CN112301036B

CN112301036B - 一种调控稻米镉积累的基因OsABCG38及其编码蛋白和应用

Info

Publication number: CN112301036B
Application number: CN202011112728.5A
Authority: CN
Inventors: 唐丽; 赵炳然; 孙远涛; 董家瑜; 李曜魁; 吕启明
Original assignee: Hunan Hybrid Rice Research Center
Current assignee: Hunan Hybrid Rice Research Center
Priority date: 2020-10-16
Filing date: 2020-10-16
Publication date: 2022-09-27
Anticipated expiration: 2040-10-16
Also published as: CN112301036A

Abstract

本发明公开了一种调控稻米镉积累的基因OsABCG38，其编码区核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；以及该基因OsABCG38的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。该基因OsABCG38主要在水稻的根系表达，敲除OsABCG38基因使水稻植株根系、秸秆和糙米的镉含量均显著下降，且对主要农艺性状无显著影响，表明OsABCG38基因正调控水稻镉积累。与转空载体的酵母对照相比，表达OsABCG38基因的酵母对Cd胁迫更敏感且镉含量更高。本发明还公开了该基因OsABCG38或其编码蛋白在改良水稻镉积累特性或培育镉低积累水稻品种中的应用，操作简单，改良和培育新品种的周期短，且不影响主要农艺性状。

Description

一种调控稻米镉积累的基因OsABCG38及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明属于生物技术及遗传育种领域，具体涉及调控稻米镉积累的基因OsABCG38及其编码蛋白在降低稻米镉含量、培育镉低积累水稻品种中的应用。

背景技术

镉是一种生物毒性很强的重金属，而水稻是一种高富集镉的作物，稻田镉污染不仅会影响水稻的正常生长发育，也会造成稻米镉超标，严重威胁着以水稻为主食的人群的健康。据报道，我国约有2千万公顷的耕地受到镉、铅、砷等重金属污染，其中仅镉污染的耕地就超过1300万公顷，每年有大约1200万顿的粮食受到镉等重金属污染，合计农业损失至少在两百亿以上。稻米镉超标已成为影响稻米品质和粮食安全亟待解决的问题，阻控稻米镉污染已经成为关系民生的大事，引起了政治界和学术界的广泛关注。

ABC转运蛋白(ATP-binding cassette transporters)家族是现阶段已知最大、最古老的蛋白质家族之一，包括ABCA、ABCB和ABCC等8个亚家族，能转运金属、糖类、核苷酸、蛋白质、激素等多种底物。

稻米镉积累涉及镉吸收、转运、分配等多个生理过程和诸多转运蛋白。已鉴定的多数镉转运蛋白由于也是锰、锌、铁、钙等其他金属的主效转运蛋白，因此其基因突变虽然降低了镉含量，但往往因为突变体内的矿质元素稳态受到破坏而生长发育受阻，因此改良水稻镉高积累特性、培育镉低积累水稻品种需要更多的基因资源和育种途径。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种调控稻米镉积累的基因OsABCG38及其编码蛋白和应用。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

本发明的第一个方面，提供了一种调控稻米镉积累的基因OsABCG38，其编码区核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，或其编码区核苷酸序列与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有80％以上同源性且其所编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明的第二个方面，提供上述基因OsABCG38的编码蛋白，即水稻转运蛋白OsABCG38，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明的第三个方面，还提供了上述基因OsABCG38或其编码蛋白(水稻转运蛋白OsABCG38)在改良水稻镉积累特性或培育镉低积累水稻品种中的应用。

上述的应用，优选的，其应用方法包括如下步骤：通过突变所述基因OsABCG38使其编码蛋白的活性下调或失活(基因OsABCG38的突变使编码蛋白的氨基酸翻译提前终止或进行氨基酸的替换、删除或插入)，或抑制所述基因OsABCG38表达(例如使基因OsABCG38的编码区启动子序列发生突变)使其编码蛋白的丰度下调，进而改良水稻的镉积累特性或培育出稻米镉含量下降的镉低积累水稻品种。

更优选的，突变所述基因OsABCG38或抑制所述基因OsABCG38表达所采用的方式包括基因编辑、EMS诱变、辐射诱变或航天搭载；所述基因编辑更优选为CRISPR/Cas9、TALEN技术。

更优选的，利用CRISPR/Cas9法进行基因编辑，进而改良水稻的镉积累特性或培育出稻米镉含量下降的镉低积累水稻品种，其应用方法具体包括以下步骤：

(1)在所述基因OsABCG38的第二外显子选取两段核苷酸序列作为靶序列，通过CRISPR/Cas9法构建所述基因OsABCG38的CRISPR/Cas9重组载体；

