CN110467658A - 黄瓜CsGL2-LIKE基因及其参与调控雄花部分败育中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了黄瓜CsGL2‑LIKE基因及其参与调控雄花部分败育中的应用。本发明提供的黄瓜CsGL2‑LIKE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明构建了CsGL2‑LIKE基因的干扰载体，并利用农杆菌介导的转化技术将其转入黄瓜中，证明CsGL2‑LIKE基因的下调造成黄瓜雄蕊的形态以及花粉活力发生变化，导致转基因植物的雄花部分败育，花粉活力下降，花粉管伸长能力受阻，而雌花没有受到影响，说明CsGL2‑LIKE的功能与黄瓜雄花部分败育相关，暗示该基因可在黄瓜育种及品质改良中具有重要改良潜能作用。

Description

黄瓜CsGL2-LIKE基因及其参与调控雄花部分败育中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体地说，涉及黄瓜CsGL2-LIKE基因、其编码蛋白与应用。

背景技术

植物雄性不育指的是雄配子发育异常而雌配子正常发育，能接受外来花粉正常授粉的现象。根据遗传模式的差异，植物雄性不育主要分为核不育(Genic male sterility,GMS)和胞质不育(cytoplasmic male sterility,CMS)。而依据败育的时期和花药组织细胞学特征，雄性不育又分为绒毡层和花粉无细胞发育异常的孢子体不育(sporophytic male-sterility)和小孢子或花粉粒发育异常的配子体不育(gametophytic male-sterility)两种形式。雄性不育一直是育种中的热点，例如水稻中的雄性不育系大大提高了水稻的杂种优势提高了水稻的品质以及育种的效率。在其他物种如玉米、油菜、甘蓝等作物中得到了广泛应用。

黄瓜是世界范围内重要的栽种蔬菜之一，也是我国十大主要园艺作物之一。黄瓜的有关雄性不育的突变体目前只有5类：A、无花瓣不育突变体(ap)；B、多向性花粉败育(ms-l)；C、雄花败育的现象(ms-2)；D、花朵关闭；E、雄性不育(ms-3)。还有一些糖转运过程中的基因下调造成雄花败育这样的现象，如CsSUT1以及CsHT1。

黄瓜CsGL2-LIKE基因隶属于HD-ZIP IV家族，其家族基因在模式植物拟南芥中的报道主要以调控表皮毛和根毛的起始发育为主。迄今为止，无任何相关HD-ZIP IV参与黄瓜雄性不育的报道。

发明内容

本发明的目的是提供黄瓜CsGL2-LIKE基因及其参与调控雄花部分败育中的应用。

为实现本发明的目的，本发明将Csa3G484840定位候选基因。设计引物：5'-ATGGGTGCCGACATGTCCAA-3'和5'-TTAATCCTCCTCACAACACATGCTG-3'。运用PCR扩增的方法从黄瓜(Cumcumis sativus L.)cDNA中克隆得到该基因全长并将该基因片段命名为CsGL2-LIKE。然后构建黄瓜CsGL2-LIKE基因的重组表达载体，将重组表达载体成功转化黄瓜植株。获得的转化株系与同时期的对照株系相比，雄蕊的形态以及花粉活力发生变化并呈现转基因株系黄瓜雄花部分败育，花粉活力下降，花粉管伸长能力受阻。主要体现52％花粉管伸长受阻48％花粉的活性下降，后期收获种子明显干瘪。另外，花当天的雄花的鲜重相比于野生型明显减少。

