CN114540373B - 一种降低水稻籽粒中镉含量的基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种降低水稻籽粒中镉含量的基因及其应用。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明所得到的基因能够调控水稻茎秆中节点I、节间Cd向籽粒的转移，并降低水稻糙米中的Cd含量。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种降低水稻籽粒中镉含量的基因及其应用。
背景技术
镉(Cd)是一种人类和植物的非必需元素，能对人类和植物的生长发育造成严重影响。水稻是我国的主要粮食作物之一，对Cd具有较强的富集能力。土壤中的Cd可以在水稻籽粒中积累并随食物链进入人体，进而危害人类健康。我国稻田Cd污染导致的稻米Cd安全问题备受关注。因此，降低稻米中的Cd含量成为保障粮食安全问题的重要前提。挖掘控制水稻籽粒Cd积累的关键基因是筛选和培育籽粒Cd低积累水稻的重要前提，也是保障Cd污染农田安全生产的可靠手段。
土壤中的Cd进入到水稻籽粒主要包括以下几个步骤：根系对Cd的吸收、Cd通过木质部转运至地上部、节点对Cd的滞留和再分配、Cd经叶片等器官活化后运输到籽粒中。研究发现，OsNramp5和OsNramp1参与水稻根系细胞对Cd的吸收和转运，能够影响水稻对Cd的吸收进而调控籽粒Cd含量。OsHMA3能选择性地将Cd隔离到根液泡中，减少调控Cd从根向地上部和籽粒的转运。OsHMA2影响Cd向地上部的转运，通过调控Cd重新装载到分散维管束韧皮部的过程，影响籽粒Cd的浓度。OsHMA2、OsZIP7、OsLCT1、OsCCX2、CAL1通过调控Cd在节点的分配进而影响水稻籽粒对Cd的积累。然而水稻对Cd的吸收、转运和积累涉及到多个装载和卸载过程，有限的基因不能完全阐明Cd在水稻中的运输过程。因此，探索更多调控水稻糙米Cd含量的关键基因基因是十分必要的。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种降低水稻籽粒中镉含量的基因及其应用，该基因能够调控水稻节间和最上部节点I中Cd向籽粒的转移，显著降低水稻籽粒Cd含量。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种降低水稻籽粒镉含量的基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，该基因还可以是与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有80％以上同源性，且能表达相同功能蛋白的核苷酸序列。
上述基因编码的蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
一种降低水稻籽粒中镉含量的制剂，制剂包括促进基因表达的活性成分。
一种降低水稻籽粒中镉含量的药物，药物包括上述蛋白。
上述基因在水稻种质资源改良或低镉品种培育中的应用。
本发明的有益效果：
本发明所得到的基因能够调控水稻茎秆中节点I、节间Cd向籽粒的转移，并降低水稻糙米中的Cd含量。
附图说明
图1为克隆菌落PCR检测结果；
图2为基因克隆侧序结果；
图3为基因在水稻中不同时期各器官的表达量；
图4为亚细胞定位检测结果；
图5为基因对镉转运活性的影响；
图6为敲除水稻中基因后的PCR测序解码图；
图7为敲除水稻中基因后的PCR测序解码图；
图8为野生型与突变体水稻成熟期各器官中镉含量。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
实施例1基因的克隆
对水稻籽粒Cd低积累材料雅恢2816进行50μM Cd处理，于处理后7天采取新鲜叶片放入液氮中速冻，用于提取水稻植株总RNA，使用引物(F：ACACTCATCGTTGTCCATCTG,R：CAAAATTAGCCCAAACCCTC)进行基因克隆。
然后采用pEASY-Blunt Cloning Kit试剂盒(TransGen Biotech,北京全式金生物技术有限公司)进行目的片段克隆，TA克隆产物转化大肠杆菌，涂抗性平皿过夜培养。挑选克隆子摇菌，使用引物(F：ACACTCATCGTTGTCCATCTG，R：CAAAATTAGCCCAAACCCTC)进行菌落PCR阳性克隆鉴定(见图1)，并进行测序(图2)。最终得到了如下所示的基因序列：
