CN114540411B - CsMLO基因在提高黄瓜花瓣数和心室数中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及CsMLO基因在提高黄瓜花瓣数和心室数中的应用。目的是提供一种通过CRISPR/Cas9基因编辑技术编辑黄瓜花瓣数和心室数CsMLO基因，通过农杆菌介导的遗传转化的方法获得转基因植株的方法。随后通过连续两代自交，分离获得不含Cas9的mlo多突变体，对T2代突变体调查表型，发现CsMLO基因可以影响黄瓜花瓣数目以及心室数。CsMLO多突变体中花瓣数目增加，果实心室数目增多。

Description

CsMLO基因在提高黄瓜花瓣数和心室数中的应用
技术领域
本发明涉及转基因植物新品种培育领域。
背景技术
黄瓜是世界范围内栽培的葫芦科蔬菜作物，单性花(Bai et al.,2004)。在野生黄瓜种群 中，心室数可以从二到七不等。大多数栽培黄瓜结圆柱形果实，一般有三个心室(Liet al., 2016)。心室数量的增加通常伴随着果实直径的扩大从而影响黄瓜果实的形状、大小和内在 品质等重要性状(Li et al.,2016)。而黄瓜心室数与花瓣数目是密切相关的。因此随着人们对 食品产量要求的提高，多花瓣、多心室品种培育成为提高产量的首选方法。目前黄瓜控制 花瓣、心室的基因研究相对匮乏，还需发掘相关基因。
MLO蛋白是植物特有的一类蛋白家族，目前已经在植物中发现众多MLO基因家族成员,但大多数MLO蛋白的功能仍然未知。MLO基因最早在大麦中发现，此基因的突变可 以使大麦产生持久、广谱、高效的白粉病抗性(Kusch and Panstruga et al.,2017)。通过GUS染色实验发现大多数植物第III分支上MLO基因都在拟南芥发育器官表达(Chen et al.,2006)，水稻中也发现OsMLO12基因是花粉粒与亲和性柱头接触后的花粉水合作用所必 需的(Yi et al.,2014),由此可见第III分支上的MLO蛋白可能是调节被子植物受精过程中配子体功能的重要因素。第I分枝上的AtMLO4和AtMLO11基因突变会导致拟南芥根部 的异常形态(Chen et al.,2009)。目前，对于CsMLO基因对花瓣数和心室数的影响还没有 相关报道，有待于研究发现。
目前，基因编辑技术和转基因研究中通常使用CRISPR/Cas9技术，即CRISPR/Cas9(clustered regularly inters paced short palind romicrepeats/CRISPR-associatednuclease 9， Cas9)。CRISPR/Cas9技术是基于广泛存在于细菌及古细菌中的一种获得性免疫防疫机制， 后期经由人工改造开发而建立，通过导向RNA序列在靶标基因特定位点进行切割引起 DNA双链断裂，进而诱发细胞内的非同源末端修复，造成碱基缺失、插入，进而实现基因 功能敲除的目的。该技术使用方便，操作简单，成本低，为基因组定向改造、调控与应用 等带来突破性革命。CRISPR/Cas9基因编辑技术作为一项高效的植物遗传改良和分子育种 研究的分子操作技术手段，其成本低、操作简单、突变诱导率高，应用前景十分广阔。
发明内容
在黄瓜中，被报道且被应用的花瓣数、心室数控制基因并不多。MLO基因家族成员之 间存在功能冗余性，敲除CsMLO基因家族第I，II，VI分支所有成员可获得花瓣数，心室数增多黄瓜材料。本申请对CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO6、CsMLO7、 CsMLO9、CsMLO10基因的表达和功能进行深入研究，解析黄瓜花瓣数、心室数增多的分 子机制，为培育具有多花瓣、多新皮的黄瓜研究奠定基础。
本发明的目的是提供一种通过CRISPR/Cas9基因编辑技术编辑黄瓜花瓣数和心室数 CsMLO基因，通过农杆菌介导的遗传转化的方法获得转基因植株的方法。所获得的转基因黄瓜中花瓣数目增加，果实心室数目增多，能够提高黄瓜产量。
本发明为解决现有技术中的技术问题，所采用的技术方案具体如下：
一种高产量黄瓜品种的制作方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对黄 瓜的CsMLO基因进行编辑，使得黄瓜的花瓣数和心室数增多。
进一步，编辑的CsMLO基因具体为CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO6、CsMLO7、CsMLO9、CsMLO10，其对应的DNA序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、 SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8 所示。
进一步，编辑的CsMLO基因具体为CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO9、CsMLO10，其对应的DNA序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。
进一步，对CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO6、CsMLO7、CsMLO9、 CsMLO10进行编辑的方式为：通过将CsMLO2自5′末端第1–1755位碱基、CsMLO3自5′ 末端第1–1431位碱基、CsMLO4自5′末端第1–1710位碱基、CsMLO5自5′末端第1–1617 位碱基、CsMLO6自5′末端第1–1671位碱基、CsMLO7自5′末端第1–1707位碱基、CsMLO9 自5′末端第1–1626位碱基、CsMLO10自5′末端第1–1551位碱基所示的DNA序列中缺失 一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到。
进一步，对CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO9、CsMLO10进行编 辑的方式为：通过将CsMLO2自5′末端第1–1755位碱基、CsMLO3自5′末端第1–1431 位碱基、CsMLO4自5′末端第1–1710位碱基、CsMLO5自5′末端第1–1617位碱基、CsMLO9 自5′末端第1–1626位碱基、CsMLO10自5′末端第1–1551位碱基所示的DNA序列中缺失 一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到。
进一步，对CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO9、CsMLO10进行编 辑的方式为：将CsMLO2的第535-558位碱基缺失，在CsMLO3的538位后插入22个碱 基，将CsMLO4的第401-419位碱基缺失，将CsMLO5的第512位碱基缺失，将CsMLO9 的第337位碱基插入一个碱基，将CsMLO10的第516位碱基缺失。
进一步，对黄瓜的CsMLO基因编辑的具体方法如下：
针对CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO6、CsMLO7、CsMLO9、CsMLO10 基因的外显子区域设计sgRNA；
将CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO6、CsMLO7、CsMLO9、CsMLO10 基因的sgRNA合成为一个表达元件组，并将该表达元件组插入到pBCG403载体中，到八 靶载体；
将八靶载体转化到农杆菌EHA105中；
利用转化有八靶载体的农杆菌EHA105侵染CU2黄瓜种子，得到转基因黄瓜植株T0代；
转基因黄瓜植株T0代自交得到T1代，T1代自交留种分离获得不含Cas9非转基因多突变体，即得到高产量黄瓜品种。
进一步，八个sgRNA靶点的核苷酸序列分别为：
CsMLO2：CTCTACAGTGTTCTCACCA
CsMLO3：TTTGCAGAGGCTAGAAGCA
CsMLO4：TGGCTAATTCGAAGATCAT
CsMLO5：CCCTGGCTATGATTAAGGT
CsMLO6：GTGCTCTTCCGCATCAATG
CsMLO7：TATTCAACGGTGAGCTCTA
CsMLO9：TGACAATTCATCCGAGGAA
CsMLO10：TGTCACGTGGACGATAGCT。
进一步，表达元件组的序列如SEQ ID NO.9所示。
检测CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO6、CsMLO7、CsMLO9、CsMLO10 编辑情况的PCR引物如下：
一种提高黄瓜产量的方法，其特征在于，种植上述方法培育的黄瓜品种。
一种重组质粒载体，其特征在于，将序列如SEQ ID NO.9所示的表达元件组，插入到 pBCG403质粒得到。
本发明还涉及CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO9、CsMLO10在调 控黄瓜花瓣数和心室数中的应用。
