CN109439669B

CN109439669B - 一种烟草砷转运基因NtNIP7-1及其克隆方法与应用

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Publication number: CN109439669B
Application number: CN201811369666.9A
Authority: CN
Inventors: 白戈; 杨大海; 逄涛; 谢贺; 李勇; 姚恒; 李永平; 陈学军; 肖炳光; 方敦煌; 王亚辉; 杨春江; 张晨东; 吴兴富; 曾建敏
Original assignee: Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences
Current assignee: Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences
Priority date: 2018-11-17
Filing date: 2018-11-17
Publication date: 2022-03-29
Anticipated expiration: 2038-11-17
Also published as: CN109439669A; US20200140878A1; US11473098B2; BR102019023968A2

Abstract

本发明公开了一种烟草砷转运基因NtNIP7‑ 1及其克隆方法与应用，烟草砷转运基因NtNIP7‑ 1核苷酸序列如SEQ ID：No.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID：No.2所示。本发明还公开了烟草砷转运基因NtNIP7‑1的克隆方法，具体步骤包括：提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；以反转录得到的第一链cDNA作为模板，根据NtNIP7‑1基因序列设计合成特异性引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序。本发明中，在烟草植株内抑制烟草内源基因NtNIP7‑1的表达，会使烟草烟叶的砷含量明显降低，在植物低砷含量育种领域具有广阔的应用前景，其经济效益潜力巨大。

Description

一种烟草砷转运基因NtNIP7-1及其克隆方法与应用

技术领域

本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种烟草砷转运基因NtNIP7-1的克隆方法与应用。

背景技术

砷在自然界中广泛存在，是地壳中含量最丰富的元素之一，平均浓度接近3mg kg^-1(Cullen and Reimer, 1989)。通常情况下，砷通过自然反应和人为作用释放到环境中，例如火山排放、岩石风化、温泉释放、采矿、冶炼以及含砷的农药、除草剂，木材防腐剂和饲料添加剂的使用等(Zhao et al.，2010b)。目前，砷污染已然成为一个全球性的问题，主要涉及食物、空气、水体及土壤污染等方面。无机砷属于人类一级致癌物质，水体和食物为主要的砷污染来源（Smith et al.，2002;Tsuji et al.，2007)。砷的毒性强度与存在形式有关，无机砷的毒性高于有机砷，无机砷中亚砷酸盐的毒性高于砷酸盐，但是当有机砷中的五价单甲基砷酸盐(MMA)和二甲基砷酸盐(DMA)还原成三价时，毒性会显著提高(Styblo etal.，2000)。砷对动植物的危害是巨大的，浓度超过一定的范围甚至会使植物致死。例如长期暴露在砷环境下的植物会导致光合作用受阻，生长发育受到抑制，同时也会引起谷粒的减产(Jain and Gadre, 1997)。人体在砷中毒后可能导致皮肤、消化系统、神经系统、呼吸系统、心血管系统等疾病(Kala et al.，2000;Mao et al.， 2010)。烟草是重要的经济作物，在中国境内广泛的种植。如果烟草种植在砷含量比较高的土壤中能够对砷进行富集，而一旦烟草对砷元素富集后，再加工成卷烟制品，就可能危害到消费者的身体健康。因此在烟草种植过程中需解决砷含量过高的问题，而通过农艺方法很难降低烟草中的砷含量。因此采用基因工程的方法对烟草进行基因改良从而降低砷含量是一种更为有效的办法。NIP7-1基因在之前在其它物种中具有吸收砷的功能，但是在烟草中的功能尚未有人报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种烟草砷转运基因NtNIP7-1；第二目的在于提供所述的烟草砷转运基因NtNIP7-1的克隆方法；第三目的在于提供所述的烟草砷转运基因NtNIP7-1的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的烟草砷转运基因NtNIP7-1的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：

A、烟草叶片cDNA合成：提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；

B、NtNIP7-1基因的PCR扩增：以反转录得到的第一链cDNA作为模板，根据NtNIP7-1基因序列设计合成特异性引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序。