(2)将所述步骤(1)构建好的CRISPR/Cas9重组载体导入农杆菌EHA105中；

(3)将成熟饱满的水稻种子脱壳后用次氯酸钠消毒滤干，接种到诱导培养基上诱导愈伤组织；

(4)将所述步骤(2)后得到的农杆菌EHA105的菌液浸染所述步骤(3)后得到的愈伤组织，再经过共培养、筛选培养、分化培养、生根培养后，得到的T₀代小苗移栽至土中，收到种子再种植繁殖一代获得T₁代植株，进行靶位点基因型检测，筛选靶位点发生突变的单株，即完成水稻镉积累特性的改良或镉低积累水稻品种的培育。

更优选的，所述步骤(1)中，两段靶序列的长度为20bp，第一条靶序列为位于所述基因OsABCG38编码区起始密码子ATG下游254-273bp的正义链，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，第二条靶序列为位于所述基因OsABCG38编码区起始密码子ATG下游297-316bp的反义链，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。

更优选的，所述步骤(4)中，所述共培养、筛选培养、分化培养、生根培养的具体操作包括：将所述步骤(2)后得到的农杆菌EHA105的菌液浸染所述步骤(3)后得到的愈伤组织，再转到共培养基上24℃暗培养3天，清洗愈伤组织，转到含潮霉素的选择培养基上进行筛选培养30天；经选择后的抗性愈伤组织转到预分化培养基7-10天，再转到分化培养基光照培养，待小苗长至2-4cm时转至生根培养基生长3周，得到T₀代小苗。

所述步骤(4)中，进行靶位点基因型检测所采用的扩增引物包括正向引物ABCG38-CAS9-F和反向引物ABCG38-CAS9-R，所述正向引物ABCG38-CAS9-F的核苷酸序列如SEQ IDNO：9所示，所述反向引物ABCG38-CAS9-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、基于本发明提供的基因OsABCG38，通过基因编辑、EMS诱变、辐射诱变、航天搭载、分子标记辅助育种等技术，可实现基因OsABCG38的突变，用于改良现有水稻的镉积累特性，培育和创制稻米镉含量低的中间材料和水稻品种，操作简单，改良和培育新品种的周期短，且不影响主要农艺性状。

2、本发明提供的调控稻米镉积累的基因OsABCG38主要在水稻的根系表达，利用基因编辑获得水稻OsABCG38敲除株系，通过苗期水培实验、镉污染大田实验发现，敲除基因OsABCG38使水稻植株根系、秸秆和糙米的镉含量均显著下降，且对主要农艺性状无显著影响，表明基因OsABCG38正调控水稻镉积累；酵母异源表达鉴定发现，与转空载体的酵母对照相比，表达基因OsABCG38的酵母对Cd胁迫更敏感且镉含量更高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为基因OsABCG38在不同的水稻生长发育时期和不同的部位的相对表达水平；

图2为基因OsABCG38的结构和敲除株系osabcg38-1、osabcg38-2的突变位点；

图3为苗期水培条件下，敲除株系osabcg38-1、osabcg38-2和野生型华占地上部分(a)和根系(b)的镉含量(其中**表示与野生型相比，0.01水平上差异显著)；

图4为敲除株系osabcg38-1和野生型华占的糙米镉含量(其中**表示与野生型相比，0.01水平上差异显著；*表示与野生型相比，0.05水平上差异显著)；

图5为OsABCG38酵母转化子的镉胁迫敏感性鉴定；

图6为OsABCG38酵母转化子的镉含量测定(其中**表示与野生型相比，0.01水平上差异显著)。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例：

一种本发明的调控稻米镉积累的基因OsABCG38，其编码区核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，或其编码区核苷酸序列与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有80％以上同源性且其所编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

该基因OsABCG38的编码蛋白，以下称“水稻转运蛋白OsABCG38”，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

该基因OsABCG38或水稻转运蛋白OsABCG38在改良水稻镉积累特性或培育镉低积累水稻品种中的应用，其应用方法包括如下步骤：通过突变OsABCG38基因，使编码蛋白的氨基酸翻译提前终止或进行氨基酸的替换、删除或插入，进而使水稻转运蛋白OsABCG38的活性下调或失活；或抑制OsABCG38基因表达，例如使OsABCG38基因的编码区启动子序列发生突变，进而使水稻转运蛋白OsABCG38的丰度下调，最终实现改良水稻的镉积累特性或培育出稻米镉含量下降的镉低积累水稻品种。