具体地，本发明的提供的黄瓜CsGL2-LIKE蛋白，其具有：

1)如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或

2)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

本发明提供了编码所述CsGL2-LIKE蛋白的基因，其具有：

1)SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或

2)SEQ ID No.2所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或

3)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

含有CsGL2-LIKE基因的生物材料属于本发明的保护范围，所述生物材料为载体、转基因细胞系、工程菌、宿主细胞或表达盒。

进一步地，本发明提供了黄瓜CsGL2-LIKE蛋白或其编码基因或含有其编码基因的生物材料在制备转基因植物、植物遗传育种、提高育种效率中的应用。

进一步地，本发明提供了黄瓜CsGL2-LIKE蛋白或其编码基因或含有其编码基因的生物材料在调控植物雄性不育中的应用。

进一步地，本发明提供了黄瓜CsGL2-LIKE蛋白或其编码基因或含有其编码基因的生物材料在阻止植物雄花败育、或提高植物花粉活力、或提高花粉管伸长能力中的应用。

本发明提供了上述黄瓜CsGL2-LIKE蛋白的表达抑制剂、或黄瓜CsGL2-LIKE蛋白的表达干扰方法在制备转基因植物中的应用，所述的转基因植物表现为雄性不育、或雄花败育、或花粉活力下降、或花粉管伸长能力不足。

优选地，所述的植物为葫芦科蔬菜作物，优选黄瓜、西瓜、冬瓜、葫芦。

本发明提供了一种克隆黄瓜CsGL2-LIKE基因的引物对，其核苷酸序列含有如SEQID NO.4-5所示的序列。

含有核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示的引物对的试剂盒属于本发明的保护范围。

本发明提供了上述引物对或试剂盒在制备转基因黄瓜中的应用，所述的转基因黄瓜表现为：雄性不育、或雄花败育、或花粉活力下降、或花粉管伸长能力不足。

本发明的有益效果在于：本发明发现了CsGL2-LIKE基因的下调可造成黄瓜雄蕊的形态以及花粉活力发生变化，导致转基因植物的雄花部分败育，花粉活力下降，花粉管伸长能力受阻，后代收获种子大量干瘪。结果说明CsGL2-LIKE的功能与黄瓜雄花部分败育相关，暗示该基因可在黄瓜育种及品质改良中具有重要改良潜能作用。

附图说明

图1为黄瓜HD-ZIP IV家族蛋白的进化树分析图。

图2为通过原位杂交技术表明CsGL2-LIKE在雄花花药囊中大量表达。A,花前8天；B，负对照；C，果皮；D，雌花芽；E,子房；F,第四阶段的花芽。

图3A为CsGL2-LIKE干扰株系黄瓜的花粉活力情况，图3B为CsGL2-LIKE干扰株系黄瓜的花粉管伸长统计情况。#5、#7、#21分别表示CsGL2-LIKE的干扰表达3461的3个株系。

图4为干扰表达株系的荧光定量PCR分析，Actin为内参。其中#2、#3、#5、#7、#12、#15、#21、#25分别表示CsGL2-LIKE的干扰表达3461的8个株系，其中#25株系T0代未收获种子不做后期检测，WT-1，WT-2，WT-3为转基因空载得到的3个株系。

图5为野生型和CsGL2-LIKE干扰株系黄瓜的黄瓜果实对比图。

图6A为CsGL2-LIKE基因干扰株系的黄瓜与转基因空载的黄瓜植株表型，图6B与二者的雄花发育过程对比，图6C为野生型和CsGL2-LIKE干扰株系花当天雄花鲜重统计图。

图7A为CsGL2-LIKE干扰株系黄瓜的花粉活力统计数据，图7B为花粉管伸长统计数据。

图8为野生型和CsGL2-LIKE干扰株系黄瓜T2代收获黄瓜种子比较图。

具体实施方式

以下实施案例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的实验材料、试剂及仪器等，若无特殊说明，均可从商业途径得到，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1与黄瓜雄花部分败育相关基因CsGL2-LIKE的克隆

1、材料

以黄瓜3461(本实验室选育的品种)(Liu et al.,2015；Silencing of thegibberellin receptor homolog,CsGID1a,affects locule formation in cucumber(Cucumis sativus)fruit.NEW PHYTOLOGIST,210,551-563.)为试材，该品种属于两性系。将黄瓜种子播于日光温室中，田间管理与正常栽培管理一样。待植株出现雄花时，取雄花芽液氮速冻，存于-80℃冰箱保存，备用。

2、总RNA的提取与cDNA合成

(1)总RNA的提取

采用植物总RNA提取试剂盒(购自北京华越洋生物技术有限公司)提取黄瓜雄花芽的总RNA，并用DNase去除RNA样品中残留的DNA，并用Nanodrop测其RNA浓度。步骤如下：

