CN111690679A

CN111690679A - 一种用于培育黄瓜雄性不育系的重组表达载体及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN111690679A
Application number: CN202010497456.9A
Authority: CN
Inventors: 杨丽; 马明茹; 别之龙
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2020-06-03
Filing date: 2020-06-03
Publication date: 2020-09-22
Anticipated expiration: 2040-06-03
Also published as: CN111690679B

Abstract

本发明公开了一种重组表达载体，为在载体质粒的多克隆位点间插入黄瓜CsMLO12和CsMLO13基因的两个sgRNA靶点，所述黄瓜CsMLO12基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述黄瓜CsMLO13基因具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，本发明还公开了重组表达载体的构建方法及其在培育黄瓜雄性不育系中的应用，通过构建与花粉管萌发相关基因CsMLO12、CsMLO13的CRISPR/Cas9表达载体，并通过农杆菌介导遗传转化黄瓜，获得Csmlo12、Csmlo13双突变体，发现双突变体的花粉不能正常萌发出花粉管从而使其雄性不育。

Description

一种用于培育黄瓜雄性不育系的重组表达载体及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种可用于培育黄瓜雄性不育系的重组表达载体，本发明还涉及该重组表达载体的构建方法和应用。

背景技术

黄瓜(Cucumis sativus)是我国最重要的蔬菜作物之一。目前黄瓜杂交制种仍然需要人工摘除雄花和套袋授粉，工序复杂、成本较高。植物雄性不育的主要特征是雄蕊不能产生正常功能的花粉，而雌蕊发育正常并能够接受花粉受精结实。雄性不育在植物杂种优势利用方面具有重要的应用价值，是提高杂交制种效率的有效途径。在中国科技部十一五国家技术支撑计划“主要蔬菜作物雄性不育育种关键技术集成与良种产业化”重点项目中，黄瓜是重要攻关项目之一。随着生物工程的发展，通过基因编辑的方法创制雄性不育材料已成为可能。基因编辑技术可以在DNA水平上对基因序列进行改造，实现目标性状的精准改良而不存在常规回交育种基因连锁累赘等问题。在很多作物中都有发现雄性不育基因，但黄瓜中报道的雄性不育基因极少，极大地限制了杂交制种在黄瓜中的应用。

MLO基因最早在大麦中发现，此基因的突变可以使大麦产生持久、广谱、高效的白粉病抗性。mlo隐性突变介导的白粉病抗性随后被广泛应用于其它多种作物的抗病育种中(Kusch and Panstruga,2017)。植物MLO基因可分为七个进化分支，具有功能多效性。其中第V分支成员参与介导白粉病抗性，第I分支成员参与植物根系形态的调节，而第III分支上的MLO蛋白可能是被子植物受精过程中配子体功能的一个关键调节因子。如拟南芥第III分支成员AtMLO7参与花粉管与助细胞的识别(Kessler et al.,2010)，水稻第III分支成员OsMLO12基因是花粉粒与亲和性柱头接触后的花粉水合作用所必需的(Yi et al.,2014)；而瓜类作物中MLO第III分支成员功能尚不明确。植物的雄性不育主要体现在花粉败育，而我们发现通过编辑黄瓜第III分支成员CsMLO12、CsMLO13基因可导致黄瓜花粉管不能正常萌发，因此引起雄性不育。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种重组表达载体。

所述重组表达载体为在载体质粒的多克隆位点间插入黄瓜CsMLO12和CsMLO13基因的两个sgRNA靶点而得到。

所述黄瓜CsMLO12和CsMLO13基因，来源于葫芦科、黄瓜属、黄瓜(Cucumis sativusL.)，具体可为如下1)–2)中任一所述的基因：

1)其编码序列是SEQ ID NO:1的CsMLO12自5′末端第1–1635位、SEQ ID NO:2的CsMLO13自5′末端第1–1683位脱氧核糖核苷酸；

2)与1)的基因具有90％以上的同源性，且编码与花粉管萌发相关蛋白的DNA分子。

SEQ ID NO:1由CsMLO12的1635个碱基组成、SEQ ID NO:2由CsMLO13的1683个碱基组成，为CsMLO12、CsMLO13基因的开放阅读框架(ORF)，编码氨基酸序列分别是SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的CsMLO12、CsMLO13。