为了进一步体现该调控稻米镉积累的基因OsABCG38或水稻转运蛋白OsABCG38在改良水稻镉积累特性或培育镉低积累水稻品种中的应用过程和效果，提供以下试验：

(1)OsABCG38基因在水稻的时空表达特征分析

提取籼稻华占分蘖期、孕穗期和扬花期的根、茎基部、叶片、叶鞘、穗等部位的RNA，反转录成cDNA(TaKaRa公司反转录试剂盒，产品目录号RR047A)，取适量cDNA作为模板，以水稻Ubiquitin作为内参基因，通过qRT-PCR(TaKaRa公司荧光定量PCR试剂盒，产品目录号RR820A)检测OsABCG38的表达。采用

法进行定量计算，分析各个时期和各个部位的OsABCG38基因相对于内参基因Ubiquitin的表达量。

所用Ubiquitin定量检测的正向引物为qRT-UBQ-F，反向引物为qRT-UBQ-R；

qRT-UBQ-F：AGAAGGAGTCCACCCTCCACC(如SEQ ID NO：3所示)，

qRT-UBQ-R：GCATCCAGCACAGTAAAACACG(如SEQ ID NO：4所示)。

所用OsABCG38定量检测的正向引物为qRT-ABCG38-F，反向引物为qRT-ABCG38-R；

qRT-ABCG38-F：TCAGGTTGTTGTGGAGATAC(如SEQ ID NO：5所示)，

qRT-ABCG38-R：CATTGGAACGACATCATTGG(如SEQ ID NO：6所示)。

所得结果如图1所示，结果显示OsABCG38基因在各个时期的根部高量表达，其他部位也有少量表达。

(2)OsABCG38基因敲除株系的获得和分子鉴定

根据CRISPR/Cas9载体系统靶位点的选择原则，在OsABCG38基因第二外显子选取两段20bp的核苷酸序列作为靶序列，用于产生sgRNA。第一条靶序列位于OsABCG38基因编码区起始密码子ATG下游254-273bp的正义链，序列为ACGTCATGCTACTCTCCGAG(如SEQ ID NO：7所示)，第二条靶序列位于OsABCG38基因编码区起始密码子ATG下游297-316bp的反义链，序列为ACTCAAGCACATGCTCCCGG(如SEQ ID NO：8所示)。参考文献Ma XL,Zhang QY,Zhu QL,LiuW,Chen Y,Qiu R,Wang B,Yang ZF,Li HY,Lin YR,Xie YY,Shen RX,Chen SF,Wang Z,ChenYL,Guo JX,Chen LT,Zhao XC,Dong ZC,Liu YG.A robust CRISPR/Cas9 system forconvenient,high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicotplants.Mol Plant,2015,8(8):1274–1284.构建OsABCG38基因的CRISPR/Cas9重组载体pCRISPR/Cas9-OsABCG38。

将以上构建好的pCRISPR/Cas9-OsABCG38重组载体导入感受态农杆菌种EHA105，委托湖北武汉伯远生物科技有限公司完成水稻遗传转化工作。简述如下：选取成熟饱满的籼稻品种华占种子，脱壳后，次氯酸钠消毒滤干，接种到诱导培养基上诱导愈伤组织；将含有pCRISPR/Cas9-OsABCG38重组载体的农杆菌EHA105菌液浸染华占愈伤组织，再转到共培养基上24℃暗培养3天，清洗愈伤组织，转到含潮霉素的选择培养基上进行筛选培养30天；经选择后的抗性愈伤组织转到预分化培养基7-10天，再转到分化培养基光照培养，待小苗长至2-4cm时转至生根培养基生长3周左右；得到的T₀代小苗炼苗3天后移栽至土中，收到种子再种植繁殖一代，获得T₁代植株。

对T₁代植株进行靶位点基因型检测，以鉴定突变植株。简述如下：CTAB法提取T₁代植株的DNA。针对OsABCG38的靶序列，设计引物用于扩增含靶序列的DNA片段，扩增引物为ABCG38-CAS9-F：ATCCTTTGGCTGAAATCGGCTGTG(如SEQ ID NO：9所示)，ABCG38-CAS9-R：GCTGCTTTTTTAGGCTCTTCCCCAT(如SEQ ID NO：10所示)。用高保真酶PCR扩增含靶位点的DNA片段，反应体系为0.5μL DNA模板，1μL ABCG38-CAS9-F，1μL ABCG38-CAS9-R，4μL dNTP，15μL 2xbuffer，0.5μL KOD酶，加ddH2O至总体积30μL。反应程序：95℃预变性3min，30个循环：98℃变性10s，58℃退火30s，68℃延伸40s。PCR产物电泳，测序。筛选测序结果在靶位点处为单峰的单株，直接与野生型序列比对，分析靶位点基因型。在T₁代植株中筛选到靶位点发生突变，导致翻译提前终止的纯合敲除株系osabcg38-1、osabcg38-2，突变序列见图2。

