CN113151532B - 一个与黄瓜果实多心室性状紧密连锁的分子标记Indel-LNT-36 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一个与黄瓜果实多心室性状紧密连锁的分子标记，属于生物技术领域。黄瓜果实多心皮性状具有重要的育种价值。本发明通过研究开发了一个与黄瓜果实多心室性状紧密连锁的分子标记Indel‑LNT‑36。Indel‑LNT‑36标记引物在多心室黄瓜材料的基因组DNA中能扩增出105bp的PCR产物，而在三心室黄瓜材料的基因组DNA中能扩增出128bp的PCR产物。本发明公开的与黄瓜果实多心室性状紧密连锁的分子标记Indel‑LNT‑36，可用于黄瓜果实多心室性状的鉴定和分子标记辅助育种。

Description

一个与黄瓜果实多心室性状紧密连锁的分子标记Indel-LNT- 36

技术领域

本发明公开了与黄瓜果实多心室性状紧密连锁的分子标记Indel-LNT-36，属于蔬菜分子遗传育种技术领域，可用于黄瓜果实多心室性状的鉴定及分子标记辅助选择育种，以提高育种效率。

背景技术

黄瓜(Cucumis sativus L.2n＝2x＝14)是葫芦科甜瓜属一年生蔓生草本植物，是重要的蔬菜作物，其果实的外观性状与经济价值密切相关。心室数目是影响果实外观品质的重要因素，在同一物种内，心室数目增加通常伴随着果实直径的增大和果实单果重的增加，从而导致了果实形状、大小的变化，影响着消费者的选择；同时，对种子数也有一定的影响。不同黄瓜品种间因心室数目的不同而使得其外形产生很大差异，因此，对心室数目的研究对黄瓜外观性状的改良具有重要意义。

近年来，分子标记技术的快速发展，使得许多研究者在DNA水平上利用与目标性状或基因紧密连锁的分子标记对种质资源进行辅助选择，这一方法不受基因表达和环境条件的影响，可在早代进行快速准确选择，加快了育种进程。其中，InDel(Insertion/Deletion)分子标记是基于双亲全基因组重测序差异而开发的标记，因其在基因组内分布广、密度大、稳定性和多态率高、重复性好、对DNA质量要求较低检测容易且具有共显性遗传等众多优点成为分子标记开发的理想来源，可高效准确地用于构建遗传连锁图谱和重要经济性状遗传定位的研究，从而参与分子标记辅助育种。目前，已经获得了与黄瓜果长、果皮颜色、果刺、瓜把长以及抗病等性状紧密连锁的分子标记；然而，关于黄瓜果实心室数目性状遗传规律及定位也有部分研究。Li等人发现一个具有多心皮性状的黄瓜栽培品种True Lemon，通过遗传定位鉴定到了一个多心皮的候选基因CsCLV3(Li S，PanY P，Wen C L，etal.Integrated analysis in bi-parental and natural populations revealsCsCLAVATA3(CsCLV3)underlying carpel number variations in cucumber[J].Theoretical and Applied Genetics，2016，129(5)：1007-1022.)。本研究团队发现生长于云南省的我国特有的黄瓜变种西双版纳黄瓜，具有优异的多心室性状，因此该黄瓜材料具有较大的果实横径和单果重，通过遗传定位我们发现了控制黄瓜多心室的主效QTL位点(张开京，宋慧，薄凯亮，李季，马政，娄群峰，钱春桃，陈劲枫.西双版纳黄瓜多心室性状的QTL定位[J].中国农业科学，2015，48(16)：3211-3220)，而且发现该位点与Li等人发现的Ture Lemon多心皮位点存在显著不同，是一个新的多心室基因。但由于前期研究尚属于初步定位，与西双版纳黄瓜多心室性状连锁的分子标记还存在较远的遗传距离，这些连锁标记存在对多心室性状选择效率过低的问题，在分子标记辅助育种过程中会有较大概率出现性状丢失的情况。

在上述西双版纳黄瓜多心室性状初定位的基础上，我们开展了基因的进一步精细定位研究。以华北型的3心室黄瓜‘CC3’为母本和5心室的西双版纳黄瓜‘SWCC8’为父本，构建了杂交群体，并进一步通过单粒传的方法构建了含有124个单株的RIL9群体。利用已有的连锁图，结合RIL9群体2020秋心室性状统计结果，对西双版纳黄瓜心室数目性状重新进行初定位；接着，结合双亲重测序数据，在初定位区间内开发Indel标记，进一步缩短初定位区间，实现精确定位，鉴定了与黄瓜多心室性状紧密连锁的Indel标记，开发了更为精细，距离选择黄瓜多心室主效QTL距离更近，选择率更高的黄瓜多心室性状的连锁分子标记。该标记可用于黄瓜果实多心室性状的鉴定及分子标记辅助选择育种，对黄瓜外观品质性状的选择育种具有重要的应用价值。

