CN114807168A

CN114807168A - 绿豆VrMIB1基因及其应用

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Publication number: CN114807168A
Application number: CN202210466051.8A
Authority: CN
Inventors: 李信; 贾亚会; 夏妍; 沈振国
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2022-04-29
Filing date: 2022-04-29
Publication date: 2022-07-29
Anticipated expiration: 2042-04-29
Also published as: CN114807168B

Abstract

本发明属于基因工程领域，涉及绿豆VrMIB1(MIB1BODY1)基因及其应用，本发明利用AL127野生种与mib1‑1突变种进行杂交，并基于已有的绿豆分子标记对VrMIB1基因进行精细定位。同时对突变体进行转录组测序分析，根据转录组结果对候选区间内的多个候选基因进行筛选与鉴定，寻找到突变基因VrMIB1基因，设计引物后通过PCR首次克隆得到VrMIB1基因。VrMIB1基因在对器官大小和果荚发育的调控上有着明显的作用，可用于豆类作物品种改良。

Description

绿豆VrMIB1基因及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及绿豆VrMIB1(MIB1BODY1)基因及其应用。

背景技术

绿豆(Vigna radiata L.)为豆科中一种重要作物，在我国栽培历史已经超过两千多年，是我国主要豆类作物之一。绿豆含有丰富的矿质元素、维生素、蛋白质等营养物质，绿豆还具有清热解毒、保肝明目、降低胆固醇、抗肿瘤和消炎等功效，是我国传统的药食两用作物之一。此外，豆科植物具有固氮培肥的能力，在我国农业结构调整中占据重要的作用。但与大宗作物相比绿豆单株产量以及效益低，这导致绿豆种植面积逐年减少，并严重影响了我国绿豆种植业的发展。在相同种植密度条件下，绿豆单产取决于单株产量，而单株产量是由单株荚数(pod number)、每荚种子数(seed number per pod，SNPP)和粒重(seedweight)三个因素决定。因此，挖掘有关绿豆果荚与种子大小的基因对绿豆产量的提高及绿豆种质资源的改良具有重要的意义。

MATE转运蛋白广泛存在于细菌、真菌、哺乳动物和植物中，根据氨基酸序列的相似性可将MATE转运蛋白家族分为三个亚家族，分别是NorM、DNA损伤-诱导蛋白F(DNA damage-inducible protein F，DinF)和真核MATE(eukaryotic MATE，eMATE)，它们通过利用跨膜H⁺和/或Na⁺的电化学梯度提供的驱动力而实现物质的外排。多数MATE转运蛋白由400～700个氨基酸残基构成，其结构一般由12个跨膜螺旋组成，并具有一个或者两个高度保守的MatE结构域。在植物中，MATE蛋白涉及多种功能，包括次级代谢物转运、异生素降解、铝耐受性和抗病性等，MATE蛋白还能通过控制植物激素的转运、顶端生长和衰老过程来调节整个植物的发育。

植物中的MATE基因的数量远远大于微生物和动物，拟南芥、苜蓿和水稻MATE基因家族中分别有58、70和53个预测基因，而在人类中仅发现2个MATE基因。水稻DG1基因编码一种MATE型转运蛋白，DG1转运蛋白可介导叶源性ABA向颖果的转运，从而确保籽粒的正常生长发育。ADP1/AtDTX51是拟南芥中一种预测的MATE转运蛋白，它可能通过介导分生组织部位的生长素水平来调控侧生器官的生长。玉米Bige1(GRMZM2G148937)基因编码一种定位于高尔基体的MATE蛋白，Bige1可以调节种子胚胎和胚乳的发育。此外，MATE转运蛋白还可以调节植物的胁迫反应，从而调节植物的生长过程。例如，AtDTX1作为拟南芥体内的外排转运体，可将植物产生的生物碱和抗生素运出植物细胞内。缺铁或铝胁迫会诱导花生中的柠檬酸转运蛋白AhFRDL1的表达，并参与铁由根向茎的转运和铝耐性。FeMATE1参与根系中铝诱导的柠檬酸盐分泌，而FeMATE2负责将柠檬酸盐运输到高尔基体中，再经由高尔基体将Al³⁺排出细胞外，从而实现荞麦根和叶的解毒。