(3)OsABCG38基因敲除株系的元素含量和农艺性状分析

将OsABCG38基因敲除株系osabcg38-1、osabcg38-2和野生型对照华占经浸种、催芽后，播种于剪去底部的96孔PCR板，营养液培养14天，再用0.2μM CdCl₂处理10天，用自来水、去离子水冲洗3遍，将地上部分和根系分开，80℃烘至恒重，粉碎、称量，用HNO₃-HClO₄混合液消煮，用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MAS)测定地上部分和根系的Cd含量。

结果如图3所示，敲除株系osabcg38-1、osabcg38-2地上部分和根系的镉含量均极显著下降，表明OsABCG38正调控水稻镉积累。

将osabcg38-1、osabcg38-2和野生型对照华占种植于镉污染大田发现，与野生型对照华占相比，osabcg38-1、osabcg38-2的株高、有效穗、每穗粒数、结实率和千粒重均无显著变化，详见表1。

表1 OsABCG38基因敲除株系的主要农艺性状

ICP-MAS检测糙米镉含量，结果见图4，osabcg38-1、osabcg38-2的糙米镉含量较野生型对照均显著降低，表明敲除OsABCG38基因可降低稻米的镉含量且对主要农艺性状无显著影响，OsABCG38正调控稻米镉含量。

(4)酵母异源表达鉴定OsABCG38基因的镉转运活性

构建OsABCG38基因的酵母表达载体pYES2-OsABCG38，并将此载体转化到镉敏感型酿酒酵母Δycf中。简述如下：

以水稻cDNA为模板，用高保真Taq酶PCR扩增OsABCG38的CDS，扩增引物为YES-ABCG38-F：ggatccagtgtggtggaattcATGTGCGCCGACGTCATC(如SEQ ID NO：11所示)，YES-ABCG38-R：accttcgaagggccctctagaCTATCTCTGCTGGAAATTTAAGGTTC(如SEQ ID NO：12所示)，电泳，胶回收OsABCG38的CDS片段，用EcoR I和Xba I双酶切酵母表达载体pYES2，使载体线性化，将线性化的pYES2和OsABCG38的CDS片段用重组克隆法进行连接(Vazyme公司的ClonExpress

II重组克隆试剂盒，产品目录号C112)，转化大肠杆菌，经菌落PCR扩增、测序验证，获得重组载体pYES2-OsABCG38。

将重组载体pYES2-OsABCG38和空载体pYES2用醋酸锂转化法(TAKARA酵母转化试剂盒，产品目录号630439)转化镉敏感型酵母菌株Δycf，以转化pYES2空载体的Δycf酵母菌株为对照，在添加半乳糖以及0μM、20μM、30μM镉的酵母诱导固体培养基上培养浓度梯度稀释的酵母转化子，3d后观察菌斑长势并拍照。结果如图5所示，无镉胁迫条件下表达OsABCG38的酵母和转化空载体的酵母长势一致；而在20μM、30μM镉胁迫下，与转化空载体的酵母相比，表达OsABCG38的酵母生长受到严重抑制，表明在酵母中表达OsABCG38基因使其对镉胁迫更加敏感。

为了分析表达OsABCG38基因增强酵母镉敏感性的原因，用添加5μM镉的酵母诱导液体培养基培养以上酵母转化子6h，超纯水清洗菌体3次，离心收集菌体，干燥、消解，ICP-MAS检测酵母转化子的镉含量。结果如图6所示，表达OsABCG38基因的酵母转化子的镉含量显著高于转化空载体的酵母转化子，表明在酵母中表达OsABCG38基因导致酵母吸入了更多的镉，OsABCG38基因具有镉吸入活性。

总的来说，本发明提供的调控稻米镉积累的基因OsABCG38主要在水稻的根系表达，利用基因编辑获得水稻OsABCG38敲除株系，通过苗期水培实验、镉污染大田实验发现，敲除OsABCG38使水稻植株根系、秸秆和糙米的镉含量均显著下降，且对主要农艺性状无显著影响，表明OsABCG38正调控水稻镉积累；酵母异源表达鉴定发现，与转空载体的酵母对照相比，表达OsABCG38的酵母对Cd胁迫更敏感且镉含量更高。

基于本发明提供的OsABCG38基因，通过基因编辑、EMS诱变、辐射诱变、航天搭载、分子标记辅助育种等技术，可用于改良现有水稻的镉积累特性，培育和创制稻米镉含量低的中间材料和水稻品种，操作简单，改良和培育新品种的周期短，且不影响主要农艺性状。

序列表

<110> 湖南杂交水稻研究中心

<120> 一种调控稻米镉积累的基因OsABCG38及其编码蛋白和应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3477

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa L.)

