CN115369184A - 一种与西瓜果皮底色相关的InDel分子标记及其应用 - Google Patents
一种与西瓜果皮底色相关的InDel分子标记及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于西瓜分子育种技术领域,具体涉及一种与西瓜果皮底色相关的InDel分子标记及其应用。本发明利用一个绿皮育种材料(W‑2‑2)和三白瓜杂交分别构建F2分离群体和BC1回交群体,发现该绿皮性状由单基因控制。通过BSA‑seq方法将该基因定位于西瓜的9号染色体,利用F2分离群体进行精细定位,并开发一个与该性状紧密连锁的分子标记I_P5。利用上述分子标记I_P5可以实现苗期西瓜果皮底色的快速鉴定,可以用于西瓜的分子标记辅助育种。
Description
技术领域
本发明涉及西瓜分子育种技术领域,更具体地,涉及一种与西瓜果皮底色相关的InDel分子标记及其应用。
背景技术
西瓜是全球十大消费水果之一,在全世界范围内广泛种植。中国是世界上最大的西瓜生产及消费国。果皮颜色是西瓜果实重要的外观品质性状之一,是不同色素积累的结果。在消费市场上,相比与黄皮和白皮,绿皮花纹的西瓜更受消费者的喜爱。因此,果皮颜色已经成为影响西瓜市场价值的重要因素。在此背景下,研究西瓜果皮颜色的遗传及其分子标记,对于选育受市场欢迎的西瓜新品种具有重要的意义。
西瓜果皮底色遗传复杂,受多个基因调控。目前西瓜果皮底色调控的分子机理仍不清楚,因此需要进一步开展西瓜的果皮底色研究,开发与特定果皮底色性状紧密连锁的分子标记。利用分子标记辅助选择技术对后代进行基因型检测,可显著缩短育种周期,提高育种效率。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的西瓜果皮底色调控的分子机理仍不清楚的技术问题。
本发明提供了一种与西瓜果皮底色相关的InDel分子标记,所述分子标记为I_P5,位于西瓜基因组9号染色体上,其在绿色果皮底色西瓜中的核苷酸序列如序列1所示,在白色果皮底色西瓜中的核苷酸序列如序列2所示。
优选地,绿皮材料相比白皮材料在序列的5’端起第48位碱基处存在29bp的插入,该插入位于西瓜基因组9号染色体,且位点插入29bp的西瓜果皮底色为绿色,所述InDel位点没有碱基插入的表现为白色。
本发明还提供了一种用于检测与西瓜果皮底色相关的InDel分子标记的引物对,所述引物对的特异性引物和扩增的目的片段长度如下:
正向引物序列为TGGGTTTGGATACCCATCTTATTAACTTG;
反向引物序列为TATTGGTAGAAATAGGGTTTATGAGATAAA,扩增长度为126bp或97bp。
本发明还提供了一种基于InDel分子标记在鉴定或辅助鉴定西瓜果皮底色中的应用。
本发明还提供了一种利用InDel分子标记鉴定苗期西瓜果皮底色的方法,包括以下步骤:
S1,DNA提取,并使用分子标记I_P5对群体单株的基因型进行分子检测;
S2,对检测结果进行分析:
若待测西瓜的核苷酸序列为序列表中的序列1,则待测西瓜果皮底色为绿色;
若待测膝盖的核苷酸序列为序列表中的序列2,则待测西瓜果皮底色为白色。
优选地,所述DNA提取具体包括:
采用CTAB法提取待测西瓜材料的基因组DNA。
优选地,在步骤S1与S2之间还包括:
扩增目的片段:以待测西瓜材料基因组DNA为模板,利用上述引物对进行PCR扩增;
基因分型:利用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法鉴定所述InDel位点的碱基类型,
所述InDel位点存在29bp插入的西瓜果皮底色为绿色,无碱基插入的西瓜果皮底色为白色;