在RNAase处理过的研钵中加入田间取的雄花芽，加入液氮研磨至粉末状。将研磨物转移至干净无RNA酶的2mL塑料离心管，加入1ml细胞裂解液(试剂盒自带)，上下摇晃混匀。

取300μl的去蛋白液(试剂盒自带)和200μl自备氯仿加入上述样品中，在振荡器上振荡30-60s混匀，此时溶液呈均匀的乳浊状。室温12000rpm离心3-5min，离心管中液体上下分层，中间为细胞破碎物。

将上清液(约600-800μl)转移到另一干净的2mL塑料离心管中，避免触及或吸取中间层细胞破碎物和下层有机溶剂。加入等体积的漂洗液，充分颠倒混匀。吸取700ul的溶液转移到试剂盒自带的离心吸附柱中，12000rpm室温离心30s，弃穿透液。将剩下的一半溶液转移到同一离心吸附柱中，12000rpm室温离心30s，弃穿透液。

加700μl洗柱液，12000rpm室温离心30s，弃穿透液。重复上述洗柱液一次。将空的吸附柱12000rpm室温离心1min，完全去除废液(此步十分重要)，否则残留的乙醇会影响后面RNA的使用。往吸附柱的中央加入50μl DNase反应液，室温静置15min，加入500μl通用洗柱液，12000rpm室温离心1min，弃穿透液。12000rpm室温离心1min，完全去除废液。

将离心吸附柱转移到新的1.5ml RNase-free收集管中，加入50-100μl RNA洗脱液，室温放置1-2min。12000rpm室温离心1min，离心管中溶液即为RNA样品，存放于-80℃待用。

(2)cDNA第一链的合成

以1μg黄瓜果实RNA为模板，利用Takara逆转录试剂盒合成cDNA第一链。反转录步骤参照该试剂盒的说明书。cDNA第一链合成后-20℃保存备用。

3、CsGL2-LIKE基因的克隆

根据拟南芥HD-ZIP IV家族蛋白的HD domain和START domain在黄瓜的基因组数据库(http://cucumber.genomics.org.cn/page/cucumber/index.jsp)进行Blast比对，选择Csa3M484840.1作为候选基因并通过NCBI库找到其正确的CDS序列并进行进化树构建，见图1，暂命名为CsGL2-LIKE，根据其CDS全长序列设计引物：

forward：5’-ATGGGTGCCGACATGTCCAA-3’(SEQ ID NO.4)；

reverse：5’-TTAATCCTCCTCACAACACATGCTG-3’(SEQ ID NO.5)。

4、CsGL2-LIKE基因在黄瓜各组织和各器官中的原位杂交试验

探针引物：

Forward5’-GATTTAGGTGACACTATAGaatGCTACAAGAGACG TCGAACAGAATCTG-3’(SEQID NO.6)；

Reverse5’-TGTAATACGACTCACTATAGGGTAGATTCGTCCTT AATGATGCAACC-3’(SEQ IDNO.7)。

后期试验完全按照Chen et al(2016)报道的试验方法进行。其结果表明CsGL2-LIKE在雄花花药囊中大量表达，见图2的A-F。

5、载体构建

(1)重组干扰表达载体的构建

选取CsGL2-LIKE基因的200～400bp的特异序列作为干扰片段(SEQ ID NO.3)，设计一对引物，序列如下：

Forward：5’-CGAGCAATTACGTATTAAGAATGCC-3’(SEQ ID NO.8)；

Reverse：5’-TCCGGACCCAAAGTGGGT-3’(SEQ ID NO.9)；

分别加上不同的酶切位点扩增正义片段和反义片段，正义片段两端引入酶切位点SpeI和BamHI，反义片段两端引入酶切位点AscI和SwaI。然后把正、反义片段分别连接到干扰表达载体pFGC1008的GUS两端，转化大肠杆菌后，经PCR和测序鉴定获得构建成功的干扰表达载体。提取质粒备用。