有益效果
本发明构建了CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO6、CsMLO7、CsMLO9、 CsMLO10基因的CRISPR/Cas9表达载体，并将其通过农杆菌介导的遗传转化导入CU2黄 瓜种质中。为了便于对转基因植物细胞或植株进行鉴定及筛选，在所用植物表达载体中加 入了表达绿色荧光蛋白的GFP基因、草甘膦抗性标记等。经过稳定遗传转化后成功地获得 了转基因T0代，T0自交得到T1代，T1代自交留种分离获得不含Cas9非转基因多突变体， 对T2代多突变体进行表型统计调查，发现CsMLO基因可以影响黄瓜花瓣发育和心室发育。 Csmlos突变体中花瓣的数目增加，果实的心室数目增多。
本发明在设计实验方案前，预测的是CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO6、CsMLO7、CsMLO9、CsMLO10等八个基因同时调控黄瓜花瓣发育和心室发育。 因此，实验中针对CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO6、CsMLO7、CsMLO9、 CsMLO10等八个基因均涉及sgRNA，拟对八个基因同时进行编辑处理，但实际实验结果 中，基因编辑的结果与预期不完全一致，CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO9、 CsMLO10等6个基因被成功编辑，产生突变体。而CsMLO6为同义突变，CsMLO7未产 生突变。实验结果虽与预期不完全一致，但申请人却意外发现CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、 CsMLO5、CsMLO9、CsMLO10等6个基因的突变，即成功的增加黄瓜花瓣数和心室数。 这一意外发现，使得我们以后进行黄瓜转基因育种时的靶标基因可以从8个减小为6个， 如此，则育种过程中的实验设计及培育难度也将大幅降低。
本发明实验结果说明CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO9、CsMLO10 基因编码的蛋白质确实在黄瓜花瓣中发挥着重要的作用。对CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、 CsMLO5、、CsMLO9、CsMLO10基因的表达和功能进行深入研究提供了一定的借鉴意义。
目前社会对粮食的需求日益提高，高质量、高产量品种培育成为缓解粮食危机的首选 方法。果实质量又与花瓣数和心室数有关，本发明利用基因编辑技术和转基因的方法定点 敲除CsMLO基因，可以大大缩短育种年限。
附图说明
图1为CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO6、CsMLO7、CsMLO9、 CsMLO10基因sgRNA表达元件组。
图2为转基因黄瓜T2代八个靶标位点编辑情况。
图3为野生型与Csmlos多突变体植株中花瓣与心室数目统计结果。(a)为野生型与突 变体植株雄花花瓣表型，(b)为野生型与突变体植株雌花花瓣表型，(c)为野生型与突变体植 株果实心室表型，(d)为野生型与突变体植株雄花花瓣数目(MPn)统计结果；(e)为野生型 与突变体植株雌花花瓣数目(FPn)统计结果。图中(a)、(b)与(c)标尺均为1cm。
具体实施方式
以下将结合附图对本发明各实施例的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述 的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明的实施例，本 领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发 明所保护的范围。
一、转基因黄瓜植株的获得
本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑技术编辑黄瓜花瓣数和心室数CsMLO基因，通过农杆菌介导的遗传转化的方法获得转基因植株。制备转基因黄瓜的具体步骤如下所示：
(一)八靶载体的构建及农杆菌转化
1.设计sgRNA
本发明所提供的黄瓜花瓣相关蛋白名为CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO6、CsMLO7、CsMLO9、CsMLO10，来源于葫芦科、黄瓜属、黄瓜(Cucumis sativus L.)。对应的DNA序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、 SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。
利用基因组设计与分析软件Geneious软件选择CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、 CsMLO5、CsMLO6、CsMLO7、CsMLO9、CsMLO10基因 (Cucumber(Chinese Long)v3 Genome)的外显子区域设计sgRNA：sgRNA序列具有 5′-(N)20-NGG-3′结构(N表示A、G、C、T四种碱基中的任意一个)，且GC含量在40％-70％ 之间。
根据CRISPR/cas9技术设计靶位点的原则，设计黄瓜CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO6、CsMLO7、CsMLO9、CsMLO10基因的sgRNA序列如下：
CsMLO2：CTCTACAGTGTTCTCACCA
CsMLO3：TTTGCAGAGGCTAGAAGCA
CsMLO4：TGGCTAATTCGAAGATCAT
CsMLO5：CCCTGGCTATGATTAAGGT
CsMLO6：GTGCTCTTCCGCATCAATG
CsMLO7：TATTCAACGGTGAGCTCTA
CsMLO9：TGACAATTCATCCGAGGAA
CsMLO10：TGTCACGTGGACGATAGCT
2.构建八靶载体
由金唯智公司合成包括CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO6、CsML O7、CsMLO9、CsMLO10基因的sgRNA表达元件组，通过BsaI酶切位点将该表达元件组 与pBCG403载体进行拼接，即得到八靶载体质粒。八靶载体质粒的结构示意图如图1所示， 为了便于对转基因植物细胞或植株进行鉴定及筛选，在所用植物表达载体中加入了表达绿 色荧光蛋白的GFP基因、草甘膦抗性标记等。
表达元件组序列如下：如SEQ ID NO.9所示
3.转化农杆菌
将金唯智公司返回的构建成功的八靶载体质粒转入农杆菌EHA105中，为黄瓜稳定遗 传转化作准备。将八靶载体质粒转入农杆菌EHA105的步骤如下：
取100μL EHA105农杆菌感受态细胞，向其中加入2μL八靶载体质粒，轻弹混匀后冰浴5min，放入液氮中冷冻1min，接着迅速将其置于37℃水浴锅中水浴5min，随后 在超净工作台中加入800μL LB培养基，混匀后将其放在28℃、220rpm摇床上培养2 h。之后12000rpm离心1min富集菌液，弃上清，加入200μL LB液体培养基重悬菌体， 混匀后将其均匀涂布在LB+kana平板培养基中，28℃暗培养2d。之后在平板培养基上挑 农杆菌单克隆菌斑，用LB+kana+rif液体摇菌12h，即获得含有八靶载体质粒的EHA105 农杆菌。将菌液置于-80℃超低温冰箱中保存备用。
(二)黄瓜稳定遗传转化
取数粒CU2黄瓜种子55℃温汤浸种30min后除去种皮，在超净工作台中，用75％的酒精清洗种子30s，接着用0.3％的次氯酸钠溶液浸泡种子15min，最后使用无菌水冲洗 种子5次。将消毒完毕的种子转移至种子萌发培养基M0上。放置于28℃培养箱中暗培养 24h，即可切取外植体。
在30mL的LB+kana+rif液体培养基中加入10μL农杆菌菌液，置于28℃、220rpm 摇床中过夜培养。当菌液OD600＝0.4-0.8时，6000rpm离心8min收集菌体；用M1液体 培养基(即不加植物凝胶的M1培养基)重悬菌体并调整OD600至0.2。在超净工作台中， 将萌发的种子切去远端部分子叶并去掉胚轴，同时将两片子叶分开，从而得到外植体。将 准备好的外植体放入重悬好的菌液中，用功率100W的水浴超声波处理30s。之后将外 植体和重悬液加入20mL注射器的针筒中，推动活塞至10mL刻度处，用橡胶皮塞密封 注射器头部针孔，拔动活塞至20mL刻度处，保持1.5min后使活塞回到10mL刻度处。 之后再次重复施加真空负压。侵染结束后，用滤纸吸干外植体表面菌液，再将外植体转移 到垫有一层滤纸的共培养培养基M1上。放置在23℃，黑暗条件下共培养4天。在荧光体 式显微镜下观察GFP的发光情况，以评估侵染效率。