发明内容

(一)技术问题

本发明提供一个与黄瓜果实多心室性状紧密连锁的分子标记，目的是应用这个标记进行黄瓜果实多心室性状的鉴定及分子标记辅助育种，加速育种进程，同时可为黄瓜外观品质的改良提供借鉴意义。

(二)技术方案

本发明提供的一个与黄瓜果实多心室性状紧密连锁的分子标记的特征在于：有一个Indel标记与黄瓜果实多心室性状紧密连锁，所述Indel分子标记引物为下列引物对，

Indel-LNT-36：正向引物：5′-TGATCAGTGTTGATTCACAAA-3′，

反向引物：5′-TGAAACATCAGTAAAACGTCA-3′。

上述引物用于鉴定黄瓜种质材料果实多心室性状的分子标记方法为：

(1)提取待测黄瓜样品的基因组DNA。

(2)将所述的分子标记引物Indel-LNT-36加入PCR反应体系，并对待测黄瓜样品的DNA进行PCR扩增；

PCR扩增反应体系为：PCR扩增反应的总体系为10μl，包括：2×Taq Master Mix5.0μL，ddH2O 2.0μL，正、反向引物各1.0μL，DNA 1.0μL(50ng/μL)。反应程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，26个循环；72℃终延伸10min，4℃保存。

(3)PCR扩增产物检测；

将扩增产物(1.2μL)上样于7％非变性聚丙烯酰胺凝胶中；接通电极，210V恒定电压下电泳1h 15min，关闭电源；取下凝胶，银染显色。含有105bp条带的认为是多心室黄瓜植株，而含有128bp的则为3心室黄瓜植株，F1同时含有两条带。

(三)有益效果

(1)通过筛选获得一个与黄瓜果实多心室性状紧密连锁的分子标记Indel-LNT-36，为黄瓜果实多心室性状的分子标记辅助选择育种以及候选基因的克隆、功能鉴定奠定了基础。利用本发明与黄瓜果实多心室性状紧密连锁的分子标记，进行黄瓜果实多心室性状的鉴定，在RIL9群体中15个多心室和15个3心室材料选择效率均为100％，可广泛应用于黄瓜果实多心室性状的分子标记辅助选择育种。

(2)通过本发明分子标记定位的基因位点精确，操作简单，鉴定方便。由于这个标记与黄瓜果实多心室性状紧密连锁，因此，在苗期就可以提取DNA，采用上述的分子标记预测黄瓜果实的多心室性状，有效解决了这黄瓜果实多心室这一表型鉴定的费时费力、成本高、难度大等问题，大大缩短了育种进程。

附图说明

图1：黄瓜‘CC3’和‘SWCC8’果实横切图和心室数目的频率分布图(2020秋RIL9群体)。

图2：黄瓜果实多心室主效QTL位点的初定位结果。

利用含有124个单株的RIL₉群体对黄瓜果实心室数目性状进行初定位，结果仅定位到1号染色体上的一个初定位区间(ln1.1)；白色框表示初定位区间。

图3：黄瓜果实多心室主效QTL精细定位结果。

标记加密后缩短的心室数目主效QTL区段及标记Indel-LNT-36在染色体上的位置。

注：黑色实心圆点表示峰值位置。

图4：引物Indel-LNT-36检测结果。

用黄瓜材料双亲(3心室亲本CC3为P₁，多心室亲本SWCC8为P₂)、F₁、RIL₉分离群体中多心室表型和3心室表型植株的DNA作为模板，用本发明中的标记引物Indel-LNT-36F、Indel-LNT-36R进行PCR扩增，结果显示在黄瓜3心室亲本(泳道2)和RIL群体3心室材料(泳道5-19)中扩增出128bp的条带，而在黄瓜多心室亲本(泳道4)和RIL群体多心室材料(泳道20-34)中扩增出105bp的条带。

注：泳道1：Marker(500bp)；泳道2：P₁，CC3；泳道3：F₁；泳道4：P₂，SWCC8；泳道5-19：RIL分离群体中15个3心室材料；泳道：20-34：RIL分离群体中15个多心室材料；泳道35：Marker(500bp)。