本发明的第三目的是这样实现的，所述的烟草砷转运基因NtNIP7-1在获得低砷转基因植株中的应用。

本发明的第四目的是这样实现的，所述的烟草砷转运基因NtNIP7-1应用所得到的烟草品种及其种子和无性繁殖体。

本发明的第五目的是这样实现的，所述的烟草砷转运基因NtNIP7-1的表达盒。

本发明的第六目的是这样实现的，所述的烟草砷转运基因NtNIP7-1的转基因细胞系。

本发明的第七目的是这样实现的，所述的烟草砷转运基因NtNIP7-1的重组菌。

NtNIP7-1基因在烟草中为一个基因家族，具有多个同源基因，同时烟草中的NtNIP7-1基因的同源性与其它作物相比较低，因此确定那个基因在烟草中具有吸收砷的功能是十分重要的。本发明在烟草中降低NtNIP7-1基因的表达量可以显著降低烟草中砷含量，因此该基因可以应用于低砷植物品种的育种，具有极大的应用前景与价值。

本发明所述的烟草砷转运蛋白基因NtNIP7-1编码一种转运砷离子的多肽，所述多肽包含的氨基酸序列如SEQ ID：No.2所示。所述多肽还可能为由SEQ ID No：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成，且具有吸收砷离子功能的衍生多肽。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

本发明所述烟草砷转运蛋白基因NtNIP7-1包含的核苷酸序列如SEQ ID：No.1所示。或者在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；或者与序列表中SEQ ID No：1限定的DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

本发明所述烟草砷转运蛋白基因NtNIP7-1的应用为在烟草植株体内抑制所述NtNIP7-1基因的表达，可降低烟草中砷的含量。可通过由RNA介导的多种方法抑制NtNIP7-1基因的表达，如：植物病毒载体介导基因沉默的方法、农杆菌介导转化RNAi干扰载体、优化修改基因编码匡、优化基因启动子等方法。本发明所述的抑制基因表达的方法并不限于上述几种方法，只要能抑制NtNIP7-1表达即可。

本发明的烟草砷转运蛋白基因NtNIP7-1及其编码基因为农作物尤其是烟草低砷含量育种提供基因与技术的支持。

本发明中，在烟草植株内抑制烟草内源基因NtNIP7-1的表达，会使烟草烟叶的砷含量明显降低，在植物低砷含量育种领域具有广阔的应用前景，其经济效益潜力巨大。

附图说明

图1为NtNIP7-1基因的PCR产物电泳图；

其中，M-分子量标记；1-PCR产物；

图2为中间载体Pdonr-zeo图；

图3为NtNIP7-1基因植物RNAi干扰载体pHellsgate12图；

图4为转NtNIP7-1基因RNAi干扰载体的烟草株系基因表达水平柱状图；

其中，云烟87-野生型对照；NtNIP7-1-1和NtNIP7-1-2为转基因烟株；

图5为NtNIP7-1基因RNAi干扰烟草植株的砷离子含量示意图；

其中，云烟87-野生型对照；NtNIP7-1-1和NtNIP7-1-2为转基因烟株。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的烟草砷转运基因NtNIP7-1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

所述的烟草砷转运基因NtNIP7-1编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明所述的烟草砷转运基因NtNIP7-1的克隆方法，包括以下步骤：