在绿豆中，目前尚未有与果荚和籽粒大小相关的QTL被克隆出来，现发现VrMIB1基因在对器官大小和果荚发育的调控上有着明显的作用，因此对VrMIB1基因功能的研究及其应用具有着重要的作用。

发明内容

本发明的目的使针对现有的对豆类品种改良的不足，提供一种新的绿豆VrMIB1基因。本发明的另外一个目的使提供VrMIB1基因的应用。

本发明的另一目的使提供绿豆VrMIB1基因的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种绿豆VrMIB1基因，所述绿豆VrMIB1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供一种绿豆VrMIB1蛋白，由上述基因编码而成，所述蛋白的序列如SEQID NO.2所示。

本发明还提供含有上述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。

本发明还提供上述基因在改变果荚长度和籽粒大小中的应用。

一种提高植物果荚长度和籽粒大小的方法，所述方法包括提高目的植物中上述述蛋白质的含量和/或活性，得到果荚长度和籽粒大小大于所述目的植物的植株。

进一步的，所述提高目的植物中权利要求2所述蛋白质的含量和/或活性通过提高目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量实现。

进一步的，所述提高目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量通过将权利要求2所述蛋白质的编码基因导入所述目的植物实现。

进一步的，含有权利要求1所述基因的重组质粒的同源重组引物序列为：

进一步的，含有权利要求1所述基因的重组载体的阳性克隆鉴定引物序列为：

进一步的，VrMIB1基因表达量检测采用的引物序列为：

所述绿豆VrMIB1基因的重组表达载体优选将VrMIB1基因插入到表达载体pCAMBIA1304的SpeI酶切位点所得。

所述的宿主细胞优选农杆菌。

本发明所述的VrMIB1基因在改变绿豆果荚和籽粒中的应用。

所述的含有VrMIB1基因的重组表达载体在改变绿豆果荚和籽粒中的应用。

有益效果

实验室用伽马射线照射‘苏绿1号’(以下简称Sulu)，构建了绿豆突变体库，本研究从中选用了三个器官变小、果荚变短、部分叶片表现出五出复叶的突变体材料。突变体间杂交，F1代出现与亲本不同的性状，表明三个突变体是等位突变。实验室将Sulu野生种与mib1突变体进行杂交，将收获的F1代种子继续种植，观察到F1代表型与野生型完全一致；收获F2代种子继续种植，观察记录F2代群体单株果荚和叶的表型并测量突变体表型与野生型表型的比例，测量结果表明群体中突变体表型植株与野生型表型植株的比例接近1:3，卡方检验结果表明mib1突变体由隐性单基因控制。综合突变体表型特征将该突变基因命名为MIB1(Mini body 1)，而三个突变体材料分别命名为mib1-1、mib1-2和mib1-3。本发明利用AL127野生种与mib1-1突变种进行杂交，并基于已有的绿豆分子标记对VrMIB1基因进行精细定位。同时对突变体进行转录组测序分析，根据转录组结果对候选区间内的多个候选基因进行筛选与鉴定，寻找到突变基因VrMIB1基因，设计引物后通过PCR首次克隆得到VrMIB1基因。

VrMIB1蛋白包含一个MATE蛋白家族特有的MatE保守结构域，它和豇豆(Vignaunguiculata)、赤豆(Vigna angularis)、菜豆(Phaseolus vulgaris)都具有较高的同源性。在系统进化树中VrMIB1蛋白与拟南芥AtDTX54(MATE45)、AtDTX51蛋白在一个分支上，亲缘关系较近，其中与AtDTX54亲缘关系最近。其中，AtDTX54基因突变后，突变体植株的果荚变短，对脱落酸更为敏感。与野生型绿豆相比，突变体mib1的果荚变短、每荚粒数减少。其中，Sulu的平均果荚长度为9.8cm，而mib1-1、mib1-2、mib1-3的平均果荚长度分别为6.7、6.6、7.3cm，与野生型相比，突变体的果荚长度减少了26％-33％；Sulu的平均单荚粒数达11.3粒，而mib1-1、mib1-2、mib1-3的平均单荚粒数分别为8.5、8.7、9.9粒，与野生型相比，突变体的单荚粒数分别减少了25％、23％、12％。与野生型绿豆的种子相比，突变体种子显著变小。其中，Sulu种子的平均长、宽、厚分别为0.60、0.43、0.44cm，mib1种子的平均长、宽、厚分别为0.50、0.41、0.40cm，突变体种子的平均平均长、宽、厚相较于野生型分别减少了17％、5％、9％；Sulu的平均百粒重为6.71g，而mib1-1、mib1-2、mib1-3的平均百粒重分别为4.91、5.46、4.87g，由此可知，相较于野生型，突变体的百粒重依次减少了27％、19％、27％。除此之外，其他物种中MATE蛋白的功能涉及多个方面，但参与器官大小调控的报道不多。可见，本发明的绿豆VrMIB1基因在对器官大小调控上具有较高的研究价值。

