物PCR产物统计
Figure BDA0002658025780000091
Figure BDA0002658025780000101
Figure BDA0002658025780000111
Figure BDA0002658025780000121
由表1可知，利用引物检测的数据与叶形表型数据完全一致。说本发明提供的InDel引物能够精准的鉴定萝卜叶形，可以作为分子标记进行辅助萝卜育种。
本发明提供的鉴定方法精准度高达100％，能够有效鉴定萝卜叶型，辅助萝卜育种。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 北京市农林科学院
<120> 一种鉴别萝卜叶形的InDel引物及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctcttgcta tagctagtct gca 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctaccagagg gatacaacac agg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tttcacgccg tctctttagg tta 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agtgtcgtcg tcgtcattaa gat 23
<210> 5
<211> 179
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gctcttgcta tagctagtct gcacattttg ccatttgtta acaacaacac tatatgaaac 60
tggttttgga tctttaatgg aagaaacaaa taatcactct tcttgaccaa cctctgtctc 120
tggcctccgc ttaagcttga acccctggga cctattcctg tgttgtatcc ctctggtag 179
<210> 6
<211> 163
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gctcttgcta tagctagtct gcacattttg ccattgttaa caacaacact atatgaaact 60
ggttttggat gaaataatca ctcttcttga ccaacctctg tctctggcct ccgcttaagc 120
ttgaacccct gggacctatt cctgtgttgt atccctctgg tag 163
<210> 7
<211> 185
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tttcacgccg tctctttagg ttataaaaac tcaattgatc atcgccgatt agtcttcaaa 60
atcgagaaat tgaagctctt cttctttctc tctgtctcag gtgaaggaat ggctgccgtt 120
ccggtgatca gacgatgcaa tgagatgaag ccggagatga ctatcttaat gacgacgacg 180
acact 185
<210> 8
<211> 179
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tttcacgccg tctctttagg ttataaaaac tcaattgatc atcgccgatt agtcttcaaa 60
atcgagaaat tgaagctctt cttctctctc tcaggtgaag gaatggctgc cgttccggtg 120
atcagacgat gcaatgagat gaagccggag atgactatct taatgacgac gacgacact 179

Claims (5)

1.一种鉴别萝卜叶形的InDel引物，其特征在于，所述InDel引物为InDel593引物和/或InDel594引物；所述InDel593引物的上游引物为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述InDel593引物的下游引物为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；所述InDel594引物的上游引物为SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，所述InDel594引物的下游引物为SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述引物在鉴别萝卜叶型中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述鉴别的方法包括以下步骤：
（1）提取待检测萝卜材料的基因组DNA；
（2）以萝卜材料的DNA为模板，利用InDel593引物和InDel594引物分别对萝卜材料的DNA进行PCR扩增，得到PCR产物；
（3）对PCR产物进行电泳，当仅利用InDel593引物进行PCR时，扩增得到的PCR产物片段大小为179bp，则表明检测的萝卜材料为花叶品种；扩增得到的PCR产物片段大小为163bp，则表明检测的萝卜材料为板叶品种；扩增得到的PCR产物片段大小同时包含179bp和163bp，则表明检测的萝卜材料为花叶品种；
当仅利用InDel594引物进行PCR扩增时，得到的PCR产物片段大小为185bp，则表明检测的萝卜材料为花叶品种；扩增得到的PCR产物片段大小为179bp，则表明检测的萝卜材料为板叶品种；扩增得到的PCR产物片段大小同时包含185bp和179bp，则表明检测的萝卜材料为花叶品种；
当利用InDel593引物和InDel594引物同时进行PCR扩增时，利用InDel593引物进行PCR扩增得到的PCR产物片段大小为179bp，且利用InDel594引物进行PCR扩增得到的PCR产物片段大小为185bp，则表明检测的萝卜材料为花叶品种；利用InDel593引物进行PCR扩增得到的PCR产物片段大小同时包含179bp和163bp，且利用InDel594引物进行PCR扩增得到的PCR产物片段大小同时包含185bp和179bp，则表明检测的萝卜材料为花叶品种；利用InDel593引物进行PCR扩增得到的PCR产物片段大小为163bp，且利用InDel594引物进行PCR扩增得到的PCR产物片段大小为179bp，则表明检测的萝卜材料为板叶品种。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：100ng萝卜材料的DNA，1μl 10×PCR Buffer，0.8μl dNTPs，浓度为10μmol的权利要求1所述InDel593引物或InDel594引物各0.4μl，1U Taq酶，加ddH2O补足至10μl。
5.根据权利要3所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：94 ℃预变性4min；94℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸30s；35个循环；72℃延伸l0min。
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