A、烟草叶片cDNA合成：提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；

C步骤中所述的特异性引物为：

正向引物：5’- ATGGCTAAAGATCAATTGCAAGTGC -3’；

反向引物：5’- TTAAACTGGAATTGTTTGTGCATTAT -3’；

所述的PCR扩增的反应体系和反应条件如下：

。

本发明所述的烟草砷转运基因NtNIP7-1的应用，其特征在于所述的烟草砷转运基因NtNIP7-1在获得低砷转基因植株中的应用。

所述的烟草砷转运基因NtNIP7-1应用所得到的烟草品种及其种子和无性繁殖体。

下面以具体实施案例对本发明进行进一步说明：

实施例中所有的植物组织材料取自烤烟（Nicotiania tabacum)品种‘云烟87’及RNAi干扰NtNIP7-1基因表达的云烟87转基因植株。烟草植株的生长和发育阶段都是在人工气候室中，并保持生长温度在22-25℃之间，以尽量减少外界环境因素对烟草对砷吸收过程中的影响。实验选取的烟草材料为6-7叶期，发育表型相近的非转基因烟株及转基因烟株。对栽培烟草的土壤浇砷溶液进而提高土壤中砷离子浓度，以便更加准确的确定该基因的功能。采取非转基因烟株及转基因烟株的相同叶位叶片进行采样，将这些烟草材料杀青以进行砷含量检验。

实施例1

克隆NtNIP7-1基因

以烟草叶片cDNA为模板，根据烟草基因组数据库信息设计引物，进行NtNIP7-1基因的PCR扩增，得到PCR扩增产物，设计引物如下所示：

正向引物：5’- ATGGCTAAAGATCAATTGCAAGTGC -3’；

反向引物：5’- TTAAACTGGAATTGTTTGTGCATTAT -3’；

PCR反应体系和扩增条件如下所示：

将扩增获得的PCR产物在0.8%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶电泳结果如图1所示，电泳结束后，采用Qiagen公司PCR产物纯化试剂盒，按照产品说明回收纯化所述的PCR产物，并送Invitrogen测序，验证序列结果。

实施例2

植物RNAi载体的构建

以实施例1中NtNIP7-1全长片段为模板，用含有gateway接头序列的引物进行PCR扩增，扩增产物经PCR产物纯化后，经过BP反应插入到invitrogen公司pdonr-zeo载体（见图2）中，将构件好的BP反应载体通过LR反应将NtNIP7-1片段置换到PHellsgate12 RNAi干扰载体（见图3）中。

（1）gateway反应引物序列如下：

NtNIP7-1_F

5’- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCtcacgaaaatgcaccaaaaccagg -3’；

NtNIP7-1_R

5’- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCgataaagggtaatcgccaccaatacc -3’

（2）PCR反应均采用Phusion高保真聚合酶进行PCR克隆。

PCR反应体系与条件与实施例1相同。

（3）BP反应：

（a）在200μL离心管中准备8 μL的反应体系，包括：1-7 μL的attB-PCR产物（约15 ~150 ng，质量浓度≥10 ng/μL）、1 μL 150 ng/μL的pdonr-zeo载体和适量的TE缓冲液（pH8.0），在室温下混匀；

（b）将BP Clonase™ II酶混合物在冰上静置2 min融化，轻轻震荡2次，混匀待用；

（c）向（1）准备的样品中加入2 μL的BP Clonase™ II酶混合物，轻轻地将体系混匀；

（d）将BP Clonase™ II酶混合物放回到-20°C或者-80°C保存；

（e）将反应体系放在25°C温浴1 h；

（f）向反应体系中加入1 μL的蛋白酶K溶液，轻轻震荡，然后将样品放在37°C温浴10 min，以便终止BP反应；

（g）将混合液转化大肠杆菌后，取转化菌液涂在含Zeacin抗性的LB平板上，挑取菌落至含相应抗生素培养基溶液中摇菌培养，提取阳性克隆的pDONR-Zeocin质粒（图2）备用。

（4）LR反应：

（a）在200 μL离心管中准备8 μL的反应物，包括：1-7 μL的获得的pDONR-Zeocin质粒（50-150 ng）、1 μL150 ng/μL的目的载体和适量的TE缓冲液（pH 8.0），在室温下混匀；