PCR扩增程序：

6、花粉活力和花粉管伸长检测

花粉活力测定：取花当天的花10朵，除去花瓣。在载玻片上滴上一滴0.5％TTC，并将雄蕊沾在溶液上，每个雄蕊沾上2-3张载玻片。在常温下黑暗处放置1个小时后在显微镜下观察花粉的活力，每张载玻片观察5个视野。共统计100个，染上红色的为有活力的花粉粒52，未染颜色为不育的花粉粒48个，并计算花粉的活力为52％，见图3A。

花粉管的伸长测定：取花当天的花10朵，除去花瓣。载玻片上滴上一滴培养基(10％蔗糖，10mg/L硼酸，0.5g琼脂)，每个雄蕊沾上2-3张载玻片，常温下放置20-30分钟后，显微镜下观察花粉管的伸长情况并拍照，每张载玻片观察5个视野，统计50个，其正常萌发率数量为24个，花粉管的萌发率48％。其结果见图3B。

实施例2、转基因植物的获得及其检测

1、黄瓜的遗传转化

(1)实施例1制得的重组表达载体转化农杆菌：打开Biorad电转仪预热，同时将电转杯放在冰上预冷，并放入紫外杀菌的超净工作台灭菌30min。将构建好的CsGL2-LIKE-pCAMBIA1008质粒(为实施例1步骤5构建得到的干扰表达载体)和pCAMBIA1008空载质粒500ng分别加入100μl的C58农杆菌感受态细胞，轻弹混匀(农杆菌感受态细胞提前置于冰上融化)将上述混合感受态加入电转杯的底部，然后盖上盖子后放在电转仪的座上进行电击。结束后在超净工作台加入300ul不含抗生素的液体YEB培养基至电转杯中，轻轻混匀细胞。之后吸取大量的细胞至1.5ml或2ml离心管中，28℃缓慢振荡培养1h-3h。结束振荡后吸取1-2ul液体菌液至含有氯霉素和利福平的YEB固体培养基上，分别用无菌的三角玻棒轻轻地均匀涂开，待平板表面干燥后，用封口膜封好平板，28℃倒置培养36-48hr。PCR鉴定筛选阳性菌，PCR鉴定所用的引物为：

CsGL2-LIKE-pCAMBIA1008干扰重组鉴定引物：

Forward：5’-GAGGACACGCTCGAGTATAAGAGCTCT-3’(SEQ ID NO.10)

Reverse：5’-TCCGGACCCAAAGTGGGT-3’(SEQ ID NO.11)

pCAMBIA1008干扰重组鉴定引物：

Forward：5’-GAGGACACGCTCGAGTATAAGAGCTCT-3’(SEQ ID NO.10)

Reverse：5’-GTTTACGCGTTGCTTCCGCC-3’(SEQ ID NO.12)

结果：分别获得了含有CsGL2-LIKE-pCAMBIA1008干扰重组载体C58农杆菌菌液以及pCAMBIA1008空载干扰重组载体C58农杆菌菌液。

(2)黄瓜转化

利用Chen等优化的农杆菌介导的黄瓜遗传转化技术(Chen et al.,2016；The WD-Repeat Protein CsTTG1Regulates Fruit Wart Formation through Interaction withthe Homeodomain-Leucine Zipper I Protein Mict.PLANT PHYSIOLOGIST,171,1156-1168.)，分为4个步骤：

①外植体的制备。取60℃左右的温水浸种后，待温水冷却后将种子剥壳后75％酒精消毒30s，3％次氯酸钠消毒12min铺于MS培养基上28℃暗培养2-3天。MS固体培养基(MS粉2.2g+15g蔗糖-PH5.6～5.8+植物凝胶1.0g+500ml去离子水)；

②外植体的侵染。准备好上述的农杆菌菌液。待下胚轴长出后，用镊子和手术刀分开子叶片，切除子叶的远端1/3和去除下胚轴。原菌液OD值达到0.6～0.8后离心去除上清液用MS液体培养基溶解后调侵染液OD值至0.1-0.2。将处理好的外植体放入侵染液进行超声15分钟后，用滤纸吸去多余的菌液，将外植体铺于共培养基上在28℃暗培养2-3天。共培养基(MS培养基+0.5mg/L6-BA+1mg/LABA)