在超净工作台中，用无菌水清洗7-8次共培养后的外植体，后用灭菌吸水纸吸干其表 面液体，再将外植体斜插于恢复培养基M2上，恢复培养7天后换至分化培养基M3上，1 4d后继代一次。在荧光体式显微镜下挑选含有GFP荧光芽的子叶。继代到生根培养基M 4组培瓶中，培养至生根。将生根良好的转基因黄瓜植株移栽到灭菌基质中，在生长室中 炼苗蹲苗一个月，在人工气候室中培养至开花，通过两代自交分离获得不含Cas9的T2代 转基因黄瓜植株。
其中，所使用的培养基成分如下：
M0培养基成分：MS 4.43g/L+蔗糖30g/L+植物凝胶3g/L+6BA 2mg/L+ABA 1mg/ L，pH为5.6-5.8；
M1培养基成分：MS4.43g/L+蔗糖30g/L+植物凝胶3g/L+6BA 2mg/L+ABA 1mg/ L+AS80mg/L+MES 2.5mM，pH为5.6-5.8；
M2培养基成分：MS 4.43g/L+蔗糖30g/L+Agar 8g/L+6BA 2mg/L+ABA 1mg/L+TM T200mg/L，pH为5.6-5.8；
M3培养基成分：MS 4.43g/L+蔗糖30g/L+植物凝胶3g/L+6BA 2mg/L+ABA 1mg /L+PPT 2mg/L+TMT 200mg/L，pH为5.6-5.8；
M4培养基成分：MS 4.43g/L+蔗糖30g/L+Agar 8g/L+TMT 200mg/L。
二、转基因黄瓜植株的DNA提取与检测
(一)转基因黄瓜植株DNA提取
使用CTAB法提取T2代转基因黄瓜植株的叶片DNA。具体步骤如下：取大约0.2-0.5g黄瓜叶片于2mL离心管中，放入干净的钢珠，加入1mL 2％CTAB溶液，放置在磨样 机中50Hz、30s研磨至粉末。将磨好的样品放置在65℃的水浴中处理1h，水浴期间倒转 离心管数次。之后25℃，12000rpm离心10min。取上清液(约800μL)至新的2mL离 心管中，在通风橱中加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)并混匀，4℃，12000rpm离心15min， 得到约600μL的上清液，取一个新的2mL离心管，加入上清液两倍体积(约1.2mL)-20℃ 预冷的无水乙醇，后小心吸取上清液加入其中，充分静置至出现白色团状沉淀，在4℃冷 冻离心机中10000g离心2min,倒掉上清，用70％的乙醇冲洗两次，再用无水乙醇冲洗一 次，之后用枪头吸走液体，放在超净工作台中晾干。加入约50μL ddH2O溶解DNA，37℃ 孵育1h。将得到的DNA置于-20℃冰箱中保存备用。
(二)转基因黄瓜植株基因编辑位点检测
针对CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO6、CsMLO7、CsMLO9、Cs MLO10基因八个靶点区域设计PCR检测的引物MLO2-cexu-F、MLO2-cexu-R，MLO3-ce xu-F、MLO3-cexu-R，MLO4-cexu-F、MLO4-cexu-R、MLO5-cexu-F、MLO5-cexu-R，ML O6-cexu-F、MLO6-cexu-R，MLO7-cexu-F、MLO7-cexu-R、MLO9-cexu-F、MLO9-cexu-R，MLO10-cexu-F、MLO10-cexu-R。具体引物序列如下表所示：
引物名称 引物序列(5′-3′)
MLO2-cexu-F GGTGGAATGAATCAACTCAACAATTTC
MLO2-cexu-R CACTCATGGTTATTCTGTGGTTGAAG
MLO3-cexu-F GGAAGCATTGCATCAGCTCCA
MLO3-cexu-R CGTAGGTTGGCGCTTATCAATAGA
MLO4-cexu-F CTCAACCGATGAAGACGAACATC
MLO4-cexu-R CCTTCCAAGTGTCATTGTGATAACAC
MLO5-cexu-F AGAGCAGCTTCATCGACTAATATTCG
MLO5-cexu-R GTTTCGAATGGCCAAAGCCTTAG
MLO6-cexu-F CTGCTTGAAAGTTCTCTATTGTCTCA
MLO6-cexu-R GTGAAGTTGTTCAAGTCCCTCATATG
MLO7-cexu-F CCAGATCCACAGTTGGAGAGAAT
MLO7-cexu-R CTGGAACCTGACATTATGGCTG
MLO9-cexu-F ACTCCATGCACCAGAGCTGA
MLO9-cexu-R GCTCATAACCCTGCATAACGAG
MLO10-cexu-F GCTATCTCTTGAAGCATTGCATCATC
MLO10-cexu-R CCCAATGCTTCCACTGGCG
用提取的转基因黄瓜植株DNA为模板，利用引物MLO2-cexu-F、MLO2-cexu-R，MLO3-cexu-F、MLO3-cexu-R，MLO4-cexu-F、MLO4-cexu-R、MLO5-cexu-F、MLO5-cexu-R， MLO6-cexu-F、MLO6-cexu-R，MLO7-cexu-F、MLO7-cexu-R、MLO9-cexu-F、MLO9-cex u-R，MLO10-cexu-F、MLO10-cexu-R对包含CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、 CsMLO6、CsMLO7、CsMLO9、CsMLO10基因八个靶点区域进行扩增，得到8个长度约 300bp的片段。PCR反应体系与条件如下：
琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。具体步骤如下：称取0.5g琼脂糖粉末倒入锥形瓶中， 加入25mL 1×TAE溶液，微波炉加热至琼脂糖全部融化。将内槽水平放置并插入梳子，待琼脂糖凝胶液冷却到65℃左右后倒入内槽玻璃板上。室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直拔掉梳子即配制成2％琼脂糖凝胶。将凝胶和内槽放入电泳槽中，用10μL微量移液器 将DL 2000DNA Marker(作为对照)与上述PCR扩增产物加入胶板的小槽内。加样后 进行电泳，电压设为100V。电泳完毕后取出凝胶，用荧光核酸凝胶染色溶液染色20min 左右，利用凝胶成像仪紫外显影，可观察到扩增的片段在300bp处有一条明亮的条带，说 明已成功扩增出了目的片段。
进一步利用该扩增产物检测转基因黄瓜植株的编辑类型。通过琼脂糖凝胶电泳的方式 对PCR扩增产物进行回收，将回收后的PCR产物送至测序公司进行基因测试。用Geneious软件对测序序列进行分析，发现CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO6、 CsMLO9、CsMLO10基因被成功编辑，而CsMLO7基因可能由于选择的靶位点打靶效率 较低，在T2代仍处于杂合状态。CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO9、C sMLO10基因功能缺失的等位基因型相对于野生型表现为隐性，CsMLO6为同义突变。本 发明所获得的3个突变体植株的靶标基因处的基因序列如图2所示。
三、Csmlos多突变体黄瓜植株的花瓣及果实心室数目的鉴定
为了挖掘调控黄瓜花瓣数和心室数目的关键基因，我们将野生型和Csmlos多突变体 随机种植在大棚中，之后田间调查野生型和Csmlos多突变体的花瓣及果实心室数目。具体如下：在黄瓜苗大于25节后，开始统计当天开放雄花与当天开放雌花的花瓣数目，其 中雄花花瓣数目统计5天，雌花花瓣数目统计全生育期；对野生型与突变体黄瓜分别进行 单株自交，果实成熟后剖开统计心室数目。
试验结果如图3所示，WT为野生型黄瓜，mut为Csmlos多突变体黄瓜。调查发现： 野生型黄瓜花瓣数目多为五瓣，突变体中六瓣花、七瓣花、八瓣花比例明显增高；野生型 黄瓜果实多为三心室，突变体中四心室黄瓜果实数目增多。
综上所述，本发明挖掘了调控黄瓜花瓣数和心室数目的关键基因，通过对CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO9、CsMLO10基因的编辑，可使黄瓜植株的花瓣数 及果实心室数目增多。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任 何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发 明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> CsMLO基因在提高黄瓜花瓣数和心室数中的应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1755
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggccgccg cagccttaga tccttcctct ctccaattca cctctacttg ggctgtagct 60