（b）将LR Clonase™ II酶混合物静置在冰上2 min融化，轻轻震荡2次以混匀；

（c）加入2 μL的LR Clonase™ II酶混合物，轻轻震荡将体系混匀；

（d）将LR Clonase™ II酶混合物放回到-20℃ 或者-80℃冰箱保存；

（e）将反应体系放在 25℃温浴反应1 h；

（f）向反应体系中加入1 μL的蛋白酶K溶液以终止LR反应，轻轻震荡后，将样品放在37℃ 静置10 min；经过摇菌扩繁后得到pHellsgate12 RNAi干扰载体。

实施例3

农杆菌介导的烟草转化及转基因植株的鉴定

（1）冻融法转化农杆菌

将1 μg（200 ng/μL）pHellsgate12重组载体加入到100 μL感受态农杆菌LBA4404中，混匀后在冰上静置5 min，放入液氮中冷冻5 min，然后从液氮中取出，放入37℃水浴锅中水浴5 min，再在冰上静置5 min后，加入500 μL LB溶液，在28℃、充分震荡条件下恢复培养4 h，最后将菌液均匀涂抹于选择性平板培养基上，28℃下培养48 h。

(2) 叶盘法转化烟草品种云烟87。

具体方法如下:

(a) 无菌条件下，将烟草云烟87种子放入EP管中用无菌水冲洗2-3次；

(b) 于75%的酒精中浸泡30-60 s；

(c) 再用0.1%的升汞处理5min，最后用无菌水冲洗5次；

(d) 播种于MS培养基上，培养在云南烟草农业科学研究院组织培养室中，暗培养4d, 25℃光照培养20-30 d。

(e ) 待烟草苗长至3-5cm时（20-30d），取顶芽放于MS+BA 0.2 mg/L（壮芽，使其快速成长）培养基上，继代培养。

(f) 继代培养14天后（有小叶片即可），取叶片，大小1cm×1cm，切去叶柄，叶片表面及叶边缘划伤，放入MS+ BA1.0mg/L pH 6.0-6.5的预培养培养基上，正面朝下紧贴培养基放置，于黑暗条件下预培养2-3 d。

(g) 然后取出预培养的叶片或茎段，放入农杆菌侵染液中进行侵染。侵染前一天晚上，摇菌农杆菌2瓶。将2 mL离心管装满菌液，4000 r/min离心5min，用悬菌液清洗两次。以1:10比例（10 mL悬菌液放1管1.5 mL菌体）放入悬菌液，加入As 25 mg/L（40 mL中加40 μL As）不断摇晃侵染液，使其与叶片及茎段切口处充分接触，10 min后，取出，放于灭过菌的干燥滤纸上吸干菌液。

其中，农杆菌侵染液的制备方法如下：

1) 取-80℃冰箱保存的已被转化的农杆菌，划平板培养，LB固体平板中加入50mg/L spec和50mg/L Rif；

2) 挑取单菌斑到含50mg/L spec和50mg/L Rif的5mL LB液体培养基中，放入摇床中28℃、200 r/min培养过夜（12-16h）；

3) 保存菌种，750 μL菌液加入灭过菌的甘油250 μL，-80℃冰箱保存备用。

4) 摇菌，LB液体培养基10 mL加spec（所需浓度50mg/L）10 μL、Rif（所需浓度50mg/L）10 μL及菌液10 μL，28℃、200r/min过夜培养（12-16h）。

5) 当菌液浓度达到OD₆₀₀=1.5左右时，取2mL菌液加入到离心管中，4000r/min离心5min；

6) 倒掉上清液，吸1mL新的MS液体培养基，重悬农杆菌，4000 r/min离心5min。

7) 重复步骤（6）1次；

8) 用1mL的MS液体培养基重悬菌后，再加入到40mL的MS的液体培养基中（含40ul25mg/L的As），即为侵染液。放置2h以上，再侵染。

200 mL悬菌液的配制如下：

20×大量元素 10 mL

200×有机元素 1ml

200×铁盐 1mL

200×微量元素 1mL

蔗糖5.6g

(h) 将叶片及茎段放回到预培养基上，28℃黑暗条件下共培养2-3天，至叶片切口周围有微菌斑形成；

(i) 洗菌，取出共培养的烟草叶片及茎段，用添加500 mg/L Cef的无菌水冲洗5次，第一次放置于摇床摇30 min，后面每次5 min，以洗去外植体表面的农杆菌；