<400> 1

atgtgcgccg acgtcatcgt cggcgacgag ctgcggcgcg gcatctccgg cggccagaag 60

aagcgcctca ccacagcgga gatgctggtc ggcccgacca aggtcttgtt catggacgag 120

atatccaccg gcctggacag ctccaccacc ttccagatca tcaggtgcat ccagcagatc 180

gtccacatgg gcgaggccac cgtcctggtg tcgctgctgc agcccgcgcc ggagatcttc 240

gagctcttcg acgacgtcat gctactctcc gaggggcaga tcgtgtacca gggcccccgg 300

gagcatgtgc ttgagttctt cgagaggtgt gggttccgct gccccgagag gaaaggtgtt 360

gctgacttct tgcaggaggt tacatcaaag aaagatcagg agcagtactg gatacagagc 420

gagaaacctt atcgctacgt atcagtacct gaatttgttg caaagtttaa gaaatttcac 480

atggggaaga gcctaaaaaa gcagctttct gttcctttca acaaggggaa aatccacaag 540

tctgctctgg tattctccaa gcagtctgtt tctactttgg agcttctcaa gacctcgtgc 600

tccaaggaat ggcttctcat gaagcggaat tcatttgtct acattttcaa aacagttcag 660

ggaatcctag ttgcattgat agcatcaaca gttttcttgc ggacccagct caacacaaga 720

gatgaggacg atggccaaat ctatatagga gcccttattt ttgttatgat aactaatatg 780

ttcagtggtt ttgctgattt atctttaact ctggcaaggc tcccggtatt ctacaaacat 840

agggacttcc tgttttatag gccatggact tttgcacttc caaatgttct cgtgagaatc 900

cctagctccc tgtttgagtc gataatttgg gttgcaataa cctactacac catggggttt 960

gcccctgaag ctagcaggtt cttcaaacac ctgcttgtag tcttcatgct tcagcagatg 1020

gctgcaggac tgttcagagt caccgctggg ttatgcagga ctgttgtggt aacgaacact 1080

gcagggtctc ttgcagttct gatcatgttt gtgcttggag gattcatcct accaaaagat 1140

gcaatcccta aatggtgggt gtgggcttac tggtgttcac cccttactta tgcatacatt 1200

gccttttctt ccaatgaaat gcattctcca aggtggatgg acaaatttgt acctgatgga 1260

aagagattgg gagtggcagt tctagaaaat tcaggtgtct tcaccaataa ggaatggtac 1320

tggattgcaa ctggcgccct tctagggttc accattctgt tcaacgtgtt attctcgcta 1380

tcacttatgt acctgaaccc tgttggaaaa ccacaatcca tcctccctga agaaaccgat 1440

agtcaggaga acattcagga aggaaaaaac aaggcacata taaaacagat aattacagtt 1500

gaaacaccag aacctgtatc cccgaactca attatcaccc tggataaggt gattcaacaa 1560

ttgcgtggat attccgcaaa cacttctgat aggtcgcact catacattaa tgctgctggc 1620

agaactgctc caggaagagg gatggttctt ccatttgaac cgctctacat gtcctttaat 1680

gagataaatt actatgttga tatgcctttg gaaatgaaga gtcagggagt aactgccgat 1740

aagcttcaac tgctgtcagg gatatctgga gcttttcgac ctggtgttct gactgctctt 1800

atgggtgtta gtggggctgg aaagactacc ctcatggatg tcttatctgg gagaaagaca 1860

ggtggatata ttgaagggga aatctatata tcgggttacc caaagaacca agcaacattt 1920

gctagaatat caggctactg tgagcaaaat gacatccact ccccacagat tactgtaagg 1980

gagtccctac ttttctctgc tttcctgcgc ctgcctaagg aggtcaatga tcaagaaaag 2040

aagatctttg tggatgaagt tatggaactg gttgagctta ctggtctgaa agatgctatt 2100

gtgggcctcc ctggtgtgaa tgggctgtca acagaacaaa gaaagaggct gacaatcgct 2160

gtagagcttg tggcaaaccc ctcaattatc tttatggatg aaccaacttc tggtcttgat 2220

gcaagagcgg ctgctattgt tatgagaact gtacgtaaca ctgtcaatac tggaagaacc 2280

gttgtatgca ctattcatca accaagcatt gacatttttg aagcttttga tgagttgttg 2340

ctactaaaaa gaggaggcca ggttatatat tctggaccat tgggtacaaa ttctcataaa 2400

gttgttgagt actttgaggc aattcctgga gtcccaaaga tcgaagagaa tcgcaaccca 2460

gctacatgga tgctggatgt aagctcagct gcatcagaag ttcgattgga aattgatttt 2520

gctgaatatt acaggtcatc gactatgcac cagcgaacca aagcattggt aaaagaactg 2580

agcaatccac ctcctggttc cgatgacctc tacttcccta gtcaatactc gcagagcacc 2640

tttaatcagt tcaagctctg cctctggaaa caatggtgga cttactggag aagccctgat 2700

tataaccttg tcaggatttt ctttgcatta tttactgctt taatgttggg gactatattt 2760

tggagggttg gtcacaagat ggagagttca aaagatctct tggtcatcat tggatcaatg 2820

tatgctgccg tcttgtttgt tggttttgag aattctgtaa ctgttcaacc cgttgttgct 2880

gtggaaagga ctgtatttta cagagagcgg gcagctggaa tgtactcggc tataccatat 2940

gctctagctc aggttgttgt ggagataccg tatgtgttcg ttgagactgt catttacaca 3000

cttattgtct acccaatgat gtcgttccaa tggacaccag caaaattctt ctggttcttc 3060

tatgtttcat tcttcacctt cctctatttc acttactatg gcatgatgaa cgtctccgta 3120

tcaccaaacc ttcaggttgc ttccatattg ggtgctgcct tttacaccct tttcaatctc 3180

ttttcaggat tcttcatccc aagaccgaaa atcccaaaat ggtgggtttg gtactattgg 3240

ctttgtccag tggcatggac agtatacggc cttattgtgt cacagtacgg agatgtggag 3300

gattttatca cggtccctgg acaatctgat cagcaagtca gacctttcat caaggactat 3360

tttggctatg acccggactt catgggcgtc gtggctgcag tgctggctgg ctttactgtc 3420

ttcttcgctt ttacatatgc ttactccatc agaaccttaa atttccagca gagatag 3477

<210> 2

<211> 1158

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa L.)