gctgtttgtt tcttcttcat ctccctctct ttattcctcg aacatttaat tcatctcctc 120
tccaattggt tgaagcggaa gaggaaagca gcattgttcg aagcggtaga gaagctaaaa 180
tcagtattga tgcttctagg gttcatgtcg ctaactctga cggtaactca acaacctgta 240
tctaagattt gtattccgaa tagcgtggcg tatacgatgc ttccgtgcca gagagaaata 300
cagatcacgg cgagtaagaa tttggagatg gataaattcc aatcaaacca gtcgttttca 360
tggttgccgg agaaagttga gagcagtagt agtaacagcg attcttcttc ttcttcttca 420
tcttcatctt cggattactg tactgcgaag gggaaagcgt cactgatgtc gcaaggtgga 480
atgaatcaac tcaacaattt catatttgtg ttggctgtta tgcagattct ctacagtgtt 540
ctcaccatgg cattgggaag agctaagatg aggcgttgga aagcttggga ggaagaaact 600
aatacgttgg attatcaagt ggccaatgat ccaaatcgtt ttagactgac aaggcaaacg 660
acatttggac gtcggcacat cagttcctgt gcaacaccat catttcttct ttggagtata 720
tgcttcttca gacagttctt tcgttctgta gccaaagttg actacttgac ccttcgccat 780
ggtttcatct cgactcatgt acctggaaac acttccttca acttccaaaa gtacattgaa 840
agatcattac acgatgattt caaagtcgtc gttggcatca gtcctttcat gtggctcata 900
gttgtcatct tcattctagt ggatgtacat ggctggaatg catatctctg ggtgtctttc 960
cttccactca ttatagtgtt ggctcttgga acaaagtttg aagtaatagt agcaaggctt 1020
gcccttcaac ttcaaaacaa gacagttgtg gtcaaaggag ctcccatggt tgaaccaagt 1080
gatgaactct tttggtttaa tcaccctaaa tttgttctca cccttcttca tttcactttg 1140
tttatgaatg ccttcgaatt ttcatttttc atctgggtta cgctacaata tgggataaat 1200
tcttgctacc atgaaaactt ggtggtcatc atcattagag tggtcttagc agtcacagtc 1260
caagttttgt gtagctacat tactctgcct ctctatgctc ttgtcacaca gatggggtca 1320
cagttcaaag ctgcagcatt agaagaacac acagccaaag ccataaagaa atggcacaaa 1380
gatgtgaaac ataagagaaa gaagccttcc catcaccatg accttgactc aaaccagcac 1440
caagaaggct catcacactc cgtctccgag cacccatcgt ctcgagtttt tgagggtagt 1500
agccgaaccc taaattcgga tcaagagatc atgagctctt ctcatcatag agctctctct 1560
tttgctgagc tcaacggtgt tagtattact gagtgtgatg agattgttga agaaaaactc 1620
agagattctg tagtaacaaa aggtgaatct gcagtttcaa ataaggtaat ggagatagaa 1680
ataggagaga ttagtgaaat tcatgaagaa acaattacct taagtactcc tcaaaatgaa 1740
agacgaattt cctag 1755
<210> 2
<211> 1431
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggatggaa gagggaatag taataataat gttcatgatc atcctccaaa tgcaaagttt 60
gagttcactc caacatggat cattgctgtt gtttcatcca ttatcgttat catttccttc 120
tcccttgagc gtggccttca tcaccttgga cagaagttgc agaagaaaca gatggatgaa 180
ctaaatcatg cgttgctgaa actaaaagaa gagttaatga ttttagggtt tatctcccta 240
ttattcaacg tgtttcaagg ggcaatcgga cgtttttgta tgcccaaaga ttttgcatac 300
catatgcttc catgtaagag aagtaccgtg cccgttgtta atcatttctc atcgtcaaat 360
tttgtcgatc acaattacaa tattcaccgt catctattat cgacaactca agctaatttt 420
caacattgct cacgaaaagg gaaggttcct ctattatctt tggaagcatt gcatcagctc 480
catatattca tatttgtgtt ggctgttgtt catgtcatct tctgtgctac aaccatgctt 540
ctagcctctg caaagatacg attgtggaag agatgggaag aatctattga taagcgccaa 600
cctacgcaat ctgaagatga tgatgagttt aataaacgag ccgttggctt ttggagaagg 660
gctgccgtca ttgcttggat gatggcattt agaaagcagt tttatggatc aattacaaag 720
tcggattaca aatatcttcg acgaggcttt attaagaaac attgcccagg ggaacttaat 780
tttgatttct atgatcacat taaaaaaact tatcaacatg atttcaagaa agttgttggt 840
ataagttggt atctttgggc ctttgttgtg ctgttcttac tgcttaatct tgaaggatgg 900
cacacttatt tttggttgtc atttctaccg ctaattatgc tacttctcgt gggagcaaag 960
ttggaataca taataacacg tatggctcaa gaattaaact tgaaaatcga agacaaagaa 1020
gcacaacaac aacaacgaca acaacaagaa cgtgatgaaa gacatttcga tagacaacaa 1080
caccgtagga atatcaatag acatggtagc caccaccatg tggatccttc cgatgagtac 1140
ttttggtttc attctccttc atgtgttctt catttgattc acttcattct cttccaaaat 1200
tccttcgaga ttgccttctt cttttggatt tggacaactt atggatttaa gtcttgcatt 1260
atggagaaac ctgcctatat catcaccaga ctcattttag gtgggattgt ccaagtgcta 1320
tgcagttaca gcacattgcc tttgtattct ttagtcactc agatgggaag tgaatataag 1380
aagccatctg atcatgaaga gcatggcaaa gcagaagaaa gaattagctg a 1431
<210> 3
<211> 1710
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgtctgttt tttgtctttg cttctgcctt ttattgactg gcgccgccgc gtccggtgga 60
gacggcggtt cccactccag ggatctcgat aacacaccca cctgggctgt tgctgctgtt 120