③不定芽的分化。将上述侵染的外植体转移至分抗培养基上28℃光照18℃暗培养3-4周。分抗培养基(共培养基+400mg/L头孢噻亏)

④不定芽生根。将第三步产生的不定芽切下进行生根。生根培养基(MS固体培养基+200mg/L头孢噻亏)

⑤提取生长完全的植株的DNA经PCR鉴定等程序鉴定获得转基因阳性植株。

以上所有药品均购自西美杰公司。

2、荧光定量PCR对转基因黄瓜植株进行表型检测

(1)对所有转基因的黄瓜植株取雄花芽进行RNA提取及cDNA第一条链的合成与实施例1中相同。

(2)荧光定量分析所用试剂盒为SYBR Premix Ex Taq(TaKara，DRR041S)，仪器为ABI 7500，引物设计为：

CsGL2-LIKEF:5′-TTAGTGACCCTGGCGAACC-3′(SEQ ID NO.13)

CsGL2-LIKER:5′-CTTTATCTCCACCAAACATAGCG-3’(SEQ ID NO.14)；

荧光定量的反应体系为：

扩增程序为：95℃,30sec；(95℃,5sec；60℃,40sec),40cycles。以Actine基因为内参，利用2-△△Ct算法计算各基因表达量变化。

结果如图4所示，干扰转基因黄瓜得到8个株系。

实施例3、转基因植物的表型鉴定

通过构建CsGL2-LIKE RNAi干扰载体转化黄瓜获得8个转基因株系，其中CsGL2-LIKE RNAi表达量受到干扰比较严重的株系是#5，#7，#21及#25(见图4)。通过对转基因植株细致的观察，发现转基因植株果实果刺密度、大小较野生型相比无变化(见图5)。但在雄花发育上，转基因株系与野生型株系存在明显差异，表现在：(1)干扰株系雄花开放时间较野生型相比明显延迟(见图6A),内部结构较野生型相比发育尚未完全(见图6B)；雄花开放当天鲜重约为野生型的50％(见图6C)；(2)干扰株系雄花育性受到影响，主要体现在48％花粉活性下降(见图7A)；52％花粉管伸长受阻(见图7B),果实发育成熟后期收获种子明显干瘪(见图8)。上述结果充分证明雄花部分败育，花粉活力下降，花粉管伸长能力受阻，但雌花没有受到影响。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 黄瓜CsGL2-LIKE基因及其参与调控雄花部分败育中的应用

<130> KHP191113495.4

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 781

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gly Ala Asp Met Ser Asn Asn Asn Asn Thr Asn Asn Pro Leu Ala