具体实施方式

黄瓜果实多心室性状紧密连锁的分子标记，是通过以下方法获得的：

1、西双版纳黄瓜多心室性状的精细定位

利用华北型黄瓜‘CC3’为母本和西双版纳黄瓜‘SWCC8’为父本，通过单粒传代法获得含有124个株系的RIL₉群体。2020年秋季，对124个株系进行黄瓜果实心室数目性状的统计，心室数目呈连续分布状态，说明黄瓜果实心室数目为多基因控制的数量性状(图1)。利用已有的连锁图谱，完成了黄瓜果实多心室性状的初步定位。结果显示仅定位到1号染色体上的一个初定位区间ln1.1，位于引物SSR01816和SSR04805之间，可解释的表型变异为14.33％(＞10％)，为主效QTL位点(图2)。在此基础上，通过双亲重测序数据在初定位区间内开发了20对Indel标记缩小初定位区间，用Joinmap4.0重新构建连锁图，结合Win QTLCartographer v2.5软件重新进行定位，结果将主效QTL区段缩小到0.9cM区间内，其中标记Indel-LNT-36处的LOD值最大，为6.14，是该区间的峰值标记(图3)。因此，认为Indel-LNT-36与黄瓜果实多心室性状紧密连锁。

2、与黄瓜果实多心室性状紧密连锁的分子标记引物的设计

在上述分子标记连锁图谱构建和黄瓜果实多心室性状的遗传定位研究中，分子标记Indel-LNT-36与其主效QTL紧密连锁。该标记引物是通过双亲全基因组重测序，利用SAMTOOLS软件检测长度小于50bp的小片段插入与缺失位点，并根据该位点上下游200bp的序列，用Premier 5.0软件设计而成。

标记Indel-LNT-36引物序列为：

Indel-LNT-36-F：5′-TGATCAGTGTTGATTCACAAA-3′，

Indel-LNT-36-R：5′-TGAAACATCAGTAAAACGTCA-3′。

3、Indel-LNT-36标记引物在黄瓜CC3×SWCC8 RIL₉分离群体中的选择效率

利用标记引物Indel-LNT-36在双亲、F₁和30个RIL₉分离群体单株中进行PCR扩增检测。结果表明：多心室亲本CC3和RIL分离群体中的多心室单株的扩增产物为105bp的特异条带，而在3心室亲本SWCC8和RIL分离群体中的3心室单株中扩增出128bp的特异条带(图4)。

PCR扩增反应体系为：PCR扩增反应的总体系为10μl，包括：2×Taq Master Mix5.0μL，ddH₂O 2.0μL，正、反向引物各1.0μL，DNA 1.0μL。反应程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，26个循环；72℃终延伸10min，4℃保存。PCR产物检测：反应产物在7％的非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳(210V恒定电压)，硝酸银染色。

Claims (5)

1.一种辅助鉴定华北型黄瓜CC3和西双版纳黄瓜SWCC8及其后代的果实心室数目等于3或者大于3的分子标记Indel-LNT-36，其特征在于：所述分子标记引物为下列引物对(5′→3′)，

正向引物：5′-TGATCAGTGTTGATTCACAAA-3′，

反向引物：5′-TGAAACATCAGTAAAACGTCA-3′。

2.一种辅助鉴定华北型黄瓜CC3和西双版纳黄瓜SWCC8及其后代的果实心室数目等于3或者大于3的分子标记方法，其特征在于：以待鉴定黄瓜材料的DNA作为模板，用权利要求1所述的分子标记Indel-LNT-36的引物对进行PCR扩增；对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离分析，扩增出105bp特异性条带的黄瓜植株为具备果实心室数目大于3的植株，而扩增出128bp条带的黄瓜植株为果实心室数目等于3的植株。

3.根据权利要求2所述的分子标记方法，其特征在于，所述的分子标记方法包括：

(1)以待鉴定黄瓜材料的DNA为模板，用权利要求1所述的分子标记Indel-LNT-36的引物对进行PCR扩增；PCR扩增反应的总体系为10μL，包括：2×Taq Master Mix 5.0μL，ddH2O2.0μL，正、反向引物各1.0μL，DNA 1.0μL(50ng/μL)；反应程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，26个循环；72℃终延伸10min，4℃保存，PCR产物检测：PCR产物在7％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色；

(2)标记引物Indel-LNT-36鉴定：果实心室数目大于3的植株能扩增出105bp的特异性条带，果实心室数目等于3的植株扩增出128bp的特异性条带。

4.权利要求1所述的分子标记在华北型黄瓜CC3和西双版纳黄瓜SWCC8果实心室数量性状的分子标记辅助选择育种中的应用。

5.权利要求1所述的分子标记在华北型黄瓜CC3和西双版纳黄瓜SWCC8及其后代果实心室数量性状鉴定中的应用。

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