tgcttctttt tcgttcttat ttccattgtc ttggaaaatg ttattcacaa acttggaacg 180
tggttgacaa aaaagcacaa gagttctctg tatgaagctc tggagaaggt taaggctgag 240
ttgatgattt tgggtttcat ctccctgctt ctgacttttg ctcaagcata tattgtccaa 300
atttgtattc ctccggccat tgcaaactcc atgttgccct gtcgccgtga agagaaaaat 360
gcctcaaccg atgaagacga acatcaccgg agactacaat ggctaattcg aagatcattg 420
gctggaggtc acaatgttgt ctcgtgtgag gatggtaagg tgtctcttat atccattgat 480
ggattgcatc agttgcatat tctcattttc ttcttagctg tgtttcatgt gctctttagt 540
gttatcacaa tgacacttgg aaggataaag attcgaggct ggaaggagtg ggagcaggaa 600
acttcaacgc ataactatga gtttttcaac gatcctgcaa gatttaggct tactcacgag 660
acatcttttg tgaaagcaca caccagcttt tggacacgtc ttcctttctt cttctatatt 720
agttgcttct tcaggcaatt ttatgggtct gttagtaagg ctgattactt gacgctacgc 780
aatggattca taacagttca tttagcacct ggaagtaaat ttaacttcca gagatatatc 840
aaaaggtcat tagaagatga cttcaaggta gtcgtcggtg tgagtccttt tctatggtcg 900
tcatttgtga tcttcctgct ccttaattta tctggatggc atacattgtt ctgggcatca 960
tttatccctc tgcttataat cttagccgtt ggatcaaaac ttcaagccat tttgactaga 1020
atggctcttg aaatctctga gaaacatgca gtggtccagg gaattccact cgtgcaagga 1080
tccgacaagt atttctggtt cggccgccct caactgattc ttcatctcat gcatttttct 1140
ttatttcaga atgcattcca gaccacctat attttgtcta cactgtattc ttttggcctg 1200
aattcttgct tctttgatgg tcacatcctt acaattataa aagttggttt aggggtagta 1260
gcattatttc tatgcagcta tgttacgctt ccaatatacg cccttgtaaa tcagatgggt 1320
tcaggtatga agaggtccat ctttgatgaa cagacatcaa aggcactcat gaaatggcag 1380
gaaacggcca agaagaagcg ggctaaacga gcctcagcaa ctaaaaccct cggaggtagt 1440
tcaaatgctt cacctctaca ctcattgcga cggtttaaaa ctacaggaca ctccatacgt 1500
gtgcctacgt atgaggacct tgagtcatct gattacgagg gggatccatt agcaacacct 1560
acacaagcgt caacaagtga atcgattaat gttgatgtaa aagatggaga tgaaatacaa 1620
caaatcgctg aaacagagca accccacagt acaattcaaa ctaaagaagg agatgagttc 1680
tcatttataa agcctgcaac actaggataa 1710
<210> 4
<211> 1617
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggaagaag aaggacgatc cttggccgtt acccccactt gggcttttgc cacagtggtc 60
actctcatgg tttctcttgg attcttcttc caaggcacgt tgaaacggac caaaaagtgg 120
ttgaatagga cgaagagaaa atcgttactt gctgcgttgg agaagattaa agaagagctg 180
atgctctttg gacttctttc gttgttgatg ggtcactgga ttgtttttgt tgcaagaatt 240
tgtgtcaagt catctgtctt gagcagccgt ttctatcctt gtgcgttgga gactgatctg 300
aaacgagtta gacatatttt cattgcaact caaagcttga acagttctgt tccaagggag 360
cacaataacg atgggatacg agagtattgt cctgagggtc gtgaatcgtt tgcttcatat 420
gaaagtttag agcagcttca tcgactaata ttcgttctcg gtgtcaccca tgtttcatat 480
agcttcattg ccattgccct ggctatgatt aagatatatg gctggaggac gtgggaaaat 540
gaggctaagg ctttggccat tcgaaacgcc gaagaagaat ctgcacaagc accatcaact 600
ggaccaaaca taaggcgact atcaactttt atctttcacc atacttctca tccatggagt 660
cagcatagag tccttgtttg gctgctctgt ttcagccgcc agttttggag ttctattaat 720
cgagctgatt acatggcttt gcggttggga tttatcagta ctcatgaact tcctatatcg 780
tatgacttcc acaattatat gcttcgaagc atggatgatg aatttcgtga tatggttggt 840
ataagtgtac cactctggat atatgccatt gcttgcatct tcctcaactt ccatggaagc 900
aacatttaca tttggctttc ctttgtccct gcaattttga ttctgctaat cgggacgaaa 960
ctgcaccggg tagtggtaaa gctagctgta gaagttgtgg attcatcccc aaggggatat 1020
tattgtttta acttgagaga tgagctgttt tggtttggga agcctaagct tcttttatgg 1080
ttgatacaat ttatatcctt ccagaatgct tttgagatgg ctacatttat ttggtccctg 1140
tgggaaatta aggagccttc ttgtttcatg gataacgaaa cctatgttgg tatccgcttg 1200
gcgtttgggg ttatcactca attttggtgt agcttcatca cattcccact ctatgttata 1260
gtaactcaga tggggtcaaa agtcaagaaa tcacttgtgt cggagaatgt tcgaaactca 1320
cttcatcaat ggaaaagaag agtgaaggca aggccaggtg cttcttcaac ggttacactt 1380
gcgggtgcaa catcactttc atcctctgtt tttacaatgg atgatgaggg tgaagtgacc 1440
gacgacttta ccacgaactg ctcggaagga agcacatcaa atgctgctca atgcacacat 1500
ttcccccagt taattcagcc agttttgtca gatgacacgg aagtagaaat atctgttagt 1560
tctaattctc cacacattag ttccaacaac agaagtgaag gcaatgggga tggttga 1617
<210> 5
<211> 1671