<400> 2

Met Cys Ala Asp Val Ile Val Gly Asp Glu Leu Arg Arg Gly Ile Ser

1 5 10 15

Gly Gly Gln Lys Lys Arg Leu Thr Thr Ala Glu Met Leu Val Gly Pro

20 25 30

Thr Lys Val Leu Phe Met Asp Glu Ile Ser Thr Gly Leu Asp Ser Ser

35 40 45

Thr Thr Phe Gln Ile Ile Arg Cys Ile Gln Gln Ile Val His Met Gly

50 55 60

Glu Ala Thr Val Leu Val Ser Leu Leu Gln Pro Ala Pro Glu Ile Phe

65 70 75 80

Glu Leu Phe Asp Asp Val Met Leu Leu Ser Glu Gly Gln Ile Val Tyr

85 90 95

Gln Gly Pro Arg Glu His Val Leu Glu Phe Phe Glu Arg Cys Gly Phe

100 105 110

Arg Cys Pro Glu Arg Lys Gly Val Ala Asp Phe Leu Gln Glu Val Thr

115 120 125

Ser Lys Lys Asp Gln Glu Gln Tyr Trp Ile Gln Ser Glu Lys Pro Tyr

130 135 140

Arg Tyr Val Ser Val Pro Glu Phe Val Ala Lys Phe Lys Lys Phe His

145 150 155 160

Met Gly Lys Ser Leu Lys Lys Gln Leu Ser Val Pro Phe Asn Lys Gly

165 170 175

Lys Ile His Lys Ser Ala Leu Val Phe Ser Lys Gln Ser Val Ser Thr

180 185 190

Leu Glu Leu Leu Lys Thr Ser Cys Ser Lys Glu Trp Leu Leu Met Lys

195 200 205

Arg Asn Ser Phe Val Tyr Ile Phe Lys Thr Val Gln Gly Ile Leu Val

210 215 220

Ala Leu Ile Ala Ser Thr Val Phe Leu Arg Thr Gln Leu Asn Thr Arg

225 230 235 240

Asp Glu Asp Asp Gly Gln Ile Tyr Ile Gly Ala Leu Ile Phe Val Met

245 250 255

Ile Thr Asn Met Phe Ser Gly Phe Ala Asp Leu Ser Leu Thr Leu Ala

260 265 270

Arg Leu Pro Val Phe Tyr Lys His Arg Asp Phe Leu Phe Tyr Arg Pro

275 280 285

Trp Thr Phe Ala Leu Pro Asn Val Leu Val Arg Ile Pro Ser Ser Leu

290 295 300

Phe Glu Ser Ile Ile Trp Val Ala Ile Thr Tyr Tyr Thr Met Gly Phe

305 310 315 320

Ala Pro Glu Ala Ser Arg Phe Phe Lys His Leu Leu Val Val Phe Met

325 330 335

Leu Gln Gln Met Ala Ala Gly Leu Phe Arg Val Thr Ala Gly Leu Cys

340 345 350

Arg Thr Val Val Val Thr Asn Thr Ala Gly Ser Leu Ala Val Leu Ile

355 360 365

Met Phe Val Leu Gly Gly Phe Ile Leu Pro Lys Asp Ala Ile Pro Lys

370 375 380

Trp Trp Val Trp Ala Tyr Trp Cys Ser Pro Leu Thr Tyr Ala Tyr Ile

385 390 395 400

Ala Phe Ser Ser Asn Glu Met His Ser Pro Arg Trp Met Asp Lys Phe

405 410 415

Val Pro Asp Gly Lys Arg Leu Gly Val Ala Val Leu Glu Asn Ser Gly

420 425 430

Val Phe Thr Asn Lys Glu Trp Tyr Trp Ile Ala Thr Gly Ala Leu Leu

435 440 445

Gly Phe Thr Ile Leu Phe Asn Val Leu Phe Ser Leu Ser Leu Met Tyr

450 455 460

Leu Asn Pro Val Gly Lys Pro Gln Ser Ile Leu Pro Glu Glu Thr Asp

465 470 475 480

Ser Gln Glu Asn Ile Gln Glu Gly Lys Asn Lys Ala His Ile Lys Gln

485 490 495