与野生型拟南芥果荚相比，转VrMIB1基因的野生型拟南芥果荚未表现出果荚变长。但转VrMIB1基因的mate45拟南芥果荚与mate45相比，果荚显著变长。测量发现，mate45的平均果荚长度为0.96cm，而两个回补家系的平均果荚长度可达1.3cm，与突变体相比，回补家系的果荚长度增加了38％。由此可见，MIB1基因在植物中具有功能保守性。

附图说明

图1绿豆mib1突变体果荚表型图。A：Sulu和mib1突变体灌浆期果荚表型。B：Sulu和mib1突变体成熟期果荚表型。C：Sulu和mib1突变体果荚长度。D：Sulu和mib1突变体每荚粒数。

图2绿豆mib1突变体籽粒表型图。A：Sulu和mib1突变体种子表型。B：Sulu和mib1突变体种子长宽厚。C：Sulu和mib1突变体百粒重。

图3幼嫩果荚种植物内源性激素含量。

图4绿豆VrMIB1蛋白系统进化树。

图5绿豆VrMIB1基因片段凝胶电泳图。

图6pCAMBIA1304-VrMIB1表达载体的构建。A：pCAMBIA1304质粒SpeI单酶切，左为pCAMBIA1304环状质粒，右为SpeI酶切后的线性条带。B：带有SpeI酶切位点的绿豆VrMIB1基因片段。C：pCAMBIA1304-VrMIB1表达载体成功转化大肠杆菌E.coli DH5α后的菌落PCR图。

图7pET32a-MIB1表达载体的构建。A：pET32a(+)质粒BamHI及HindIII双酶切，左侧为pET32a(+)质粒，中间为BamHI及HindIII双酶切后的线性条带，右侧为带有双酶切位点的绿豆VrMIB1基因片段。B：pET32a-MIB1表达载体成功转化大肠杆菌E.coli DH5α后的菌落PCR图。

图8MIB1蛋白转运功能的分析。A：表达绿豆VrMIB1基因的回补菌株表型图。B：表达绿豆VrMIB1基因的回补菌株生长曲线。

图9转VrMIB1基因拟南芥阳性植株的鉴定。A：潮霉素抗性平板筛选转基因拟南芥。B：转基因拟南芥DNA水平鉴定。C：回补拟南芥家系VrMIB1基因表达水平鉴定。D：过表达拟南芥家系VrMIB1基因表达水平鉴定。

图10 Col和VrMIB1转基因拟南芥果荚及籽粒表型。A：Col、mate45和拟南芥回补家系果荚及籽粒表型图。B：Col和拟南芥过表达家系果荚及籽粒表型图。C：Col、mate45和拟南芥回补家系果荚长度。D：Col及拟南芥过表达家系果荚长度。

图11MIB1基因的突变位置。

具体实施方式

实施例1基因克隆

使用Omega Bio-tek公司生产的植物RNA提取试剂盒，Plant RNA Kit R6827-01提取野生型绿豆Sulu茎尖组织总RNA。第一链cDNA的合成使用Takara Bio公司生产的反转录试剂盒，Takara PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)RR047A。为了减少扩增突变，本研究扩增PCR片段均使用Hieff