如下1)或2)的蛋白质：

1)由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；SEQ ID NO:3的CsMLO12由538个氨基酸残基组成，SEQ ID NO:4的CsMLO13由560个氨基酸残基组成。

2)将SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失、和/或添加且与花粉管萌发相关的由1)衍生的蛋白质。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的CsMLO12、CsMLO13的编码基因可通过将SEQ ID NO:1的CsMLO12自5′末端第1–1635位碱基、SEQ ID NO:2的CsMLO13自5′末端第1–1683位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到。

上述与花粉管萌发相关的蛋白及其编码基因也属于本发明的保护范围。

优选地，所述载体质粒为pKSE402质粒。

优选地，所述两个sgRNA靶点的核苷酸序列分别为：

CsMLO12：SEQ ID NO:5所示的序列；

CsMLO13：SEQ ID NO:6所示的序列。

本发明的第二个目的是提供一种所述重组表达载体的构建方法，该方法包括以下步骤：

S1：根据黄瓜CsMLO12和CsMLO13基因设计两个sgRNA靶点，所述sgRNA靶点均位于外显子结构域，并根据sgRNA靶点序列设计并合成构建重组表达载体所需的引物；

S2：利用所述的引物对所述两个sgRNA进行PCR扩增，将扩增产物纯化回收后进行酶切连接，从而在载体质粒的多克隆位点间插入所述两个sgRNA靶点并构建重组表达载体。

优选地，所述引物的核苷酸序列分别为：

MLO12-DT1-BsF：SEQ ID NO:7所示的序列；

MLO12-DT1-F0：SEQ ID NO:8所示的序列；

MLO13-DT2-R0：SEQ ID NO:9所示的序列；

MLO13-DT2-BsR：SEQ ID NO:10所示的序列。

本发明的第三个目的是提供一种含有所述重组表达载体的工程菌，该工程菌为含有所述表达载体的重组大肠杆菌。

本发明的第四个目的是提供一种含有所述重组表达载体的转基因农杆菌，所述农杆菌为根癌农杆菌EHA105。

本发明的第五个目的是提供所述的重组表达载体、工程菌、转基因农杆菌在培育黄瓜雄性不育系中的应用。该应用通过采用CRISPR/Cas9基因编辑系统，定点敲除黄瓜子叶的CsMLO12和CsMLO13基因结构域，使所述基因对应的蛋白功能缺失，造成黄瓜花粉管萌发缺陷从而使其雄性不育。

本发明构建了与花粉管萌发相关CsMLO12、CsMLO13基因的CRISPR/Cas9表达载体，并将其遗传转化导入黄瓜种质中，经过稳定遗传转化后成功地获得了转基因T0代，自交留种分离出T1代双突变体。发现在转基因植株T1代Csmlo12、Csmlo13双突变体中花粉管不能正常萌发，且当双突变体作为父本时几乎不能获得正常种子。实验结果说明CsMLO12、CsMLO13编码的蛋白质确实在花粉管萌发中发挥着重要的作用。对CsMLO12、CsMLO13基因的表达和功能进行深入研究有助于解析黄瓜花粉管萌发的机制，为黄瓜雄性不育提供理论依据。

附图说明

图1为CsMLO12、CsMLO13基因sgRNA表达元件组。

图2为转基因黄瓜T1代靶标位点编辑情况。

图3为WT与Csmlo12/13双突变体培养基中花粉管萌发情况。ac与bd分别为WT和Csmlo12/13双突变体的花粉，cd为WT和Csmlo12/13双突变体的花粉在培养基上培养5.5h后花粉管萌发情况。

图4为Csmlo12/13双突变体分别作为父母本杂交时单瓜正常种子数统计结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1、转基因黄瓜阳性植株的获得

一、CRISPR/Cas9表达载体的构建及农杆菌转化

1.sgRNA的设计

用Geneious软件选择CsMLO12、CsMLO13基因(Cucumber(Chinese Long)v3Genome)的第1个外显子区域进行sgRNA的设计：sgRNA序列具有5′-(N)19-NGG-3′结构(N为A、G、C、T四种碱基中的任意一个)，且GC含量在40％-70％之间。