Ile Ile Thr Val Glu Thr Pro Glu Pro Val Ser Pro Asn Ser Ile Ile

500 505 510

Thr Leu Asp Lys Val Ile Gln Gln Leu Arg Gly Tyr Ser Ala Asn Thr

515 520 525

Ser Asp Arg Ser His Ser Tyr Ile Asn Ala Ala Gly Arg Thr Ala Pro

530 535 540

Gly Arg Gly Met Val Leu Pro Phe Glu Pro Leu Tyr Met Ser Phe Asn

545 550 555 560

Glu Ile Asn Tyr Tyr Val Asp Met Pro Leu Glu Met Lys Ser Gln Gly

565 570 575

Val Thr Ala Asp Lys Leu Gln Leu Leu Ser Gly Ile Ser Gly Ala Phe

580 585 590

Arg Pro Gly Val Leu Thr Ala Leu Met Gly Val Ser Gly Ala Gly Lys

595 600 605

Thr Thr Leu Met Asp Val Leu Ser Gly Arg Lys Thr Gly Gly Tyr Ile

610 615 620

Glu Gly Glu Ile Tyr Ile Ser Gly Tyr Pro Lys Asn Gln Ala Thr Phe

625 630 635 640

Ala Arg Ile Ser Gly Tyr Cys Glu Gln Asn Asp Ile His Ser Pro Gln

645 650 655

Ile Thr Val Arg Glu Ser Leu Leu Phe Ser Ala Phe Leu Arg Leu Pro

660 665 670

Lys Glu Val Asn Asp Gln Glu Lys Lys Ile Phe Val Asp Glu Val Met

675 680 685

Glu Leu Val Glu Leu Thr Gly Leu Lys Asp Ala Ile Val Gly Leu Pro

690 695 700

Gly Val Asn Gly Leu Ser Thr Glu Gln Arg Lys Arg Leu Thr Ile Ala

705 710 715 720

Val Glu Leu Val Ala Asn Pro Ser Ile Ile Phe Met Asp Glu Pro Thr

725 730 735

Ser Gly Leu Asp Ala Arg Ala Ala Ala Ile Val Met Arg Thr Val Arg

740 745 750

Asn Thr Val Asn Thr Gly Arg Thr Val Val Cys Thr Ile His Gln Pro

755 760 765

Ser Ile Asp Ile Phe Glu Ala Phe Asp Glu Leu Leu Leu Leu Lys Arg

770 775 780

Gly Gly Gln Val Ile Tyr Ser Gly Pro Leu Gly Thr Asn Ser His Lys

785 790 795 800

Val Val Glu Tyr Phe Glu Ala Ile Pro Gly Val Pro Lys Ile Glu Glu

805 810 815

Asn Arg Asn Pro Ala Thr Trp Met Leu Asp Val Ser Ser Ala Ala Ser

820 825 830

Glu Val Arg Leu Glu Ile Asp Phe Ala Glu Tyr Tyr Arg Ser Ser Thr

835 840 845

Met His Gln Arg Thr Lys Ala Leu Val Lys Glu Leu Ser Asn Pro Pro

850 855 860

Pro Gly Ser Asp Asp Leu Tyr Phe Pro Ser Gln Tyr Ser Gln Ser Thr

865 870 875 880

Phe Asn Gln Phe Lys Leu Cys Leu Trp Lys Gln Trp Trp Thr Tyr Trp

885 890 895

Arg Ser Pro Asp Tyr Asn Leu Val Arg Ile Phe Phe Ala Leu Phe Thr

900 905 910

Ala Leu Met Leu Gly Thr Ile Phe Trp Arg Val Gly His Lys Met Glu

915 920 925

Ser Ser Lys Asp Leu Leu Val Ile Ile Gly Ser Met Tyr Ala Ala Val

930 935 940

Leu Phe Val Gly Phe Glu Asn Ser Val Thr Val Gln Pro Val Val Ala

945 950 955 960

Val Glu Arg Thr Val Phe Tyr Arg Glu Arg Ala Ala Gly Met Tyr Ser

965 970 975

Ala Ile Pro Tyr Ala Leu Ala Gln Val Val Val Glu Ile Pro Tyr Val

980 985 990