(j) 取出后，用滤纸吸干，转移到烟草诱芽培养基上，诱芽培养基为MS+ BA1.0mg/L +Kan 25mg/L + Cef 500 mg/L pH 5.8；过2周观察，如果发现不长菌，则降低Cef浓度。如果长菌，则继续保持Cef浓度。

(k) 每2周更换1次培养基，直至长出不定芽（一般情况为2周）。切下再生的小苗（1cm 左右），转入继代培养基MS+ BA 0.2-0.1mg/L+ Kan 25mg/L + Cef 500mg/L pH 5.8；

(l) 至小苗长至2cm长时（有小芽即可），转接入生根培养基MS+ NAA 0.2-0.1mg/L上，24±1℃、12h 光照、1500 lx 培养3周左右, 长出粗壮根系。

(m) 待根生长至2-3cm。苗高7-10cm左右时，移出三角瓶洗去根部培养基，移栽于花盆中，温室培养。

（3）得到稳定的转基因株系

采用Qiagen公司DNA提取试剂盒，提取转基因烟草幼苗的基因组DNA，设计Kan抗性基因引物进行PCR扩增，筛选阳性植株,检测到25株阳性植株。

Kan抗性基因引物为

Kan F：5’-tctggacgaagagcatcagg-3’

Kan R：5’-atgaatccagaaaagcggcc-3’

按照实例2中所述方法提取野生型植株和25株转pHellsgate12的RNA

基因T0代植株的总RNA，进行Real time-PCR分析，内参基因为26s，分析不同株系的表达情况。选取表达量最低的2株植株（图4）。单株收取种子分别播种，用Kan抗生素筛选Tl代植株的分离情况，如此重复直至T3代获得遗传稳定的转基因株系。

NtNIP7-1 qRT-PCR引物

NtNIP7-1 _qRT_F：5’- AGGTCCAGTCTGTTGTGAGG-3’；

NtNIP7-1 _qRT_R：5’- TTTGCCTTAACCCGTTGAGC-3’。

26s内参基因引物

26s_F：5’-GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC-3’；

26s_R：5’-TCTCCCTTTAACACCAACGG-3’。

实施例4

测定烟叶中砷含量

烟草样品砷采用硝酸和高氯酸在电热板上消解，用原子荧光光度计测定。仪器

AFS-9800型双道原子荧光光度计、GGX-6原子吸收光谱仪、AA-800石墨炉原子吸收光谱仪，天平（感量0.1mg）；

仪器工作条件

原子荧光光度计的工作条件见表1。

表1 原子荧光光度计的工作条件

GGX-6原子吸收分光光谱仪测定镉的工作条件为波长228.8 nm，灯电流6 mA，狭缝0.2 nm，空气流量5 L/min，乙炔流量1.5 L/min，积分时间5 s，背景校正方式：塞曼效应。

用AA-800石墨炉原子吸收分光光谱仪测定镍，工作条件为波长283.3 nm，狭缝0.2nm，灯电流5 mA～7 mA，干燥温度120 ℃，20 s；灰化温度1100 ℃，持续20 s；原子化温度：2300 ℃，持续4 s；进样量20 µL，背景校正方式：塞曼效应。