Gold HighFidelity DNA Ploymerase高保真酶，PCR反应体系如表1所示：

表1 PCR反应体系

反应程序如表2所示：

表2 PCR反应程序

由于本文所用的Hieff

Gold High Fidelity DNA Ploymerase高保真酶在PCR反应时不具有在两端添加‘A’碱基的特性，要进行T连接反应需在PCR终延伸结束后，向50μL反应体系中添加0.25μL的rTaq酶，然后于72℃PCR保温15min。采用1％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测(图5)，查看片段大小符合预期后进行凝胶片段的回收，回收目的片段连接pMT19载体得到pMT19-VrMIB1质粒，连接体系如表3所示：

表3 T连接反应

将连接产物转化到E.coli DH5α感受态大肠杆菌中，随机挑取5个单菌落进行测序，测序结果如：SEQ ID NO.2所示。测序后在NCBI进行Blastn比对分析，将成功克隆出的VrMIB1基因在pMT19-VrMIB1质粒在保存。

实施例2载体构建

(1)PCR扩增目的片段：挑选经测序验证的包含VrMIB1基因的克隆进行扩大培养，并提取pMT19-VrMIB1质粒。以pMT19-VrMIB1质粒为模板，扩增带有同源臂的VrMIB1基因，反应体系和反应程序分别如表1和表2。同源重组引物如表4：

表4 pMT19-VrMIB1质粒的同源重组引物

注：actagt为SpeI酶切位点；ggatcc为BamHI酶切位点；aagctt为HindIII酶切位点。

采用1％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测(图4)，查看片段大小符合预期后进行凝胶片段的回收。

(2)pCAMBIA1304表达载体线性化：使用Takara的限制性内切酶SpeI对pCAMBIA1304质粒进行单酶切，酶切体系如表5：

表5 单酶切反应体系

(3)pET32a(+)原核表达载体线性化：使用Takara的限制性内切酶BamHI和HindIII对pET32a(+)质粒进行双酶切，酶切体系如表6：

表6 单酶切反应体系

反应体系配制完成后，轻弹混匀，于37℃下反应2h。用1％凝胶电泳检测，并将线性载体片段切胶回。

(3)连接反应：使用同源重组试剂盒Hieff

Plus One Step Cloning Kit将得到的线性载体和扩增得到的带有同源臂的目的片段进行酶连反应，体系如表7：

表7 酶连反应体系

反应体系配制完成后，轻弹混匀，于50℃水浴20min后，再冰浴5min，并进行转化实验。

(4)转化反应：采用热激法将连接产物转入大肠杆菌，方法为：取-80℃保存的大肠杆菌感受态，置于冰上静待融化。向50μL感受态中加入5μL同源重组连接产物，轻弹混匀，依次冰浴30min、42℃热激60sec、冰浴5min。加入1mL无抗性LB液体培养基，于37℃，200rpm，振荡1h。3000rpm，离心5min，去部分上清，留100μL重悬，取80μL涂布于含相应抗性的LB固体培养基上，37℃倒置培养14h左右。

(5)阳性克隆的鉴定：挑选单菌落进行PCR鉴定，鉴定引物如表8：

表8 pMT19-VrMIB1阳性克隆鉴定引物

反应体系和反应程序如表9和10。

表9 PCR反应体系

表10 PCR反应程序

采用1％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测(图6-7)，查看片段大小符合预期后挑选含有目的基因的阳性克隆进一步扩大培养，并提取重组质粒pCAMBIA1304-VrMIB1及pET32a-MIB1质粒。

实施例3植物内源性激素测定

以甲醇(0.1％甲酸)为溶剂配制梯度为0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、200ng/mL的IAA、ABA、SA标准液，并加入终浓度为20ng/mL的内标溶液，在实际绘制标准曲线方程时剔除线性异常点。

将超低温保存的样本于液氮中研磨成干粉，称取0.2g新鲜植物样品于玻璃试管中。向玻璃试管中加入异丙醇-水-盐酸混合提取液。添加8μL 1μg/mL的内标溶液，低温振荡30min。加入二氯甲烷，低温振荡30min。于13000r/min低温离心5mim，取下层有机相。在避光条件下，用氮气吹干有机相，并以甲醇(0.1％甲酸)复溶。于4℃13000×g离心10min，取上清液过0.22μm滤膜，HPLC-MS/MS检测(图3)。