黄瓜CsMLO12、CsMLO13基因的sgRNA序列如下：

CsMLO12：ATGATGACTGCACAAACAGCGG

CsMLO13：CTCCGACATGGGCTGTTGCTGG

2.引物设计和PCR扩增

(1)根据CsMLO12、CsMLO13基因的sgRNA设计引物序列。引物序列如下所示：

引物名称	引物序列(5′-3′)
		MLO12-DT1-BsF	ATATATGGTCTCGATTGATGATGACTGCACAAACAGGTT
MLO12-DT1-F0	TGATGATGACTGCACAAACAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
		MLO13-DT2-R0	AACGCAACAGCCCATGTCGGAGCAATCTCTTAGTCGACTCTAC
MLO13-DT2-BsR	ATTATTGGTCTCGAAACGCAACAGCCCATGTCGGAGC

(2)PCR扩增

以稀释100倍的pCBC-DT1T2(商业化质粒)为模板进行四引物扩增。

①PCR反应体系与条件：

②琼脂糖凝胶电泳检测：

称取0.45g琼脂糖置于锥形瓶中，加入30mL 1×TAE溶液，微波炉加热煮沸至琼脂糖全部融化。将内槽置于水平位置并放好梳子，将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液倒入内槽玻璃板上。室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子即配制成1.5％琼脂糖凝胶。将凝胶和内槽放入电泳槽中，用10μL微量移液器将DL 2000DNA Marker(作为对照)与上述PCR扩增产物加入胶板的小槽内。加样后通电进行电泳，电压设为100V。电泳完毕后取出凝胶，用荧光核酸凝胶染色溶液染色约20min，通过凝胶成像仪进行紫外显影，可观察到在626bp处有一条明亮的条带，说明已成功扩增出了目的片段。

③PCR产物纯化回收：

使用AxyPrep DNA PCR回收试剂盒进行PCR产物液体纯化回收，按照说明书操作如下：将PCR产物加入2mL离心管中，加3个PCR产物体积的Buffer DE-A，混合均匀。加0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。吸取混合液转移到DNA制备管中，12000rpm离心1min，弃滤液。将制备管置回2mL离心管，加500μL Buffer W1，12000rpm离心30s，弃滤液。将制备管置回2mL离心管，加700μL Buffer W2，12000rpm离心30s，弃滤液。以同样的方法再用700μL Buffer W2洗涤一次，12000rpm离心1mim。将制备管置回2mL离心管中，12000rpm离心1mim。将制备管置于洁净的1.5mL离心管中，在制备膜中央加30μL Eluent或去离子水(加热至65℃以提高洗脱效率)，室温静置1min。12000rpm离心1mim洗脱DNA。

3.扩增产物的酶切连接

获得PCR扩增产物后建立如下的酶切-连接体系，其中pKSE402载体是在pKSE401载体的基础上在EcoRI位点插入了35S:GFP表达框(Xing et al.,2014)。

4.转化大肠杆菌

在超净工作台中取5μL连接体系加入100μL大肠杆菌感受态DH5α中，轻弹混匀。冰浴5min，放入42℃水浴锅中热激90s，结束后立刻冰浴3min。加入1mL LB溶液，混匀；37℃、220rpm摇床培养30min。在固体LB+kana平板上均匀涂布约200μL转化菌。平板封口倒置于37℃培养箱中培养1d。待长出单菌落后，挑取单克隆菌斑接入LB+Kana液体培养基中，37℃、220rpm摇床培养30min。将单克隆菌液送擎科生物技术公司测序并用geneious软件进行序列比对，比对正确即说明重组表达载体构建成功(图1)。

5.农杆菌的转化

将擎科公司返回的测序正确的表达载体质粒转入农杆菌EHA105中，为后续黄瓜遗传转化侵染实验作准备。在超净工作台中取2μL质粒，加入100μL的EHA105农杆菌感受态细胞中，轻弹混匀。混匀后冰浴5min，放入液氮中冷冻1min，后迅速置于37℃水浴锅中水浴5min。加入800μL LB培养基，于28℃、220rpm摇床上培养2h。12000rpm离心1min以浓缩菌液，加入200μL LB液体培养基重悬，混匀，将其均匀涂在LB+Kana的固体培养基中，28℃暗培养2d。挑出农杆菌单克隆菌斑用LB+kana+rif液体摇菌12h，将菌液置于-80℃超低温冰箱中保存备用。