玻璃器皿：250mL三角瓶、弯颈漏斗、50mL容量瓶、25mL容量瓶、（5mL、10mL）移液管、(1mL、2mL、5mL、10mL)刻度移液管。

试剂

硝酸、高氯酸、30％双氧水、硼氢化钾、铁氰化钾、草酸、硫脲、抗坏血酸、盐酸；

2%硼氢化钾或硼氢化钠和0.5%氢氧化钠溶液：20g硼氢化钾或硼氢化钠和5g氢氧化钠用水定容至1000mL；

二水合草酸溶液（10g/L）：称取1.0g二水合草酸溶于适量水中，用水定容至100mL，用时现配；

铁氰化钾溶液（100g/L）：称取10g铁氰化钾溶于适量水中，用水定容至100mL，现配现用；

实验用水均为去离子水。

分析步骤

烟样砷的前处理

称取40℃烘干并粉碎过40目筛的烟样1 g（准确到0.0001g）样品于150mL三角烧瓶中，加入10mL硝酸，2mL高氯酸，盖上弯颈小漏斗、浸泡8h或放置过夜，于电热板上加热消解至有白色物质出现，取下稍冷，用少许水冲洗瓶壁，加2.5mL盐酸加热至沸，取下冷却，转入25mL容量瓶中，用水定容至刻度摇匀，做备用液。取10mL备用液于10mL试管（试管干燥）中，加0.1g硫脲和0.1g抗坏血酸，摇匀，放置4 h，在24 h内测试，供原子荧光光度计测定砷，同时做试剂空白。取5mL备用液于50mL容量瓶中，加入10g/L的二水合草酸溶液1.0mL和100g/L的铁氰化钾溶液3.0mL，用1％的盐酸定容至刻度摇匀，供原子荧光光度计测定铅，同时做试剂空白。同时做试剂空白；

测定

根据样品含量配制成不同的浓度（酸性条件和其他试剂与样品是相同的条件），调好灯位置，在设定的仪器工作条件下，预热大约30分钟，点火后开始测量标准工作曲线。采用用原子荧光光度计测定。

结果计算

按照下面的公式计算砷的含量：

式中：

X---烟样中的砷 mg/kg；

V---样品消解液体积，mL；

A---样品稀释倍数；

C---样品液中的浓度，μg/L；

M---样品重量，g。

通过测定发现转基因植株的砷含量比非转基因材料相比降低约36%，说明NtNIP7- 1基因能够影响烟草中砷含量。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南省烟草农业科学研究院