实施例4 MIB1转运功能分析

将测序成功的质粒pET32a-MIB1以及空载pET32a分别转化野生型菌株K12和突变体菌株ΔacrB。从LB固体培养基(含100μg/mL Amp)上挑选单克隆(三个生物学重复)于1mL的LB液体培养基中(含100μg/mL Amp)中，于37℃，200rpm振荡5h左右，之后进行菌液PCR验证，PCR反应体系和程序参考表8和表9。将PCR检测成功的大肠杆菌菌液以1:1000的比例分别接种于10mL LB液体培养基(含100μg/mL Amp和1mM IPTG)中，于30℃，200rpm振荡培养12-16h，测OD₆₀₀。将三个重复菌液分别稀释到5mL含Amp和IPTG的LB液体培养基中，使OD₆₀₀调到0.4。将三个重复菌液分别稀释到5mL含Amp和IPTG的LB液体培养基中，使OD₆₀₀调到1.0。取OD₆₀₀＝1.0的稀释菌液2.5mL分别加入到50mL含Amp和IPTG的LB液体培养基中，充分混匀，于23℃，200rpm继续培养24h，并每隔4h测OD₆₀₀。将OD₆₀₀＝0.4的稀释菌液以10倍梯度稀释(100、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4)，然后取2.5μL点到含有不同浓度的TBA(浓度梯度系列：0、5、15、25g/L)的LB固体培养基上平板上(含100μg/mLAmp和1mM IPTG)(图8)。

实施例5 VrMIB1基因转化拟南芥及检测

(1)农杆菌GV3101的转化：将农杆菌感受态细胞从-80℃冰箱取出，置于冰上静待融化。将重组质粒pCAMBIA1304-VrMIB1与感受态细胞以1:1的比例混合，轻轻弹匀，依次冰浴10min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min。加入700μL无抗性的YEB液体培养基，于28℃，200rpm振荡培养2-3h。6000rpm离心2min，弃部分上清，留100μL重悬，吸取80μL涂布于含Rif和Kan的YEB固体培养基上，于28℃倒置培养2-3d。挑选单菌落于并按照表8和表9对菌液进行PCR反应。挑选验证成功的包含VrMIB1基因的克隆进行扩大培养。

(2)遗传转化：选用已经抽薹并少量开花、生长健壮的拟南芥植株，去除果荚和完全开放的花，留下未开放的花苞。菌液在高速离心机内5000×g，离心20min，弃上清。用5％蔗糖悬浮液重新悬浮，再加入0.2％(200μL/L)Silwet L-77，悬浮OD600至0.8-1.0。农杆菌菌液置于50mL离心管，将拟南芥花序浸没在菌液中侵染35sec。将侵染过的拟南芥平放，加盖避光24h，次日于正常条件继续培养。5-6d后进行第二次转化，共转化3次。3-4周后新的果荚长出并开始成熟，收取褐色并干枯的果荚内种子，在37℃培养箱中烘干水分并放4℃冰箱保存。

(3)T1代转基因拟南芥初筛：pCAMBIA1304质粒包含一个潮霉素(Hyg)的报告基因，因此T1代转基因拟南芥由加入50μg/mL Hyg的1/2MS培养基筛选。将侵染后的拟南芥种子消毒后播种到含有Hyg的1/2MS培养基上，生根并长出叶子后转移到蛭石与营养土比例为3:1的混合物中，于人工气候培养箱中继续生长。

(4)T1转基因拟南芥DNA检测：待拟南芥长出6-9片莲座叶时，使用TPS试剂提取拟南芥叶片gDNA。取拟南芥莲座叶约100mg，剪碎放置于2mL离心管中，利用高通量组织研磨仪60Hz，研磨5min。加入600μL TPS溶液，75℃水浴30min，期间每10min振荡1次。12000rpm离心10min，吸取400-500μL上清液，置于新的1.5mL离心管中，1:1加入异丙醇后充分混匀。-20℃放置30min，12000rpm离心15min，弃上清后加入1mL的75％乙醇，混匀。于12000rpm离心5min，弃上清，烘干后加入30μL灭菌ddH₂O，充分涡旋后放置-20℃备用。用OE-MIB1-JF和OE-MIB1-JR作为引物鉴定阳性植株。鉴定体系和程序如表9和表10，琼脂糖凝胶电泳检测条带大小是否正确。