二、黄瓜稳定遗传转化

取CU2黄瓜种子于55℃温水中浸种半小时，除去种皮。在超净工作台中先用75％的酒精清洗30s，再用0.3％的NaClO溶液浸泡15min，最后用无菌水冲洗5次。将消毒好的种子转移至种子萌发培养基M0上。于28度培养箱中暗培养24h，即可切取外植体。

吸取10μL农杆菌于30mL LB(含kana、rif)培养基中28℃、220rpm摇床培养过夜。次日当菌液生长至OD₆₀₀值为0.4–0.8时，于6000rpm离心8min来收集农杆菌，并用M1液体培养基重悬菌体并稀释到OD₆₀₀为0.2。取已萌发的种子，在超净台中切去远端部分子叶并去掉胚轴，同时将两片子叶分开，即得到外植体。将切好的外植体放入重悬菌液中，在功率为100W的水浴超声波中超声30s。将超声后的子叶外植体和重悬液加入20mL注射器的针筒中，向前推动活塞直至10mL刻度位置处，用橡胶皮塞密封住注射器的头部针孔，向后方拔动活塞芯杆使活塞停留在20mL刻度处，保持1.5min后使活塞回到10mL刻度位置。之后再重复施加真空负压一次。侵染结束后，将外植体放到滤纸上吸干并将其转移到垫一层滤纸的共培养培养基M1上。于23℃，黑暗条件下共培养4天。在荧光体式显微镜下观察GFP的发光情况，评估侵染效率。

用无菌水清洗共培养后的外植体7-8遍，用灭过菌的吸水纸吸干表面附着的液体，将外植体斜插于恢复培养基M2上，恢复培养7天后更换到分化培养基M3上，两个星期后继代一次。在体式荧光显微镜下，挑选含有GFP荧光芽的子叶。继代到生根培养基M4的组培瓶中培养，直至生根。将生根良好的转基因阳性苗移栽到灭过菌的基质中，于光照培养箱中炼苗和蹲苗一个月，之后在人工气候室中培养直至结种，用自交种子T1代进行后续实验。

上述培养基中，M0培养基成分：MS 4.43g/L+蔗糖30g/L+植物凝胶3g/L+6BA 2mg/L+ABA 1mg/L，pH为5.6-5.8；M1培养基成分：MS4.43g/L+蔗糖30g/L+植物凝胶3g/L+6BA 2mg/L+ABA 1mg/L+AS 80mg/L+MES 2.5mM，pH为5.6-5.8；M2培养基成分：MS 4.43g/L+蔗糖30g/L+Agar 8g/L+6BA 2mg/L+ABA 1mg/L+TMT 200mg/L，pH为5.6-5.8；M3培养基成分：MS 4.43g/L+蔗糖30g/L+植物凝胶3g/L+6BA 2mg/L+ABA 1mg/L+TMT 200mg/L，pH为5.6-5.8；M4培养基成分：MS 4.43g/L+蔗糖30g/L+Agar 8g/L+TMT 200mg/L。

实施例2、转基因黄瓜植株DNA的提取与检测

一、转基因黄瓜植株DNA的提取

采用CTAB法提取实施例1中的T1代转基因黄瓜叶片DNA。具体包括以下步骤：取少量的黄瓜叶片约0.2-0.5g于2mL离心管中，加入干净的钢珠和1mL 2％CTAB溶液，用磨样机研磨至粉末状(50H，30s)。将研磨后的样品置于65℃中水浴1小时。期间倒转离心管数次。25℃，12000rpm离心10分钟。吸取上清液(约800μL)到新的2mL离心管中。在通风橱中加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)并颠倒混匀，12000rpm(4℃)离心15分钟。小心吸取上清液(约600μL)，加入到已加入两倍体积(约1.2mL)-20℃预冷的无水乙醇的2mL离心管中，充分静置至白色团状沉淀出现。4℃冷冻离心机中10000g离心2min,弃上清液。用70％的乙醇冲洗两次后，再用无水乙醇冲洗一次，用枪头洗净液体，最后放在超净工作台上吹干。加入约50μL的含RNA酶1×TE缓冲液或碱性的ddH₂O溶解DNA，37孵育1小时。ddH₂O溶解好的DNA放置于-20℃的冰箱中备用。