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggaacttc aaggaggaag gtcactggct gaaacgccta cctactcggt tgcttctgtg 60
gttactgtca tggtctttgt ctgcttggtg gtggagcggg caatctatag gtttggaaag 120
tggttgaaga agaccaagag aaaggctctg tttgcttctt tggagaagat taaggaagag 180
ctgatgctgc ttggactgat atctttgatg ctggcacaat gtgcaaggtg gatatctgaa 240
atttgtgtga actcgtccct tttcaccagt agattctaca tttgttcaga agaagattat 300
gccaccaatg aacatattct gcttgaaagt tctctattgt ctcataatga aattgtcatt 360
cctcaaagag aattaagtgc tcttccgcat caatgtggtg agggtcgtga gccttttgtt 420
tcatatgagg gacttgaaca acttcaccgg ttcttgtttg ttcttgggat cactcatgtt 480
ctttatagct gtctagctgt tggtctggca atgagtaaga tatacagttg gaggaaatgg 540
gaaagtcaag ttaaattagc tgctgaagat aatttaccag ctaaaagaaa taaggtcatg 600
aggcggcaaa cgacgtttgt tttccatcac acatctcatc catggagcag gagtcgtatt 660
ctcatatgga tgctttgttt cctacgtcag ttcaagagtt cgataaagaa atcagactat 720
ttggccctcc gtttgggttt cattacaaag cacaaattac cgatctctta tgatttccac 780
aagtacatgg ttcggagcat ggaagacgag ttccatggaa tccttggaat tagctggccg 840
ctatggggct acgccattct ttgcatcttt gtcaacattc acggtttaaa tatctacttt 900
tggctttctt tcataccggc tgctcttgtt atgctcgttg ggacaaaact tcaacatgtt 960
gtatcctctt tggctcttga agttttggaa cagagaggtg ggattcaaat aaaaccaaga 1020
gacgatctgt tttggtttgg aaagcctgtg attttactac ggttaataca gttcatcata 1080
tttcagaatg catttgagat ggcgacattt atctggtcct tgtggggatt taaggaaaga 1140
tcttgcttca tgaagaacga ctttatgata atcacgaggt tgacttcagg tgttcttgta 1200
cagttttggt gcagctatag cactgtgcca cttaatataa ttgttacaca gatgggatcc 1260
aagtgtaaga aagcattggt ggctgagagc gtgagagagt cattgcatag ttggtgcaag 1320
agagtaaagg agaggtccaa acgtgactct gcacattcca tcactacaag atcagtatgt 1380
tcacttgaat caatggttga tgaacgagat gaaataacca ttgcttccgg tacgttgtca 1440
cggagctcat cttttgagac ctcaaatcag gtgaccgtac aatctactgc ccaactagag 1500
gctattattg agtcttcaag cttaaggagg catgaagaac ttccccccac catggcggat 1560
tttctatcac aatctgcaag agtttctcat gctaatggcc tagaaaataa tgcagagagt 1620
ggcgaagata gcaaggtcga gtcacttttc gacttgttca aaaggacatg a 1671
<210> 6
<211> 1707
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggctgaaa atgcctccca ggagggaaga tctctggctc tgacgcctac ttggtctgtt 60
gcttccgtgt tgaccatttt cgtcgcagtt tcattgcttg tagaacgctc cattcatagg 120
ctaagctctt ggctgggaaa aactcataga aaacccttat ttgaggcagt ggagaaaatg 180
aaagaagagt taatgctgct tggttttatt tctttgcttc tgacggcaac atcaagtcta 240
atatcaaata tctgcattcc atccaagttt tatgatacat cttttattcc gtgctctcag 300
tcggagattg atgaacaaaa tgcggataat tcttcatctg agaagcgaaa gctatttatg 360
gtttctgttt tcccacattt gaataggagg atgctaactg tgaacaaaaa tacatgcaaa 420
gagggtcatg agccctttgt ttcctatgag ggacttgagc aattgcatcg ctttatcttt 480
gtgatggcag ttactcatat ttcttatagt tgcttaacca tgttgttggc aattgtgaag 540
atccacagtt ggagagaatg ggaaaatgaa gctcacatgg accaccatga tttattcaac 600
gatacaacga aaaaaaagat aatgcagaga caatctacct ttgtacaata tcacacctcc 660
aatcctttaa ccaggaatag ctttcttatc tggatgacct gtttctttag gcaatttggg 720
cgttctgttg ttcgttctga ctaccttaca cttcgcaaag gcttcatcac gaatcacaac 780
ctctcgtcaa aatatgattt ccatagctac atggttcgtt ctatggaaga agaattccag 840
agaatagttg gtgtgagtgg tccgttatgg ggatttgtcg tagctttttt gctgtttaat 900
gtgaaaggct ccaaccttta cttttggata gcaactattc ctgttactct tgttctttta 960
gtgggcacaa agttacagca tgttattgca actttgacgt tggagaatgc tggtataacc 1020
ggattctttt ctggagcaaa gctgaggccc cgtgatgatc ttttctggtt taagaagcct 1080
gaacttctgt tgtccttgat ccattttgtt cttttccaga atgctttcga attggcttcg 1140
ttcttctggt tctggtggca atttggatat agttcttgct tcattagcaa tcatctgctt 1200
gtctatgtaa gactaatctt gggttttgct ggacaatttc tttgcagcta tagcaccttg 1260
cccctatacg cactggttac tcagatggga acaaactaca aggctgcctt aattcctcaa 1320
agaataaggg aaacaatcca tgggtggggt aagtcagcta gaaggaagag aaggctccgg 1380
atatttactg atgatgccac aatccacacg gaaacaagca ccgtgatgtc acttgaggac 1440
gatgacaacc aacatgttga tacacctaaa gctgcaactg gctatgccat aattgagatg 1500
cagccaccta ctgcagcaaa tgtgtccgcc tctgttacta atgatgcatc acgtgcggtt 1560
agaactcccc ttcttcagcc ctctctgtct ctttcattgc ctgtggctca aaacttcatt 1620