(5)T2代转基因拟南芥VrMIB1相对表达量检测：将上述最终鉴定出的阳性拟南芥植株于人工气候培养箱中继续培养，并收取T2代种子，将收取的种子依次经过潮霉素培养基筛选、DNA水平鉴定，最终得到2个回补拟南芥家系、2个过表达拟南芥家系(图9-10)，提取鉴定成功的拟南芥苗的RNA，然后测定VrMIB1基因的表达量。以拟南芥管家基因作为内参基因进行qRT-PCR检测，所用引物见表11。

表11 qRT-PCR所用引物序列

图1为绿豆mib1突变体果荚表型图。A：Sulu和mib1突变体灌浆期果荚表型。B：Sulu和mib1突变体成熟期果荚表型。C：Sulu和mib1突变体果荚长度。D：Sulu和mib1突变体每荚粒数。与野生型绿豆相比，突变体mib1的果荚变短、每荚粒数减少。其中，Sulu的平均果荚长度为9.8cm，而mib1-1、mib1-2、mib1-3的平均果荚长度分别为6.7、6.6、7.3cm，与野生型相比，突变体的果荚长度减少了26％-33％；Sulu的平均单荚粒数达11.3粒，而mib1-1、mib1-2、mib1-3的平均单荚粒数分别为8.5、8.7、9.9粒，与野生型相比，突变体的单荚粒数分别减少了25％、23％、12％。

图2为绿豆mib1突变体籽粒表型图。A：Sulu和mib1突变体种子表型。B：Sulu和mib1突变体种子长宽厚。C：Sulu和mib1突变体百粒重。与野生型绿豆的种子相比，突变体种子显著变小。其中，Sulu种子的平均长、宽、厚分别为0.60、0.43、0.44cm，mib1种子的平均长、宽、厚分别为0.50、0.41、0.40cm，突变体种子的平均平均长、宽、厚相较于野生型分别减少了17％、5％、9％；Sulu的平均百粒重为6.71g，而mib1-1、mib1-2、mib1-3的平均百粒重分别为4.91、5.46、4.87g，由此可知，相较于野生型，突变体的百粒重依次减少了27％、19％、27％。由此可以，绿豆MIB1基因对器官大小调控具有显著的作用。

图3为幼嫩果荚种植物内源性激素含量。分别采集Sulu及mib1-3的幼嫩果荚，测量其内源性植物激素含量。其中，野生型果荚中IAA、ABA、SA的激素含量分别为57.2、70.0、41，而mib1-3的激素含量分别为38.7、72.7、23.0ng/g。IAA和SA含量下降。

图8为MIB1蛋白转运功能的分析。A：表达绿豆VrMIB1基因的回补菌株表型图。B：表达绿豆VrMIB1基因的回补菌株生长曲线。用不同浓度的TBA分别处理野生菌株K12+pET32a、过表达菌株K12+pET32a-MIB1、突变体菌株ΔAcrB+pET32a和回补菌株ΔAcrB+pET32a-MIB1，观察其表型特征并测定其生长曲线。结果表明，在0g/L TBA条件下，野生菌株、过表达菌株、回补菌株的生长速率无明显差异，而突变菌株的生长速率低于其余三种菌株，这可能是由于acrB基因突变对菌株的正常生长产生了一定影响。之后用不同浓度的TBA处理后，所有菌株的生长都不同程度的受到抑制。在10g/L与15g/L的TBA处理下，野生菌株、过表达菌株和回补菌株的生长曲线无明显不同，而突变体菌株的生长曲线则完全受到抑制。这组实验结果表明，MIB1蛋白具有向外转运有毒物质的功能。

图10为Col和VrMIB1转基因拟南芥果荚及籽粒表型。与野生型拟南芥果荚相比，转VrMIB1基因的野生型拟南芥果荚未表现出果荚变长。但转VrMIB1基因的mate45拟南芥果荚与mate45相比，果荚显著变长。测量发现，mate45的平均果荚长度为0.96cm，而两个回补家系的平均果荚长度可达1.3cm，与突变体相比，回补家系的果荚长度增加了38％。由此可见，MIB1基因在植物中具有功能保守性。