PCR反应体系:2×PCR Mix 12.5μL、DNA 2.5μL、上游引物1.5μL、下游引物1.5μL;
PCR程序:94℃2min;94℃10sec,58℃10sec,72℃10sec,共33个循环;72℃7min;4℃保存。
有益效果:本发明提供的一种与西瓜果皮底色相关的InDel分子标记及其应用,利用一个绿皮育种材料(W-2-2)和三白瓜杂交分别构建F2分离群体和BC1回交群体,发现该绿皮性状由单基因控制。通过BSA-seq方法将该基因定位于西瓜的9号染色体,利用F2分离群体进行精细定位,并开发一个与该性状紧密连锁的分子标记I_P5。利用上述分子标记I_P5可以实现苗期西瓜果皮底色的快速鉴定,可以用于西瓜的分子标记辅助育种。
附图说明
图1为本发明提供的果皮底色基因初定位图;
图2为本发明提供的精细定位InDel标记获得图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例,对本发明的具体实施方式作进一步详细描
述。以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
图1为本发明提供的一种与西瓜果皮底色相关的InDel分子标记,所述分子标记为I_P5,位于西瓜基因组9号染色体上,其在绿色果皮底色西瓜中的核苷酸序列如序列1所示,在白色果皮底色西瓜中的核苷酸序列如序列2所示。
序列1:
TGGGTTTGGATACCCATCTTATTAACTTGGTTATTTATGAGCTTAATCGATCTTGTTTGATAACTCTTTTGATTCTTGATGTTTAGTTTTTAAAAATTTATCTCATAAACCCTATTTCTACCAATA。
序列2:
TGGGTTTGGATACCCATCTTATTAACTTGGTTATTTATGAGCTTAATCGATGTTTAGTTTTTAAAAATTTATCTCATAAACCCTATTTCTACCAATA。
以绿皮西瓜材料(W-2-2)和白皮西瓜材料(三白瓜)杂交构建F2代分离群体和BC1回交群体,通过对果皮底色基因的精细定位开发了一种果皮底色性状紧密连锁的InDel分子标记。此标记可作为辅助选择手段应用于针对果皮底色的西瓜新品种的选育进程中,可极大的提高育种效率,缩短育种周期且节约资源。
以下通过不同实施例对与西瓜果皮底色相关的InDel分子标记及其应用进行详细解释说明。
实施例一
西瓜果皮底色相关的InDel标记I_P5的获得。
一、材料和群体构建。
以W-2-2(绿皮西瓜材料)为母本,以三白瓜(白皮西瓜材料)为父本,以上述W-2-2母本和三白瓜为父本进行杂交获取的F1代,F1代自交一代获得F2代群体。
二、果皮底色基因初定位。
如图1所示,2021年冬季在海南种植亲本W-2-2、三白瓜、F1代植株和505个F2单株,对亲本、F1代和F2群体进行果皮底色鉴定和果皮底色遗传分析,结果表明该果皮底色变异由单一基因控制,绿皮对白皮为显性,如下表1所示。在F2群体中挑选20株极端绿皮和极端白皮单株进行混池和BSA-seq分析,初步将果皮底色基因定位在西瓜9号染色体6.83Mb的区间内。
表1 F2代群体表型统计和卡方检测
三、果皮底色基因精细定位。
1.分子标记开发。
对亲本材料W-2-2和三白瓜进行全基因组重测序,将测序reads比对到参考基因组(97103v2,http://cucurbitgenomics.org/organism/21),利用软件GATK(GenomeAnalysisToolKit)检测两个亲本材料之间的变异,在全基因组共获得179,299个SNP和35,719个InDel。
在初定位的6.83Mb区间内开发InDel分子标记,共9个,密度约为660Kb.