二、转基因阳性单株基因编辑位点检测

以提出的转基因植株DNA为模板，分别利用引物MLO12-cexu-F、MLO12-cexu-R，MLO13-cexu-F、MLO13-cexu-R对包含CsMLO12、CsMLO13基因两个靶标位点的区域进行扩增。挑选20个植株DNA样品PCR扩增产物送测，通过二代测序方法检测转基因黄瓜编辑类型。用Geneious软件对测序序列进行分析，发现CsMLO12、CsMLO13基因被成功编辑，功能缺失的等位基因型相对于野生型表现为隐性(图2)。

检测CsMLO12、CsMLO13基因靶位点编辑效率所设引物序列如下所示：

引物名称	引物序列(5′-3′)
		MLO12-cexu-F	GATTATTGTTCACACAAGGTTGCACTC
MLO12-cexu-R	GTTGTACCTCTCCAACCATGTG
		MLO13-cexu-F	GCTGACCCAATTTGACCCATCTT
MLO13-cexu-R	AGTTTCTCCAAGGCGATAGAAATAAG

实施例3、不育株系表型观察

一、花粉管萌发实验

正常的成熟花粉粒具有较强的活力，在适宜的培养条件下便能萌发和生长，在显微镜下可直接观察计算其萌发率以确定花粉活力。首先进行培养基的配置：称10g蔗糖、1mg硼酸、0.5g琼脂与90mL水放入锥形瓶中，微波炉加热100℃中熔化，待培养基完全熔化后，用玻璃棒蘸取少许涂布在载玻片上。采集WT与Csmlo12/13双突变体植物刚开放的雄花，将成熟花粉洒落在涂有培养基的载玻片上，然后将载玻片放置于垫有湿滤纸的培养皿中，在25℃左右的恒温箱(或室温20℃条件下)中孵育，5min至若干小时后在显微镜下检查视野统计其萌发率。对双突变体Csmlo12/13和野生型进行花粉管体外萌发实验，发现双突变体的花粉管不能正常萌发(图3)。

二、WT与Csmlo12/13双突变体正反杂交单瓜结实率统计

为了确定Csmlo12/13双突变体的花粉管萌发缺陷是否会对黄瓜父本育性造成影响，对WT与Csmlo12/13双突变体进行了正反杂交实验。在大棚中分别种植25株WT和Csmlo12/13双突变体。开花期采集WT植株花粉对Csmlo12/13双突变体雌花进行授粉并标记为WT♂×Csmlo12/13♀，同样采集Csmlo12/13双突变体花粉对WT植株雌花进行授粉并标记为Csmlo12/13♂×WT♀，授粉前后用夹子夹住雌花以隔绝外来花粉。待黄瓜果实成熟后统计单瓜正常种子数量。发现当Csmlo12/13双突变体作为父本杂交时，几乎没有正常种子；而当其作为母本时结实率不受影响(图4)。

综上所述，本发明通过对CsMLO12、CsMLO13基因的编辑，可快速获得黄瓜雄性不育系，用于黄瓜的群体改良及杂种优势利用。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种用于培育黄瓜雄性不育系的重组表达载体及其构建方法和应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1635

<212> DNA

<213> 黄瓜(Cucumis sativus)