5’-ATGTACTTAATTAATTATTTGAGTGCTGTAAATCTGCAATGCGTTGTGTTGATGTGTTTAATTACCTTTTCTTTTCTCTGCAATGGATGGAAACCTGGTGTATTTGTATGTTCATCAAATAAGTACTCTATGCAGTGTTTTGGCTTGAACAAAATGTTTGTCGAGGGTTTGGGCTAA-3’(SEQ ID NO.1)，其编码58个氨基酸残基，与参考基因组进行对比，未发生碱基突变，其氨基酸序列为5’-MYLINYLSAVNLQCVVLMCLITFSFLCNGWKPGVFVCSSNKYSMQCFGLNKMFVEGLG-3’(SEQ ID NO.2)。
实施例2基因在水稻中的表达特性
在大田Cd污染条件下，采取雅恢2816抽穗期、拔节期、灌浆期的穗、叶片、叶鞘、节间和不同部位节点放入液氮速冻，用于提取水稻植株总RNA，使用引物(F：ACAGCACACAACCAACAGCC,R：TGTGCCAGTTCCAAGCACAC)和内参基因UBQ5引物(F：AACCAGCTGAGGCCCAAGA,R：ACGATTGATTTAACCAGTCCATGA)进行q-PCR分析，每组实验5个重复，其结果见图3。
如图3所示，基因在籽粒Cd低积累水稻雅恢2816拔节期、抽穗期和灌浆期的节点、叶片、叶鞘、节间和穗部均有表达，在抽穗期，该基因在节点、叶片的表达高于其他器官，穗部中的表达水平最低；在灌浆期，该基因在节点、叶片和穗部中的表达量高于其他器官。
实施例3亚细胞定位
为对基因进行亚细胞定位，根据其基因序列设计引物(F：GTCTTAAGTCCGGAGCTAGCTCTAGAATGTACTTAATTAATTATTTGAGTGCTG，R：CTCGCCCTTGCTCACCATGGATCCGCCCAAACCCTCGACAA)，以雅恢2816的cDNA为模板进行PCR扩增，获得目的片段。PAN580载体用XbaI与BamHI酶切处理并回收，与得到的PCR扩增产物进行重组，重组产物转化大肠杆菌，涂抗性平板。挑选克隆子摇菌，利用引物(A580-seqR：AGAAGATGGTGCGCTCCTG)与菌落PCR验证阳性克隆，然后进行测序验证后，将重组载体(绿色)以及空载体PAN580进行菌液扩繁并提取质粒，与细胞膜染料FM4-64弱光下共转化培养8-10h，在激光共聚焦显微镜下观察基因的亚细胞定位(见图4)。
如图4所示，绿色荧光和红色荧光可以融合，说明基因定位于细胞膜上。
实施例4基因对镉的转运活性影响
使用PrimeSTAR Max DNA Polymerase试剂盒(Takara,Japan)进行PCR扩增，以雅恢2816的cDNA为模板，使用扩增引物(F：CGGGATCCCGACACTCATCGTTGTCCATCTG，R：CGGAATTCCGCAAAATTAGCCCAAACCCTC)进行扩增。将基因与载体pFL61分别进行NotI单酶切，回收产物经T4连接酶4℃连接过夜后转化感受态大肠杆菌DH5α，涂板于加入氨苄的LB固体培养基，37℃倒置培养24后经菌液PCR验证阳性克隆后摇菌进行质粒提取进行测序验证。以空载体pFL61为阴性对照，将测序验证后的各基因表达载体质粒经醋酸锂转化法分别转入Cd突变型酵母△ycf1和野生型酵母BY4741，涂板于SD-URA选择性固体培养基，于30℃倒置培养2～3天，挑单克隆于SD-URA液体培养基中摇菌2天。
利用细胞计数板于光学显微镜进行酵母数量测定，并分别稀释至107/mL、106/mL、105/mL和104/mL。将10μL菌液分别滴于含有0、15和30μM CdSO4的固体SD-URA培养基上，充分吸收后于30℃倒置培养3天后拍照。将各菌液分别稀释至OD600＝0.025，并加入对30μMCdSO4，于200rpm、30℃振荡，分别于0、6、12、18、24、30、36h进行OD600值测定(图5)。
图5中A为Cd处理下不同酵母的生长情况，B为Cd处理不同时间后Cd敏感型酵母△ycf1生长OD600值。
在无Cd处理条件下，转入空载体的野生型酵母BY4741、转入空载体和转入基因的Cd敏感型酵母△ycf1生长无明显差异。15μM Cd处理条件下，不同酵母的生长情况与对照条件下相似。30μM Cd处理条件下，与转入空载体的野生型酵母BY4741(对照)相比，转入空载体和转入基因的Cd敏感型酵母△ycf1生长均受到显著抑制，且Cd对转入本基因的Cd敏感型酵母△ycf1生长抑制作用更大。在30μM Cd处理下，转入空载体和转入基因的Cd敏感型酵母△ycf1OD600值均随时间呈先显著增加后显著降低的趋势，在Cd处理后的36h时显著降低，为转入空载体的Cd敏感型酵母△ycf1的79.91％。表明本基因在酵母中具有Cd转运活性。(图5)
实施例5构建基因突变体水稻植株