1 5 10 15

Phe Thr Lys Asp Phe Phe Ser Ser Pro Ala Leu Ser Leu Thr Leu Ala

20 25 30

Gly Ile Phe Arg Arg Ser Asp His Glu Val Gly Asp Val Glu Met Glu

35 40 45

Glu Val Asp Asp Gly Ser Val Gly Gly Ala Arg Arg Asp Asn His Asp

50 55 60

Thr Met Thr Ala Glu Val Ser Ser Glu Asn Ser Gly Pro Val Val Arg

65 70 75 80

Ser Arg Ser Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gln

85 90 95

Asp Asp Gln Glu Asn Glu Leu Val Asp His Gly Cys Gln Leu Lys Arg

100 105 110

Arg Lys Lys Tyr His Arg His Thr Thr Glu Gln Ile Arg Glu Met Glu

115 120 125

Ala Leu Phe Lys Glu Ser Pro His Pro Asp Glu Lys Gln Arg Gln Gln

130 135 140

Leu Ser Lys Arg Leu Gly Leu Ser Pro Arg Gln Val Lys Phe Trp Phe

145 150 155 160

Gln Asn Arg Arg Thr Gln Ile Lys Ala Ile Gln Glu Arg His Glu Asn

165 170 175

Thr Leu Leu Lys Ala Glu Met Glu Lys Leu Arg Glu Glu Asn Lys Ala

180 185 190

Met Arg Glu Ile Ser Lys Lys Lys Ile Gly Cys Pro Asn Cys Gly Thr

195 200 205

Ala Asp Ala Thr Gln Asp Asp Leu Val Phe Thr Thr Thr Glu Gln Leu

210 215 220

Arg Ile Lys Asn Ala Lys Leu Lys Ala Glu Val Glu Lys Leu Arg Ala

225 230 235 240

Ala Leu Gly Lys Tyr Pro Gln Ala Ala Ala Ser Pro Ser Thr Tyr Ser

245 250 255

Ser Gly Asn Glu Gln Glu Thr Ser Asn Arg Ile Cys Leu Asp Phe Tyr

260 265 270

Thr Gly Ile Phe Gly Leu Glu Asn Ser Arg Ile Met Glu Lys Val Asp

275 280 285

Glu Ala Val Glu Glu Leu Lys Thr Met Ala Ala Ala Gly Asp Pro Leu

290 295 300

Trp Val Arg Ser Val Glu Thr Gly Arg Glu Ile Leu Asn Tyr Asp Glu

305 310 315 320

Tyr Leu Lys Thr Phe Gln Phe Ser Asn Asn Asn Ser Asn Thr Arg Asn

325 330 335

Cys Leu Lys Thr His Ile Glu Ala Ser Arg Glu Thr Ala Leu Val Phe

340 345 350

Met Glu Pro Ser Arg Leu Val Gln Ser Phe Met Asp Glu Asn Gln Trp

355 360 365

Lys Glu Met Phe Pro Phe Met Ile Ser Lys Ala Ala Thr Val Asp Val

370 375 380

Ile Cys Asn Gly Glu Ala Ala Lys Trp Asn Asn Gly Ala Val Gln Leu

385 390 395 400

Met Phe Ala Glu Val Gln Met Leu Thr Pro Leu Val Pro Thr Arg Glu

405 410 415

Met Tyr Phe Ile Arg His Cys Lys Gln Leu Asp Ala Glu Gln Trp Ala

420 425 430

Ile Val Asp Val Ser Ile Glu Asn Val Glu Asp Asn Asn Ile Asp Val

435 440 445

Ser Leu Val Lys Tyr Arg Lys Arg Pro Ser Gly Cys Ile Ile Lys Asp

450 455 460

Glu Ser Asn Gly His Cys Lys Val Thr Met Val Glu His Leu Glu Cys

465 470 475 480

Val Lys Asn Lys Val His Asn Leu Tyr Arg Ser Ile Val Asn Asn Gly

485 490 495

Thr Ala Phe Gly Ala Arg His Trp Met Ala Thr Leu Gln Leu Gln Cys

500 505 510

Glu Arg Ser Ala Phe Phe Met Ala Thr Asn Ile Pro Met Lys Asp Ser

515 520 525

Thr Gly Val Ser Thr Leu Ala Gly Arg Lys Ser Thr Leu Lys Leu Ala

530 535 540

Gln Arg Met Ser Cys Ser Phe Ser Gln Ala Val Ala Ala Ser Ser Tyr

545 550 555 560

Gln Thr Trp Thr Lys Val Val Gly Lys Ser Gly Glu Asp Ile Arg Val

565 570 575

Cys Ser Arg Lys Asn Leu Ser Asp Pro Gly Glu Pro Ile Gly Val Ile

580 585 590

Leu Cys Ala Val Ser Ser Leu Trp Leu Pro Leu Ser Pro His Leu Leu

595 600 605

Phe Asp Phe Phe Arg Asp Glu Ser Arg Arg Ser Gln Trp Asp Ala Met

610 615 620

Phe Gly Gly Asp Lys Ala Lys Thr Ile Ala Asn Leu Ala Lys Gly Gln

625 630 635 640

Asp Arg Gly Asn Ser Val Thr Ile Gln Thr Ile Gly Ser Lys Glu Asn

645 650 655

Asn Asn Asn Asn Met Trp Ile Leu Gln Asp Ser Ser Thr Asn Ser Ser

660 665 670

Glu Ser Met Val Val Tyr Ser Gly Val Asp Val Thr Ser Met Gln Ser

675 680 685

Val Met Ser Gly Cys Asp Ser Gly Ser Val Thr Ile Leu Pro Ser Gly

690 695 700

Phe Ser Ile Leu Pro Asp Gly Ala Asp Ser Arg Pro Pro Leu Leu Ile

705 710 715 720

Thr Arg Arg Lys Asp Asp Lys Thr Cys Asp Thr His Gly Gly Ala Leu

725 730 735

Leu Thr Ala Ala Val Gln Ile Leu Thr Asp Thr Ser Pro Ala Ala Lys

740 745 750

Pro Thr Leu Glu Ser Val Glu Tyr Val Lys Ser Ile Ile Cys Cys Thr

755 760 765

Leu Lys Asn Ile Arg Thr Ser Met Cys Cys Glu Glu Asp

770 775 780

<210> 2

<211> 2346

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgggtgccg acatgtccaa caacaacaat accaataatc ctcttgcttt caccaaagac 60