<120> 一种烟草砷转运基因NtNIP7-1及其克隆方法与应用

<130> 2018

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1608

<212> DNA

<213> NtNIP7-1核苷酸序列

<400> 1

atggctaaag atcaattgca agtgctaaat gcactagatg tagcaaaaac acaattgtac 60

catttcactg caattgtaat tgctggaatg ggatttttta ctgatgccta tgaccttttt 120

tgcatttcac tagtcacaaa attacttggc cgaatttatt atcatcacga aaatgcacca 180

aaaccaggta ttctccctcc tcctatcgca gctgctgtta atggcgtcgc gtttgttggt 240

actctttcgg ggcaactgtt tttcgggtgg ctaggagata aattagggag gaaaaaagtt 300

tatggaatga cacttatgct tatggttatt tgttcaatag cttctggact ttcttttggt 360

aaaacaccta atggtgttat agccacttta tgtttttttc gattttggct tggttttggt 420

attggtggcg attacccttt atccgcgaca attatgtctg aatatgcaaa taaaaaaact 480

cgtggggctt ttattgctgc tgtttttgca atgcaaggtt ttggtatttt agcaggcgga 540

atagttgcac ttattgttgc tggtgcattt aaaaatgctt acccttcacc aatttattca 600

gtaaatccta aagattcaac accacctgaa gctgattatg tttggagaat tattgtaatg 660

tttggtgcaa ttccagcttt acttacttat tactggcgaa tgaagatgcc cgaaacagca 720

cgttacacgg ccttagttgc gaaaaatgct gaaaaagctg ctgctgatat gtccaaagta 780

ttgaacgttg aaattgaagt agagaaagat aaagttgaag aaaaccgaca tagttttggt 840

ttgtttacta aggaatttct tcgtcgccat ggacttcact tgctaggaac aactagtaca 900

tggtttttat tagatattgc tttttacagt caaaatcttt ttcagaagga tatatttagt 960

aaaattggat ggattcctca tccagaaacg atgaatgcat tagatgaagt tttcaagatt 1020

gcaagggcac agactcttat tgcactttgc agtactgttc caggttactg gtttactgta 1080

gcatttatcg ataaaatggg tcgatttgct attcaattaa tgggattctt tttcatgaca 1140

gttttcatgt ttgctttagc cattccatat aatcactgga cacaaaagga aaacagaata 1200

gggtttgtta tcatgtattc acttacgttt ttcttcgcga attttggtcc aaatgcaaca 1260

acatttgttg tacccgcgga gatttttcca gctaggttaa gatcaacgtg ccacggaata 1320

tcagcagcag ctggaaaagc tggagcaatt gttggggcat ttggattttt gtatgcagct 1380

caatccactg atccattaaa ggttgatgct ggttatccaa ctggtatagg tgtgaaaaat 1440

gcacttattg ttcttggttg tgttaattta cttggaatgt tgtttacatt cttggtgcca 1500

gaatccaaag gaaaatcatt ggaggaaatg tctaaggaaa atgaaagaga agaagaaaat 1560

tatgaaacag aatctaaggc agataatgca caaacaattc cagtttaa 1608

<210> 2

<211> 535

<212> PRT

<213> NtNIP7-1氨基酸序列

<400> 2

Met Ala Lys Asp Gln Leu Gln Val Leu Asn Ala Leu Asp Val Ala Lys

1 5 10 15

Thr Gln Leu Tyr His Phe Thr Ala Ile Val Ile Ala Gly Met Gly Phe

20 25 30

Phe Thr Asp Ala Tyr Asp Leu Phe Cys Ile Ser Leu Val Thr Lys Leu

35 40 45

Leu Gly Arg Ile Tyr Tyr His His Glu Asn Ala Pro Lys Pro Gly Ile

50 55 60

Leu Pro Pro Pro Ile Ala Ala Ala Val Asn Gly Val Ala Phe Val Gly

65 70 75 80

Thr Leu Ser Gly Gln Leu Phe Phe Gly Trp Leu Gly Asp Lys Leu Gly

85 90 95

Arg Lys Lys Val Tyr Gly Met Thr Leu Met Leu Met Val Ile Cys Ser

100 105 110

Ile Ala Ser Gly Leu Ser Phe Gly Lys Thr Pro Asn Gly Val Ile Ala

115 120 125

Thr Leu Cys Phe Phe Arg Phe Trp Leu Gly Phe Gly Ile Gly Gly Asp

130 135 140

Tyr Pro Leu Ser Ala Thr Ile Met Ser Glu Tyr Ala Asn Lys Lys Thr

145 150 155 160

Arg Gly Ala Phe Ile Ala Ala Val Phe Ala Met Gln Gly Phe Gly Ile

165 170 175

Leu Ala Gly Gly Ile Val Ala Leu Ile Val Ala Gly Ala Phe Lys Asn

180 185 190

Ala Tyr Pro Ser Pro Ile Tyr Ser Val Asn Pro Lys Asp Ser Thr Pro

195 200 205