图11为MIB1基因的突变位置。mib1-1和mib1-2分别在第二个外显子的1225和1000位置上存在一个C和G的碱基缺失，单碱基的缺失导致缺失位点后的序列发生移码，并使翻译提前终止；mib1-3在第二个外显子的1203-1223区段存在一个21bp的片段缺失，片段的缺失导致后面的氨基酸序列发生移码突变。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 绿豆VrMIB1基因及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1524

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggagaca acaaagatca ggatttcttt tcccacaaat ttcccacaac ctctcaggtg 60

gtggaagaga tgaaggagct gtggggcatg gctctaccta tcacagctat gaatgtgttg 120

gtgtttgtga gggcagtggt ttctgttctc ttcttgggta ggcttggaag cctagagcta 180

gcaggtggtg cactttccat aggcttcacc aacataacag ggtactctgt tcttgtgggt 240

cttgcatcag gcctagaacc tgtgtgcagc caagcctatg gtagcaaaaa ctgggacctc 300

ctctctctat ctctccaacg catggtccta atccttctca tggcaatcat tcccataagt 360

cttctctggc tgaaccttga gaggatcatg ctgttcatgg gccaagacag tgccataaca 420

ggaatggcat caatctactg tttctactct ctaccagacc ttttaacaaa caccttgctc 480

caaccattaa gggttttttt aaggtcccaa aaggtgacca aacctttgat gtattgctcc 540

cttgtagcag tgttgttcca tgttccactg aactacttgt tggtggtggt gatggagctg 600

ggggtgcccg gggtggccat ggcttctgtg atgaccaatc tgaacatggt ggtgcttatt 660

gcagggtatg tgtgtgtgtg caggaagagg gagatggcgt tgaagtgggg atgtggaggg 720

ggagtggtgg ctagtttgtg ttctgggttg gggcagttga tggagtttgc tgtgcctagt 780

tgccttatga tatgtttaga gtggtggtgg tacgagattg tgactgtgct ggctgggtac 840

ttgccacgtc caacactggc tgtggctgcc actggtattc tgattcagac aactagcatg 900

atgtacactg tccccatggc acttgcaggg tgtgtttctg ccagggtagg gaatgagctt 960

ggagctggaa aaccatacaa ggcaaagcta gcagcaatgg ttgcattagg atgtgcattt 1020

gtgataggct tcatcaatgt gacatggact gtgatattag gtcaaagatg ggccgggctt 1080

ttcaccgatg atgagccagt caaagccttg gttgcctcag tgatgccaat tatgggcctg 1140

tgtgagcttg ggaactgccc acaaaccacg ggctgtggga ttctgcgtgg cacagcacgg 1200

cctggtgtgg gggcccatat aaacctgggc tcattctact tcgtgggcat tccggtggcg 1260

gtgggtctgg cattttggtt caaggttggg ttcagtgggc tttggtttgg gcttctgtct 1320

gcccaggtgg catgtgcagt gtcaatcatg tatgtggtgt tggtgaggac tgattgggaa 1380

gctgaggccc tgaaggctga aaagctcaca agggtggaaa tgggaagttg caatgggctt 1440

aggaacaagg agagtgagaa agatgaggaa atgaaaaggt tgttgggaaa tggaaatagg 1500

aacaacaaag atgacatttg ctaa 1524

<210> 2

<211> 507

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gly Asp Asn Lys Asp Gln Asp Phe Phe Ser His Lys Phe Pro Thr