ttcttctctt ctccggctct ttctcttacc cttgcgggga tatttcgacg gagtgatcat 120

gaggtggggg atgtggagat ggaggaagtg gatgacggga gcgtgggtgg agccaggaga 180

gataatcatg ataccatgac agcggaagtt agtagtgaga attcgggacc ggtggtgagg 240

tctagatcgg aggaggaaga ggaggaggag gaggagggag gagggcagga tgatcaggag 300

aatgaattag tagatcatgg gtgtcagtta aagagaagga agaaatatca tcgccatacc 360

accgagcaga tcagagaaat ggaggcgttg tttaaagagt cgccacatcc agatgagaaa 420

caaaggcagc aactcagcaa gagattagga ctttcaccaa ggcaggtcaa gttttggttt 480

caaaatcgtc gaacccaaat caaagctatt caagagaggc atgaaaacac attgttaaaa 540

gctgaaatgg agaaacttcg agaagaaaat aaagccatga gagaaatttc caagaaaaaa 600

attggttgtc ccaattgtgg aactgccgac gctactcaag acgacctcgt tttcacaacc 660

accgagcaat tacgtattaa gaatgccaaa ctcaaagccg aggtcgagaa actacgagca 720

gcactgggaa aatatccaca agcggcagcg tctccatcga catactcgtc tgggaacgaa 780

caagagacgt cgaacagaat ctgcttagat ttttacacgg gaatatttgg acttgaaaat 840

tcaagaatca tggagaaagt tgatgaagca gttgaagagc tgaaaacaat ggctgcagcc 900

ggcgacccac tttgggtccg gagcgtggag acgggaagag agattttaaa ctacgatgag 960

tatttgaaaa cctttcagtt cagcaataat aattcaaaca ctcgtaattg cctcaaaaca 1020

cacattgagg cctcgagaga aacggctctt gttttcatgg agccatctag gttggttcaa 1080

agcttcatgg atgagaatca atggaaggaa atgtttcctt ttatgatatc aaaggcagct 1140

acagttgatg ttatttgtaa tggagaagct gccaaatgga ataatggtgc agtgcaattg 1200

atgtttgcag aagtgcaaat gcttacacca ttagtcccca caagagaaat gtatttcatt 1260

cgccattgca agcagctcga cgcagaacag tgggcaatcg ttgatgtttc aatcgaaaac 1320

gttgaagata acaatatcga tgtatcgtta gtgaaatata gaaaacgtcc ctctggttgc 1380

atcattaagg acgaatctaa tggtcattgc aaggtaacaa tggtggaaca tttggaatgt 1440

gtaaaaaaca aagttcacaa cttgtataga agcatagtga acaatggcac agccttcggg 1500

gcaagacatt ggatggcgac tcttcaactc caatgtgaac gttctgcttt cttcatggca 1560

acaaacatcc ccatgaaaga ctcaactgga gtgtcaacac tagctggaag aaaaagcacg 1620

ttaaagttgg cacagagaat gagttgtagc ttctcccaag cagttgcagc ttcaagttat 1680

caaacatgga ccaaagttgt ggggaaatca ggggaagaca ttagggtttg ttccaggaag 1740

aatcttagtg accctggcga accgattgga gtaattttgt gtgccgtttc ttctctttgg 1800

ttgcctcttt ctcctcatct tctctttgat ttctttcgag atgaatctcg tcgaagtcaa 1860

tgggacgcta tgtttggtgg agataaagct aagaccattg caaatttggc taaaggacag 1920

gatcgaggca actcagttac tattcaaaca ataggatcaa aagagaacaa taacaacaac 1980

atgtggatcc tacaagacag ctccacaaac tcatcggaat ccatggtggt ttactccgga 2040

gtagacgtta ccagcatgca gtcagttatg tcaggttgtg attccggcag cgtcaccatt 2100

ctcccttcag gtttttcaat tctccctgac ggcgccgatt cccgaccacc cctcctcatc 2160