Pro Glu Ala Asp Tyr Val Trp Arg Ile Ile Val Met Phe Gly Ala Ile

210 215 220

Pro Ala Leu Leu Thr Tyr Tyr Trp Arg Met Lys Met Pro Glu Thr Ala

225 230 235 240

Arg Tyr Thr Ala Leu Val Ala Lys Asn Ala Glu Lys Ala Ala Ala Asp

245 250 255

Met Ser Lys Val Leu Asn Val Glu Ile Glu Val Glu Lys Asp Lys Val

260 265 270

Glu Glu Asn Arg His Ser Phe Gly Leu Phe Thr Lys Glu Phe Leu Arg

275 280 285

Arg His Gly Leu His Leu Leu Gly Thr Thr Ser Thr Trp Phe Leu Leu

290 295 300

Asp Ile Ala Phe Tyr Ser Gln Asn Leu Phe Gln Lys Asp Ile Phe Ser

305 310 315 320

Lys Ile Gly Trp Ile Pro His Pro Glu Thr Met Asn Ala Leu Asp Glu

325 330 335

Val Phe Lys Ile Ala Arg Ala Gln Thr Leu Ile Ala Leu Cys Ser Thr

340 345 350

Val Pro Gly Tyr Trp Phe Thr Val Ala Phe Ile Asp Lys Met Gly Arg

355 360 365

Phe Ala Ile Gln Leu Met Gly Phe Phe Phe Met Thr Val Phe Met Phe

370 375 380

Ala Leu Ala Ile Pro Tyr Asn His Trp Thr Gln Lys Glu Asn Arg Ile

385 390 395 400

Gly Phe Val Ile Met Tyr Ser Leu Thr Phe Phe Phe Ala Asn Phe Gly

405 410 415

Pro Asn Ala Thr Thr Phe Val Val Pro Ala Glu Ile Phe Pro Ala Arg

420 425 430

Leu Arg Ser Thr Cys His Gly Ile Ser Ala Ala Ala Gly Lys Ala Gly

435 440 445

Ala Ile Val Gly Ala Phe Gly Phe Leu Tyr Ala Ala Gln Ser Thr Asp

450 455 460

Pro Leu Lys Val Asp Ala Gly Tyr Pro Thr Gly Ile Gly Val Lys Asn

465 470 475 480

Ala Leu Ile Val Leu Gly Cys Val Asn Leu Leu Gly Met Leu Phe Thr

485 490 495

Phe Leu Val Pro Glu Ser Lys Gly Lys Ser Leu Glu Glu Met Ser Lys

500 505 510

Glu Asn Glu Arg Glu Glu Glu Asn Tyr Glu Thr Glu Ser Lys Ala Asp

515 520 525

Asn Ala Gln Thr Ile Pro Val

530 535

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 正向引物

<400> 3

atggctaaag atcaattgca agtgc 25

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 反向引物

<400> 4

ttaaactgga attgtttgtg cattat 26

<210> 5

<211> 55

<212> DNA

<213> NtNIP7-1_F

<400> 5

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctg ctcacgaaaa tgcaccaaaa ccagg 55

<210> 6

<211> 56

<212> DNA

<213> NtNIP7-1_R

<400> 6

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc gataaagggt aatcgccacc aatacc 56

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Kan F

<400> 7

tctggacgaa gagcatcagg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Kan R

<400> 8

atgaatccag aaaagcggcc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> NtNIP7-1 _qRT_F

<400> 9

aggtccagtc tgttgtgagg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> NtNIP7-1 _qRT_R

<400> 10

tttgccttaa cccgttgagc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 26s_F

<400> 11

gaagaaggtc ccaagggttc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 26s_R

<400> 12

tctcccttta acaccaacgg 20

Claims

1.抑制烟草砷转运基因NtNIP7-1在获得低砷转基因植株中的应用，其特征在于，所述的烟草砷转运基因NtNIP7-1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的抑制烟草砷转运基因NtNIP7-1在获得低砷转基因植株中的应用，其特征在于，所述的烟草砷转运基因NtNIP7-1的克隆方法包括以下步骤：

A、烟草叶片cDNA合成：提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；

3.如权利要求2所述的抑制烟草砷转运基因NtNIP7-1在获得低砷转基因植株中的应用，其特征在于，B步骤中所述的特异性引物为：

正向引物：5’- ATGGCTAAAGATCAATTGCAAGTGC -3’；

反向引物：5’- TTAAACTGGAATTGTTTGTGCATTAT -3’。

4.如权利要求2所述的抑制烟草砷转运基因NtNIP7-1在获得低砷转基因植株中的应用，其特征在于，所述的PCR扩增的反应体系和反应条件如下：

。