使用CRISPR-Cas9基因组编辑系统，选择基因的两个目标靶点，分别为(T1：GATGAACATACAAATACACC，T2：GTATAACCCTCCAAGTGCCC)，利用农杆菌介导的遗传转化方法，浸染野生型中花11水稻构建突变体植株。最后，对构建完成的CRISPR载体用测序引物(SP-F：GCGCGGTGTCATCTATGTTACTA，SP-R：CCCGACATAGATGCAATAACTT)进行测序。植株的PCR产物测序结果进一步在网站http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/上进行解码。最后选择了两个独立的突变体植株(基因-1和基因-2)进行以下实验。
基因-1靶位点T2发生了编辑，出现单碱基G的缺失和复杂变异(由CCCAGGAGATGACA突变为ACTGGTTAACACGC)，属于双等位基因突变(图6)。基因-2靶位点T1发生了编辑，出现了大片段碱基缺失，属于阳性纯合突变。
(图7)
实施例6植株成熟期各器官Cd含量
将Cd污染试验田块划分为3个2m×0.5m纵向排列的试验小区，每个小区之间设0.3m的缓冲带。每个小区种植水稻7穴，每穴1株。采用旱地育秧，移栽时选取长势一致的秧苗按设计栽插。于成熟期采样，选取长势一致水稻，每个材料重复5次。将植株分为穗部、节间、不同部位叶片(叶片I、叶片II、叶片III)、不同部位的节点(节点I、节点II、节点III)，采用HNO3微波消解-电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定Cd含量，测定过程中以国家标准物质GBW(E)100495控制分析质量(GB 5009.268-2016)，结果见图8和表1。
图8中放大图为糙米Cd含量，*表示与野生型(WT)相比突变体水稻(本基因-1、本基因-2)各器官Cd含量差异显著(p＜0.05)，**表示与野生型相比突变体水稻各器官Cd含量差异极显著(p＜0.01)。
根据图8和表1的检测结果可以发现，敲除基因后显著增加了糙米Cd含量，为野生型的1.28～1.35倍。
通过表1分析成熟期不同器官间的Cd转移系数，可以发现敲除基因后显著增加了基因突变体水稻节点I-糙米Cd转移系数和节间-糙米的Cd转移系数，约为野生型的1.5～1.6倍。
综上，本基因定位于细胞膜，在抽穗期节点、叶和灌浆期节点、叶、穗高度表达，在酵母中具有Cd转运活性，能够积极响应Cd胁迫，敲除本基因显著增加节点I-糙米和节间-糙米的Cd转移系数并导致糙米中的Cd含量显著增加。可见，本基因可以调控水稻茎秆中节点I、节间Cd向籽粒的转移，并降低水稻糙米中的Cd含量。
表1成熟期不同器官间Cd转移系数
序列表
<120> 一种降低水稻籽粒中镉含量的基因及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 177
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtacttaa ttaattattt gagtgctgta aatctgcaat gcgttgtgtt gatgtgttta 60
attacctttt cttttctctg caatggatgg aaacctggtg tatttgtatg ttcatcaaat 120
aagtactcta tgcagtgttt tggcttgaac aaaatgtttg tcgagggttt gggctaa 177
<210> 2
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Tyr Leu Ile Asn Tyr Leu Ser Ala Val Asn Leu Gln Cys Val Val
1 5 10 15
Leu Met Cys Leu Ile Thr Phe Ser Phe Leu Cys Asn Gly Trp Lys Pro
20 25 30
Gly Val Phe Val Cys Ser Ser Asn Lys Tyr Ser Met Gln Cys Phe Gly
35 40 45
Leu Asn Lys Met Phe Val Glu Gly Leu Gly
50 55
Claims (2)
1.一种基因在降低水稻籽粒中镉含量的用途，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种降低水稻籽粒中镉含量的基因在水稻低镉品种培育中的应用，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
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