actcgtcgta aagacgacaa aacttgcgac acacacggtg gggctctact gaccgccgcc 2220

gtccaaatcc taaccgacac atctcccgct gcaaaaccca cattggaatc ggttgagtac 2280

gttaaaagca tcatttgttg tacgttaaaa aatattagaa ccagcatgtg ttgtgaggag 2340

gattaa 2346

<210> 3

<211> 260

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgagcaatta cgtattaaga atgccaaact caaagccgag gtcgagaaac tacgagcagc 60

actgggaaaa tatccacaag cggcagcgtc tccatcgaca tactcgtctg ggaacgaaca 120

agagacgtcg aacagaatct gcttagattt ttacacggga atatttggac ttgaaaattc 180

aagaatcatg gagaaagttg atgaagcagt tgaagagctg aaaacaatgg ctgcagccgg 240

cgacccactt tgggtccgga 260

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgggtgccg acatgtccaa 20

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttaatcctcc tcacaacaca tgctg 25

<210> 6

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gatttaggtg acactataga atgctacaag agacgtcgaa cagaatctg 49

<210> 7

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgtaatacga ctcactatag ggtagattcg tccttaatga tgcaacc 47

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgagcaatta cgtattaaga atgcc 25

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tccggaccca aagtgggt 18

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaggacacgc tcgagtataa gagctct 27

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tccggaccca aagtgggt 18

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gtttacgcgt tgcttccgcc 20

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ttagtgaccc tggcgaacc 19

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctttatctcc accaaacata gcg 23

Claims (10)

1.黄瓜CsGL2-LIKE蛋白，其特征在于，其具有：

1)如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或

2)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因，其具有：

1)SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或

2)SEQ ID No.2所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或

3)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

3.含有权利要求2所述基因的生物材料，所述生物材料为载体、转基因细胞系、工程菌、宿主细胞或表达盒。

4.权利要求1所述黄瓜CsGL2-LIKE蛋白或其编码基因或权利要求3所述的生物材料在制备转基因植物、植物遗传育种、提高育种效率中的应用。

5.黄瓜CsGL2-LIKE蛋白或其编码基因或权利要求3所述的生物材料在调控植物雄性不育中的应用。

6.黄瓜CsGL2-LIKE蛋白或其编码基因或权利要求3所述的生物材料在阻止植物雄花败育、或提高植物花粉活力、或提高花粉管伸长能力中的应用。

7.黄瓜CsGL2-LIKE蛋白的表达抑制剂、或黄瓜CsGL2-LIKE蛋白的表达干扰方法在制备转基因植物中的应用，所述的转基因植物表现为雄性不育、或雄花败育、或花粉活力下降、或花粉管伸长能力不足。

8.如权利要求4-7任一所述的应用，其特征在于，所述的植物为葫芦科作物，优选黄瓜、甜瓜、苦瓜、西瓜、冬瓜、葫芦。

9.一种克隆黄瓜CsGL2-LIKE基因的引物对，其特征在于，其核苷酸序列含有如SEQ IDNO.4-5所示的序列。

10.权利要求9所述的引物对在制备转基因黄瓜中的应用，所述的转基因黄瓜表现为：雄性不育、或雄花败育、或花粉活力下降、或花粉管伸长能力不足。