1 5 10 15

Thr Ser Gln Val Val Glu Glu Met Lys Glu Leu Trp Gly Met Ala Leu

20 25 30

Pro Ile Thr Ala Met Asn Val Leu Val Phe Val Arg Ala Val Val Ser

35 40 45

Val Leu Phe Leu Gly Arg Leu Gly Ser Leu Glu Leu Ala Gly Gly Ala

50 55 60

Leu Ser Ile Gly Phe Thr Asn Ile Thr Gly Tyr Ser Val Leu Val Gly

65 70 75 80

Leu Ala Ser Gly Leu Glu Pro Val Cys Ser Gln Ala Tyr Gly Ser Lys

85 90 95

Asn Trp Asp Leu Leu Ser Leu Ser Leu Gln Arg Met Val Leu Ile Leu

100 105 110

Leu Met Ala Ile Ile Pro Ile Ser Leu Leu Trp Leu Asn Leu Glu Arg

115 120 125

Ile Met Leu Phe Met Gly Gln Asp Ser Ala Ile Thr Gly Met Ala Ser

130 135 140

Ile Tyr Cys Phe Tyr Ser Leu Pro Asp Leu Leu Thr Asn Thr Leu Leu

145 150 155 160

Gln Pro Leu Arg Val Phe Leu Arg Ser Gln Lys Val Thr Lys Pro Leu

165 170 175

Met Tyr Cys Ser Leu Val Ala Val Leu Phe His Val Pro Leu Asn Tyr

180 185 190

Leu Leu Val Val Val Met Glu Leu Gly Val Pro Gly Val Ala Met Ala

195 200 205

Ser Val Met Thr Asn Leu Asn Met Val Val Leu Ile Ala Gly Tyr Val

210 215 220

Cys Val Cys Arg Lys Arg Glu Met Ala Leu Lys Trp Gly Cys Gly Gly

225 230 235 240

Gly Val Val Ala Ser Leu Cys Ser Gly Leu Gly Gln Leu Met Glu Phe

245 250 255

Ala Val Pro Ser Cys Leu Met Ile Cys Leu Glu Trp Trp Trp Tyr Glu

260 265 270

Ile Val Thr Val Leu Ala Gly Tyr Leu Pro Arg Pro Thr Leu Ala Val

275 280 285

Ala Ala Thr Gly Ile Leu Ile Gln Thr Thr Ser Met Met Tyr Thr Val

290 295 300

Pro Met Ala Leu Ala Gly Cys Val Ser Ala Arg Val Gly Asn Glu Leu

305 310 315 320

Gly Ala Gly Lys Pro Tyr Lys Ala Lys Leu Ala Ala Met Val Ala Leu

325 330 335

Gly Cys Ala Phe Val Ile Gly Phe Ile Asn Val Thr Trp Thr Val Ile

340 345 350

Leu Gly Gln Arg Trp Ala Gly Leu Phe Thr Asp Asp Glu Pro Val Lys

355 360 365

Ala Leu Val Ala Ser Val Met Pro Ile Met Gly Leu Cys Glu Leu Gly

370 375 380

Asn Cys Pro Gln Thr Thr Gly Cys Gly Ile Leu Arg Gly Thr Ala Arg

385 390 395 400

Pro Gly Val Gly Ala His Ile Asn Leu Gly Ser Phe Tyr Phe Val Gly

405 410 415

Ile Pro Val Ala Val Gly Leu Ala Phe Trp Phe Lys Val Gly Phe Ser

420 425 430

Gly Leu Trp Phe Gly Leu Leu Ser Ala Gln Val Ala Cys Ala Val Ser

435 440 445

Ile Met Tyr Val Val Leu Val Arg Thr Asp Trp Glu Ala Glu Ala Leu

450 455 460

Lys Ala Glu Lys Leu Thr Arg Val Glu Met Gly Ser Cys Asn Gly Leu

465 470 475 480

Arg Asn Lys Glu Ser Glu Lys Asp Glu Glu Met Lys Arg Leu Leu Gly

485 490 495

Asn Gly Asn Arg Asn Asn Lys Asp Asp Ile Cys

500 505

Claims

1.一种绿豆VrMIB1基因，其特征在于，所述绿豆VrMIB1基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.一种绿豆VrMIB1蛋白，其特征在于，由权利要求1所述基因编码而成，所述蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。

4.权利要求1所述的基因在改变果荚长度和籽粒大小中的应用。

5.一种提高植物果荚长度和籽粒大小的方法，其特征在于，所述方法包括提高目的植物中权利要求2所述蛋白质的含量和/或活性，得到果荚长度和籽粒大小大于所述目的植物的植株。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述提高目的植物中权利要求2所述蛋白质的含量和/或活性通过提高目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量实现。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述提高目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量通过将权利要求2所述蛋白质的编码基因导入所述目的植物实现。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，含有权利要求1所述基因的重组质粒的同源重组引物序列为：

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，含有权利要求1所述基因的重组载体的阳性克隆鉴定引物序列为：

10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，VrMIB1基因表达量检测采用的引物序列为：