<400> 1

atgggtggcg gtgccggtgc cggtggtccg agtagggagt tagatcaaac tccgacatgg 60

gccgttgccg ctgtttgtgc agtcatcatt cttatttcca tcatattgga aaaggttctt 120

cacatggttg gagagatatt tcaaaaaagg aaaaagaaag ccttgtatga agcgctcgag 180

aaagttaaag gagagcttat ggttttagga ttcatttctt tgctcttaac atttgggcaa 240

aattatattg ctaaagtttg tataccctca aagtatgaaa atactatgtt gccttgccct 300

tttagaggga gtagtactac tttacctaaa agctcccatc acgccgagcc tgatgatgat 360

gaagagactt ccgatcacca tcgtaggctt ctttggtacg agcatcgacg tctaggtggt 420

ggtggttctg tagaaggttg caaaccaggg tatacacaac ttatatctct aaatggtttg 480

catcaaatac atatcttcat cttctttcta gccgttctcc atgttgtatt tagtgccata 540

acgatgactc tcggaagatt gaaaattcgt gcgtggaagg tatgggaaag acagaccgaa 600

caagaacatg atgccatgaa cgatcctaca aggtttagac ttactcacga gacatccttt 660

gtgagagatc acagcagttt ttggaccaaa acccccctct ccttttactt tgtatgcttc 720

tggaggcaat tctttaggtc cgttagtagg ccagattact tgtcccttag acatggtttt 780

gtcactgtcc atttagcccc tgggagtaaa tttgactttc agaagtacat taaaaggtca 840

ttagaagatg actttaaggt ggtcgtggga atcagtcctc tgctatgggc atcaatggtg 900

ctttttctgc ttctcaatgt taatgggtgg caagttatgt tttgggtgtc tatatttcct 960

ctagtggtga tcttagctgt tggaacaaag ttgcaaggaa ttataacaca aatggctctt 1020

gaaatcaaag aaagacatgc agtggttcaa gggattcccc ttgttcaagt ctctgataga 1080

catttttggt ttagttggcc cattttggtt ctttatctca tccattatgt ccttttccag 1140

aatgcatttg agattacata tttcttttgg atatggtatg aatttgggtt gagatcatgc 1200

tttcatgaca actttgatct tattatcgcg agagttggtc taggggttgg agtccagatt 1260

ttgtgcagtt acattacact cccattatat gctcttgtaa ctcagatggg atcaacaatg 1320

aagaaatcca tatttgatga acaaacttcg aaagcattga agcaatggca tagaagtgct 1380

ttgaagaaaa agaacgaagg aggaaagcct gaaccaacgc cgatgcgaac tttaggcggt 1440

gccgttgttg ttggaggaag ccctcccgag tcaccgatac aacaaccttt gcatgatcaa 1500

ttccaacatc aaacaatgac tcaatcatca ccaaccgacg tcgaagcctc cgccgttcct 1560

tcagtcaaca taatgactac cgttgatctc caccaacaac agcaaaacta ttccaatcgt 1620

gacttgttga gatga 1635

<210> 2

<211> 1683

<212> DNA

<213> 黄瓜(Cucumis sativus)