gacggagccc ctttaagaag ctcatcaatg ccggctcaaa acttcgatgc cgaaaactct 1680
ttaagaagct catctatgcc gagataa 1707
<210> 7
<211> 1626
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atggctgaaa atgaacagga gactcgatct ttggctttga ctcccacttg gtctgttgct 60
tctgtgctga ctattttcgt tgcagtctct ttgcttgtgg agcggtccat tcaccggtta 120
agcacttggt tggggaaaac taatcgaaag ccactgtttg aggcagtgga gaaaatgaaa 180
gaagagttga tgctgcttgg atttatttct ctccttttaa cagctacttc aagctcaata 240
tcaaatatct gcgttccatc aaagttctac aatacccctt ttactccatg caccagagct 300
gaggctgacg aacatgaaga tgacaattca tccgaggaac ggaaactata tacagcttct 360
gtattacccc atttgtttag gcggatgctt aatgtgaata agaaaacctg caaagagggt 420
tatgagccgt ttgtttcata tgagggtctt gagcaattgc atcgctttat ctttataatg 480
gcagtaactc atatatctta tagctgctta acaatgttac tcgcaattgt gaagattcac 540
agatggaggg tttgggagaa tgaagcccat atggacagac atgattcact aaatgatatc 600
acaagagaaa tgacgttgcg gaggcaatca acctttgttc gatatcacac ttcaaatcct 660
atgacaagga acagttttct aatctgggtg acatgttttt tccggcaatt tgggaattct 720
gtagttcgtg ctgactacct cacacttcgc aagggcttca tcatgaatca tcatctcccc 780
ttgacttatg atttccacag ttacatgatt cgctccatgg aagaagaatt ccaaaggata 840
gttggcgtga gtggtccgtt gtggggattt gttgttgctt tcatgctgtt taatgtaaaa 900
ggctctaatc tgtatttctg gatagcaagc gttcctattg ctcttgttct tttagtgggc 960
acgaagctgc aacatgtaat tgcaacattg gcattggaaa gtgctggtat aactggttca 1020
ttttcgggtt caaagctaaa gccaagagat gatcttttct ggtttaagaa gcctgaactc 1080
cttttgtcct taatccactt tatccttttc cagaatgcat ttgagttggc atcattcttc 1140
tggttctggt ggcaattcgg atataattct tgctttatca ggaatcatat gcttgtctat 1200
gcaagacttg ttttgggatt cgctgggcag ttcctttgca gctacagcac cttgcccttg 1260
tatgctttgg ttactcagat gggaacaaac tataaagctg cattaattcc acaaagaata 1320
agggaaacaa tccatggatg ggggaaggca gctagaagga aaagaaggct ccgcatgttt 1380
gcagatgaca ccacgattca cactgaaaca agcacggtga tgtcacttga ggatgatgac 1440
cgtaggctta ttgatgatat ttctgaaact actgccgact acacgtcaat cgaactacag 1500
ccgacttctg tacacgatga acctgactct gttcctaatg aacgaccaag cagagctaga 1560
acgcctcttc tacaaccctc tacatctctt tctacatcag ttgatcataa gtttgaggtt 1620
gattaa 1626
<210> 8
<211> 1551
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgggtggcg gaggtgaagg aacgacgctg gaattcactc cgacgtgggt tgtagccgcc 60
gtatgtactg tcatcgttgc catttctctc gccttagagc gccttcttca ctttctcggc 120
agatacctca aaagcaagaa tcaaaagccg ctcaatgaag ctcttcagaa agttaaagaa 180
gaattgatgc ttttggggtt catttcactt ctgctcactg tatttcaagg caccatctct 240
aaattgtgtg ttcctgagag tttgactgaa catttacttc cgtgtgatct gaaggataaa 300
ccgaaagctg aacatggttc gccctctggt gaatctggtt cgtcaacgac gaagcatttt 360
caaacgttat ttgtttcgag tatttctggt acggccaggc ggcttctttc tgagggatct 420
gcttcacaag ctggttactg tgccaaaaag aataaggtgc cattgctatc tcttgaagca 480
ttgcatcatc tacatatttt tatcttcatc ctagctatcg tccacgtgac attttgcgtt 540
ctcactgtag tttttggagg attgaagatt cgccagtgga agcattggga ggattctatt 600
gcaaaagaga attatgatac tgaacaagtt ctaaaaccaa aagtcactca tgtccatcaa 660
catgctttta tcaaagacca ctttttgggc tttggtaaag attcagctct tcttggttgg 720
ttgcattcat ttctcaagca attttatgct tctgtaacaa aatcagatta tgcaacgtta 780
cgacttggtt tcattacgac gcactgcagg ggaaatccaa agtttaattt tcacaagtac 840
atgatacgtg cccttgaaga tgacttcaag catgttgttg gtatcagttg gtatctttgg 900
atattcgtgg ttgtcttctt gttccttaat gtcagtggtt ggcatacata tttctggata 960
gcattcattc ctttcgttct tctgcttgct gtgggaacga agctggaaca tgtgataacc 1020
cagctggctc atgaggttgc agagaagcac atagcaatcg aaggtgatct agtagtccaa 1080
ccgtctgatg atcacttttg gttccaacgt ccccgtattg ttctcttctt gatccacttt 1140
atacttttcc aaaacgcttt tgagattgga tttttcttct ggatatgggt tcaatatgga 1200
tttgactcgt gcatcatggg acaagtccgc tatatcattc caaggctcat cattggggtg 1260
tttgttcagg ttctttgcag ctacagcacc cttccgctct acgccattgt cactcagatg 1320
ggaagttctt tcaagaaagc aatctttgat gaacatgtac aagtagggct agttggctgg 1380
gctcagaagg tgaagaaaag aaagggactt agagcagctg ctgatggctc cagtcaagga 1440
gtcaaggaag gtggttcaac tgtggggatt cagttgggaa atgttatgcg caaggcttct 1500