上述引物由北京擎科新业生物技术有限公司武汉合成部合成。
本实验所有材料的InDel标记检测均采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法,实验涉及的样
品DNA提取、PCR反应和电泳试验由武汉基诺赛克科技有限公司完成。
2.精细定位InDel标记获得。
利用上述9个InDel标记检测505个F2单株的基因型,结合F2单株的表型将目标基因进一步缩小到9号染色体约700Kb的区间。在700Kb的区间内继续开发InDel标记并对交换单株进行检测,最终将绿色果皮底色基因定位在标记DS4和DS5之间,其中标记I_P5与绿色果皮底色性状紧密连锁,如图2所示。
上述与绿色果皮底色性状共分离的标记I_P5序列如下:
I_P5-F上游引物:5’-TGGGTTTGGATACCCATCTTATTAACTTG-3’;
I_P5-R下游引物:5’-TATTGGTAGAAATAGGGTTTATGAGATAAA-3’。
四、I_P5分子标记的验证。
以W-2-2(绿皮西瓜材料)为母本,以三白瓜(白皮西瓜材料)为父本,以上述W-2-2母本和三白瓜为父本进行杂交获取的F1代,F1代自交一代获得F2代群体。
F1代与父本三白瓜杂交获得BC1P2群体。利用I_P5标记对亲本W-2-2、亲本三白瓜、和包含25个单株的BC1P1群体进行验证,结果如表2所示。结果显示I_P5标记与位于西瓜9号染色体上的果皮底色调控基因紧密连锁,说明该InDel位点以及利用该InDel位点所设计的I_P5标记在鉴别西瓜果皮底色性状中有较高的利用价值,可以有效地运用于西瓜分子辅助育种。
本发明实施例还提供了一种利用前述的InDel分子标记鉴定苗期西瓜果皮底色的方法,包括以下步骤:
S1,DNA提取,并使用分子标记I_P5对群体单株的基因型进行分子检测;
S2,对检测结果进行分析:
若待测西瓜的核苷酸序列为序列表中的序列1,则待测西瓜果皮底色为绿色;
若待测膝盖的核苷酸序列为序列表中的序列2,则待测西瓜果皮底色为白色。
具体步骤如下:
1)基因组DNA提取。
采用CTAB(Paterson et al.1993)法提取上述BC1P2群体的单株DNA。
2)PCR扩增。
分别以步骤1)提取的基因组DNA为模板,采用I_P5-F和I_P5-R引物进行PCR扩增,分别得到PCR扩增产物。
上述PCR扩增反应的反应体系为:20μL含15mM MgCl2、2.5mM dNTPs和1U Taq DNA聚合酶的PCR预混液;2μL浓度为10mM PCR正、反向混合引物(上下游引物各0.5μL);2μL浓度为50ng模板DNA;PCR预混液购自北京擎科新业生物技术有限公司。
上述PCR程序::94℃2min;94℃10sec,58℃10sec,72℃10sec,共33个循环;72℃7min;4℃保存。
3)PCR扩增产物检测。
将上述PCR扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。
表2为亲本W-2-2、亲本三白瓜、25个BC1P2单株在I_P53标记第48位是否存在29bp的碱基插入,其中存在29bp碱基插入(+)的西瓜材料表现为绿色果皮,没有碱基插入(-)的为白色果皮。结果表明:25个BC1P2单株的果皮底色性状与I_P5标记检测结果完全一致,说明I_P5标记可以用于鉴定或辅助鉴定待测西瓜为白皮还是非白皮。
表2亲本W-2-2、三白瓜和25个BC1P2群体单株果皮底色鉴定结果(标记检测中+/+和+/-为绿皮,-/-为白皮)
实施例二
西瓜果皮底色的鉴定或辅助鉴定。
为进一步验证实施例1中的I_P5标记与西瓜果皮底色基因的连锁关系,利用50份自然群体进行验证。具体步骤如下:
一、供试材料
供试材料为20份西瓜自然资源群体,均为绿色果皮和白色果皮类型(详见表3);表3中各个供试材料均为湖北省农业科学院经济作物研究所瓜类课题组保存的种质资源材料。
表3 20份西瓜种质资源构成的自然群体单株材料及其单株果皮底色鉴定结果(标记检测中+/+和+/-为绿皮,-/-为白皮)
二、鉴定实验
使用实施例1获得的分子标记I_P5对西瓜果皮底色进行鉴定,包括以下步骤:
1)基因组DNA提取
采用CTAB(Paterson et al.1993)法提取上述自然群体的单株DNA。
2)PCR扩增
分别以步骤1)提取的基因组DNA为模板,采用I_P5-F和I_P5-R引物进行PCR扩增,分别得到PCR扩增产物。
上述PCR扩增反应的反应体系为:20μL含15mM MgCl2、2.5mM dNTPs和1U Taq DNA聚合酶的PCR预混液;2μL浓度为10mM PCR正、反向混合引物(上下游引物各0.5μL);2μL浓度为50ng模板DNA;PCR预混液购自北京擎科新业生物技术有限公司。
上述PCR程序::94℃2min;94℃10sec,58℃10sec,72℃10sec,共33个循环;72℃7min;4℃保存。
3)PCR扩增产物检测
将上述PCR扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。