<400> 2

atgttgctgg ttgtttatta tttgtgtttg agcttgttgt gggggaaatc gtggggggct 60

ccggccagcg atggcaccac gagggagctc gatcagactc cgacatgggc tgttgctggt 120

gtttgtgcta ttattatcct tatttctatc gccttggaga aactccttca taaagctgga 180

acgtggctca cggaaaagca caagagagct ctctttgaag ctctggagaa agttaaagct 240

gagctgatga ttctgggttt catttcactg ctcctcacct ttggacagaa ctacatcatt 300

aaaatatgca ttcccacaaa ggttgcaaat actatgttgc catgtgctgc caaagaggac 360

aaattggaga agggagatga aggcgaacat catcgacgac ttctaatgta tgaacggagg 420

ttcctggctg ctgctggtgg cgctgttagt tgcaaagaag gtcatgtgcc gcttatatct 480

atctcgggat tgcatcagtt gcacttgttt atcttcttct tagccgtatt tcatgtggta 540

tatagtgcca tcacaatgat gcttgggagg ctaaagattc gaggttggaa ggcatgggag 600

gaggagacct caactcacaa ttatgagttc tcaaatgata atgcacgatt caggcttact 660

cacgaaacat catttgtgaa agcccacacg agtttttgga caaaacttcc cgtcttcttt 720

tatattggat gcttcttccg acaatttttc aagtccgttg gtaaggctga ctacttggca 780

ttacgtaatg gattcatcgc cgttcacctt gctccaggaa gtaaatttga ctttcaaaaa 840

tatatcaaaa ggtctctaga agatgacttc aaaataattg tgggagttag tcccgtgctt 900

tggacatcgt ttgtggtctt cttgctcata aatgtttacg gatggcaagc attgttttgg 960

tcatccttag ttcctgtgat cataatccta gctgttggaa ccaagcttca aggagttatg 1020

acaaagatgg ctctcgaaat tacagaaaga catgctgttg tccaaggaat tcctctcgtt 1080

caggcatcag ataaatattt ttggtttggc aagcctcagc tggttcttta cctcatccac 1140

ttcgctttat tttcgaatgc attccaaata acatacttct tctggatttg gtattccttt 1200

gggttaaaat cctgcttcca tactgatttc aagctcgcaa tcattaaagt tggtctcggg 1260

gttggcgttc tctgtctctg cagttatata actcttccac tctatgctct tgtcactcag 1320

atgggtacgc gtatgaagaa gtcaatcttt gatgaacaaa catcgaaggc tcttaagaag 1380

tggcacatgg ctgttaagaa gcgacatggg aagtccccaa ctcgaaaact agggagtcca 1440

agttcatcac caattcatcc atcatcagga tacgcattgc atcgtttcaa gaccacaggt 1500

cactcaaaca gatcatccat gtatgatgag aatgacgcat cagattatga agtcgacact 1560

ccaaatttta cagttagaat agaccatggt gatgaacatc aagctgaaat aattgaaccc 1620

cagcatacag aaaaaaggaa tgaagacgat ttctcttttg tcaaacctgg accaacgaaa 1680

tga 1683

<210> 3

<211> 544

<212> PRT

<213> 黄瓜(Cucumis sativus)

<400> 3

Met Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Pro Ser Arg Glu Leu Asp Gln