gcacctcaag aaattaagcc tgatgactcc aaatcaaatg atattcctta g 1551
<210> 9
<211> 1314
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgcatttgca gaggctagaa gcagttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta 60
gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgca acaaagcacc agtggtctag 120
tggtagaata gtaccctgcc acggtacaga cccgggttcg attcccggct ggtgcagtgg 180
ctaattcgaa gatcatgttt tagagctaga aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt 240
atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gcaacaaagc accagtggtc tagtggtaga 300
atagtaccct gccacggtac agacccgggt tcgattcccg gctggtgcag tgtcacgtgg 360
acgatagctg ttttagagct agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gttatcaact 420
tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcaacaa agcaccagtg gtctagtggt agaatagtac 480
cctgccacgg tacagacccg ggttcgattc ccggctggtg cagctctaca gtgttctcac 540
cagttttaga gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag tccgttatca acttgaaaaa 600
gtggcaccga gtcggtgcaa caaagcacca gtggtctagt ggtagaatag taccctgcca 660
cggtacagac ccgggttcga ttcccggctg gtgcagtatt caacggtgag ctctagtttt 720
agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac 780
cgagtcggtg caacaaagca ccagtggtct agtggtagaa tagtaccctg ccacggtaca 840
gacccgggtt cgattcccgg ctggtgcagt gacaattcat ccgaggaagt tttagagcta 900
gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg 960
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gttcgattcc cggctggtgc agccctggct atgattaagg tgttttagag ctagaaatag 1080
caagttaaaa taaggctagt ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgcaac 1140
aaagcaccag tggtctagtg gtagaatagt accctgccac ggtacagacc cgggttcgat 1200
tcccggctgg tgcaggtgct cttccgcatc aatggtttta gagctagaaa tagcaagtta 1260
aaataaggct agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc aaca 1314

Claims (7)

1.一种高产量黄瓜品种的制作方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对黄瓜的CsMLO基因进行编辑，使得黄瓜的花瓣数和心室数增多；
编辑的CsMLO基因具体为CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO6、CsMLO7、CsMLO9、CsMLO10，其对应的DNA序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示，对CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO6、CsMLO7、CsMLO9、CsMLO10进行编辑的方式为：通过将CsMLO2自5´末端第1–1755位碱基、CsMLO3自5´末端第1–1431位碱基、CsMLO4自5´末端第1–1710位碱基、CsMLO5自5´末端第1–1617位碱基、CsMLO6自5´末端第1–1671位碱基、CsMLO7自5´末端第1–1707位碱基、CsMLO9自5´末端第1–1626位碱基、CsMLO10自5´末端第1–1551位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到。
2.根据权利要求1所述的一种高产量黄瓜品种的制作方法，其特征在于，对黄瓜的CsMLO基因编辑的具体方法如下：
针对CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO6、CsMLO7、CsMLO9、CsMLO10基因的外显子区域设计sgRNA；
将CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO6、CsMLO7、CsMLO9、CsMLO10基因的sgRNA合成为一个表达元件组，并将该表达元件组插入到pBCG403载体中，得到八靶载体；
将八靶载体转化到农杆菌EHA105中；
利用转化有八靶载体的农杆菌EHA105侵染CU2黄瓜种子，得到转基因黄瓜植株T0代；
转基因黄瓜植株T0代自交得到T1代，T1代自交留种分离获得不含Cas9非转基因多突变体，即得到高产量黄瓜品种。
3. 根据权利要求2所述的一种高产量黄瓜品种的制作方法，其特征在于，八个sgRNA靶点的核苷酸序列分别为：
CsMLO2：CTCTACAGTGTTCTCACCA
CsMLO3：TTTGCAGAGGCTAGAAGCA
CsMLO4：TGGCTAATTCGAAGATCAT
CsMLO5：CCCTGGCTATGATTAAGGT
CsMLO6：GTGCTCTTCCGCATCAATG
CsMLO7：TATTCAACGGTGAGCTCTA
CsMLO9：TGACAATTCATCCGAGGAA
CsMLO10：TGTCACGTGGACGATAGCT。
4. 根据权利要求3所述的一种高产量黄瓜品种的制作方法，其特征在于，表达元件组的序列如SEQ ID NO.9所示。
5.根据权利要求2所述的一种高产量黄瓜品种的制作方法，其特征在于，检测CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO6、CsMLO7、CsMLO9、CsMLO10编辑情况的PCR引物如下：
。
6.一种提高黄瓜产量的方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对黄瓜的CsMLO基因进行编辑，使得黄瓜的花瓣数和心室数增多；编辑的CsMLO基因具体为CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO6、CsMLO7、CsMLO9、CsMLO10，其对应的DNA序列分别如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示，对CsMLO2、CsMLO3、CsMLO4、CsMLO5、CsMLO6、CsMLO7、CsMLO9、CsMLO10进行编辑的方式为：通过将CsMLO2自5´末端第1–1755位碱基、CsMLO3自5´末端第1–1431位碱基、CsMLO4自5´末端第1–1710位碱基、CsMLO5自5´末端第1–1617位碱基、CsMLO6自5´末端第1–1671位碱基、CsMLO7自5´末端第1–1707位碱基、CsMLO9自5´末端第1–1626位碱基、CsMLO10自5´末端第1–1551位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到；种植上述方法培育的黄瓜品种。
7. 一种重组质粒载体，其特征在于，将序列如SEQ ID NO.9所示的表达元件组，插入到pBCG403质粒得到。
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