I_P5对20份自然群体材料的检测结果显示18份材料在I_P5的第48位碱基处均有碱基插入。上述检测结果进一步证实了本发明的I_P5标记可以用于西瓜果皮底色的分子标记辅助育种。
实施例三
西瓜果皮底色的辅助选择。
使用实施例1获得的分子标记I_P5在白皮西瓜进行育种中的分子标记辅助选择,
包括以下步骤:
1)DNA提取:以白皮西瓜为供体亲本,其他果皮底色西瓜为受体亲本,进行杂交、回交,
获得分离群体,或者以白皮西瓜为供体亲本,其他果皮底色西瓜为受体亲本杂交、多代回交获得的代换系及其衍生品系,在苗期采用CTAB(Paterson et al.1993)法提取分离群体单株基因组DNA;
2)使用分子标记I_P5对上述群体单株的基因型进行检测;
3)对检测结果进行分析;
4)选择I_P5标记第48位存在29bp插入(+/+或+/-)的单株,这些单株的果皮底色为非白皮。
通过本发明的方法可在苗期鉴定或辅助鉴定西瓜果皮底色,可以减少西瓜育种的工作量,提高西瓜育种效率。
显然,本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样,倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内,则本发明也意图包括这些改动和变型在内。
Claims (7)
1.一种与西瓜果皮底色相关的InDel分子标记,其特征在于,所述分子标记为I_P5,位于西瓜基因组9号染色体上,其在绿色果皮底色西瓜中的核苷酸序列如序列1所示,在白色果皮底色西瓜中的核苷酸序列如序列2所示。
2.根据权利要求1所述的与西瓜果皮底色相关的InDel分子标记,其特征在于,绿皮材料相比白皮材料在序列的5’端起第48位碱基处存在29bp的插入,该插入位于西瓜基因组9号染色体,且位点插入29bp的西瓜果皮底色为绿色,所述InDel位点没有碱基插入的表现为白色。
3.一种用于检测如权利要求1或2所述的与西瓜果皮底色相关的InDel分子标记的引物对,其特征在于,所述引物对的特异性引物和扩增的目的片段长度如下:
正向引物序列为TGGGTTTGGATACCCATCTTATTAACTTG;
反向引物序列为TATTGGTAGAAATAGGGTTTATGAGATAAA,扩增长度为126bp或97bp。
4.一种基于权利要求1~2任一项所述的InDel分子标记在鉴定或辅助鉴定西瓜果皮底色中的应用。
5.一种利用权利要求1~2任一项所述的InDel分子标记鉴定苗期西瓜果皮底色的方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1,DNA提取,并使用分子标记I_P5对群体单株的基因型进行分子检测;
S2,对检测结果进行分析:
若待测西瓜的核苷酸序列为序列表中的序列1,则待测西瓜果皮底色为绿色;
若待测膝盖的核苷酸序列为序列表中的序列2,则待测西瓜果皮底色为白色。
6.根据权利要求5所述的鉴定苗期西瓜果皮底色的方法,其特征在于,所述DNA提取具体包括:
采用CTAB法提取待测西瓜材料的基因组DNA。
7.根据权利要求5所述的鉴定苗期西瓜果皮底色的方法,其特征在于,在步骤S1与S2之间还包括:
扩增目的片段:以待测西瓜材料基因组DNA为模板,利用上述引物对进行PCR扩增;
基因分型:利用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法鉴定所述InDel位点的碱基类型,所述InDel位点存在29bp插入的西瓜果皮底色为绿色,无碱基插入的西瓜果皮底色为白色;
PCR反应体系:2×PCR Mix 12.5μL、DNA 2.5μL、上游引物1.5μL、下游引物1.5μL;
PCR程序:94℃2min;94℃10sec,58℃10sec,72℃10sec,共33个循环;72℃7min;4℃保存。
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CN116426667A (zh) * | 2023-02-08 | 2023-07-14 | 广东省农业科学院设施农业研究所 | 用于苗期鉴定苦瓜果实颜色的InDel分子标记及其应用 |
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2022
- 2022-08-26 CN CN202211030196.XA patent/CN115369184A/zh active Pending
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN116426667A (zh) * | 2023-02-08 | 2023-07-14 | 广东省农业科学院设施农业研究所 | 用于苗期鉴定苦瓜果实颜色的InDel分子标记及其应用 |
CN116426667B (zh) * | 2023-02-08 | 2023-12-05 | 广东省农业科学院设施农业研究所 | 用于苗期鉴定苦瓜果实颜色的InDel分子标记及其应用 |
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