1 5 10 15

Thr Pro Thr Trp Ala Val Ala Ala Val Cys Ala Val Ile Ile Leu Ile

20 25 30

Ser Ile Ile Leu Glu Lys Val Leu His Met Val Gly Glu Ile Phe Gln

35 40 45

Lys Arg Lys Lys Lys Ala Leu Tyr Glu Ala Leu Glu Lys Val Lys Gly

50 55 60

Glu Leu Met Val Leu Gly Phe Ile Ser Leu Leu Leu Thr Phe Gly Gln

65 70 75 80

Asn Tyr Ile Ala Lys Val Cys Ile Pro Ser Lys Tyr Glu Asn Thr Met

85 90 95

Leu Pro Cys Pro Phe Arg Gly Ser Ser Thr Thr Leu Pro Lys Ser Ser

100 105 110

His His Ala Glu Pro Asp Asp Asp Glu Glu Thr Ser Asp His His Arg

115 120 125

Arg Leu Leu Trp Tyr Glu His Arg Arg Leu Gly Gly Gly Gly Ser Val

130 135 140

Glu Gly Cys Lys Pro Gly Tyr Thr Gln Leu Ile Ser Leu Asn Gly Leu

145 150 155 160

His Gln Ile His Ile Phe Ile Phe Phe Leu Ala Val Leu His Val Val

165 170 175

Phe Ser Ala Ile Thr Met Thr Leu Gly Arg Leu Lys Ile Arg Ala Trp

180 185 190

Lys Val Trp Glu Arg Gln Thr Glu Gln Glu His Asp Ala Met Asn Asp

195 200 205

Pro Thr Arg Phe Arg Leu Thr His Glu Thr Ser Phe Val Arg Asp His

210 215 220

Ser Ser Phe Trp Thr Lys Thr Pro Leu Ser Phe Tyr Phe Val Cys Phe

225 230 235 240

Trp Arg Gln Phe Phe Arg Ser Val Ser Arg Pro Asp Tyr Leu Ser Leu

245 250 255

Arg His Gly Phe Val Thr Val His Leu Ala Pro Gly Ser Lys Phe Asp

260 265 270

Phe Gln Lys Tyr Ile Lys Arg Ser Leu Glu Asp Asp Phe Lys Val Val

275 280 285

Val Gly Ile Ser Pro Leu Leu Trp Ala Ser Met Val Leu Phe Leu Leu

290 295 300

Leu Asn Val Asn Gly Trp Gln Val Met Phe Trp Val Ser Ile Phe Pro

305 310 315 320

Leu Val Val Ile Leu Ala Val Gly Thr Lys Leu Gln Gly Ile Ile Thr

325 330 335

Gln Met Ala Leu Glu Ile Lys Glu Arg His Ala Val Val Gln Gly Ile

340 345 350

Pro Leu Val Gln Val Ser Asp Arg His Phe Trp Phe Ser Trp Pro Ile

355 360 365

Leu Val Leu Tyr Leu Ile His Tyr Val Leu Phe Gln Asn Ala Phe Glu

370 375 380

Ile Thr Tyr Phe Phe Trp Ile Trp Tyr Glu Phe Gly Leu Arg Ser Cys

385 390 395 400

Phe His Asp Asn Phe Asp Leu Ile Ile Ala Arg Val Gly Leu Gly Val

405 410 415

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420 425 430

Val Thr Gln Met Gly Ser Thr Met Lys Lys Ser Ile Phe Asp Glu Gln

435 440 445

Thr Ser Lys Ala Leu Lys Gln Trp His Arg Ser Ala Leu Lys Lys Lys

450 455 460

Asn Glu Gly Gly Lys Pro Glu Pro Thr Pro Met Arg Thr Leu Gly Gly

465 470 475 480

Ala Val Val Val Gly Gly Ser Pro Pro Glu Ser Pro Ile Gln Gln Pro

485 490 495

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500 505 510

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515 520 525

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<212> PRT

<213> 黄瓜(Cucumis sativus)

<400> 4

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Thr Pro Thr Trp Ala Val Ala Gly Val Cys Ala Ile Ile Ile Leu Ile

35 40 45

Ser Ile Ala Leu Glu Lys Leu Leu His Lys Ala Gly Thr Trp Leu Thr

50 55 60

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65 70 75 80

Glu Leu Met Ile Leu Gly Phe Ile Ser Leu Leu Leu Thr Phe Gly Gln

85 90 95

Asn Tyr Ile Ile Lys Ile Cys Ile Pro Thr Lys Val Ala Asn Thr Met

100 105 110

Leu Pro Cys Ala Ala Lys Glu Asp Lys Leu Glu Lys Gly Asp Glu Gly

115 120 125

Glu His His Arg Arg Leu Leu Met Tyr Glu Arg Arg Phe Leu Ala Ala

130 135 140

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145 150 155 160

Ile Ser Gly Leu His Gln Leu His Leu Phe Ile Phe Phe Leu Ala Val

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Phe His Val Val Tyr Ser Ala Ile Thr Met Met Leu Gly Arg Leu Lys

180 185 190

Ile Arg Gly Trp Lys Ala Trp Glu Glu Glu Thr Ser Thr His Asn Tyr

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210 215 220

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275 280 285

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370 375 380

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

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atgatgactg cacaaacagc gg 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

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tgatgatgac tgcacaaaca ggttttagag ctagaaatag c 41

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<212> DNA

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<212> DNA

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<210> 11

<211> 27

<212> DNA

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<400> 11

gattattgtt cacacaaggt tgcactc 27

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

gctgacccaa tttgacccat ctt 23

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

agtttctcca aggcgataga aataag 26

Claims

1.一种重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为在载体质粒的多克隆位点间插入黄瓜CsMLO12和CsMLO13基因的两个sgRNA靶点而得到，所述黄瓜CsMLO12基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，该基因编码具有如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的蛋白；所述黄瓜CsMLO13基因具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，该基因编码具有如SEQ IDNO:4所示氨基酸序列的蛋白。

2.如权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于：所述载体质粒为pKSE402质粒。

3.如权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于：所述两个sgRNA靶点的核苷酸序列分别为：

CsMLO12：SEQ ID NO:5所示的序列；

CsMLO13：SEQ ID NO:6所示的序列。

4.权利要求1-3任一项所述重组表达载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

5.如权利要求4所述重组表达载体的构建方法，其特征在于，所述引物的核苷酸序列分别为：

MLO12-DT1-BsF：SEQ ID NO:7所示的序列；

MLO12-DT1-F0：SEQ ID NO:8所示的序列；

MLO13-DT2-R0：SEQ ID NO:9所示的序列；

MLO13-DT2-BsR：SEQ ID NO:10所示的序列。

6.含有权利要求1-3任一项所述重组表达载体的工程菌。

7.含有权利要求1-3任一项所述重组表达载体的转基因根癌农杆菌。

8.权利要求1-3任一项所述的重组表达载体、权利要求6所述的工程菌、权利要求7所述的转基因农杆菌在培育黄瓜雄性不育系中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：采用CRISPR/Cas9基因编辑系统，定点敲除黄瓜的CsMLO12和CsMLO13基因结构域，使所述基因对应的蛋白功能缺失，造成黄瓜花粉管萌发缺陷从而使其雄性不育。