Phe Val Glu Thr Val Ile Tyr Thr Leu Ile Val Tyr Pro Met Met Ser

995 1000 1005

Phe Gln Trp Thr Pro Ala Lys Phe Phe Trp Phe Phe Tyr Val Ser Phe

1010 1015 1020

Phe Thr Phe Leu Tyr Phe Thr Tyr Tyr Gly Met Met Asn Val Ser Val

1025 1030 1035 1040

Ser Pro Asn Leu Gln Val Ala Ser Ile Leu Gly Ala Ala Phe Tyr Thr

1045 1050 1055

Leu Phe Asn Leu Phe Ser Gly Phe Phe Ile Pro Arg Pro Lys Ile Pro

1060 1065 1070

Lys Trp Trp Val Trp Tyr Tyr Trp Leu Cys Pro Val Ala Trp Thr Val

1075 1080 1085

Tyr Gly Leu Ile Val Ser Gln Tyr Gly Asp Val Glu Asp Phe Ile Thr

1090 1095 1100

Val Pro Gly Gln Ser Asp Gln Gln Val Arg Pro Phe Ile Lys Asp Tyr

1105 1110 1115 1120

Phe Gly Tyr Asp Pro Asp Phe Met Gly Val Val Ala Ala Val Leu Ala

1125 1130 1135

Gly Phe Thr Val Phe Phe Ala Phe Thr Tyr Ala Tyr Ser Ile Arg Thr

1140 1145 1150

Leu Asn Phe Gln Gln Arg

1155

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agaaggagtc caccctccac c 21

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcatccagca cagtaaaaca cg 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcaggttgtt gtggagatac 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cattggaacg acatcattgg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa L.)

<400> 7

acgtcatgct actctccgag 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa L.)

<400> 8

actcaagcac atgctcccgg 20

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atcctttggc tgaaatcggc tgtg 24

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gctgcttttt taggctcttc cccat 25

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggatccagtg tggtggaatt catgtgcgcc gacgtcatc 39

<210> 12

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

accttcgaag ggccctctag actatctctg ctggaaattt aaggttc 47

Claims

1.一种基因OsABCG38或其编码蛋白在改良水稻镉积累特性或培育镉低积累水稻品种中的应用，其特征在于，所述编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述基因OsABCG38的编码区核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，或所述基因OsABCG38的编码区核苷酸序列与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有80%以上同源性且其所编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，其应用方法包括如下步骤：通过突变所述基因OsABCG38使其编码蛋白的活性下调或失活，或抑制所述基因OsABCG38表达使其编码蛋白的丰度下调，进而改良水稻的镉积累特性或培育出稻米镉含量下降的镉低积累水稻品种。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，突变所述基因OsABCG38或抑制所述基因OsABCG38表达所采用的方式包括基因编辑、EMS诱变、辐射诱变或航天搭载。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，利用CRISPR/Cas9法进行基因编辑，进而改良水稻的镉积累特性或培育出稻米镉含量下降的镉低积累水稻品种，其应用方法具体包括以下步骤：

（1）在所述基因OsABCG38的第二外显子选取两段核苷酸序列作为靶序列，通过CRISPR/Cas9法构建所述基因OsABCG38的CRISPR/Cas9重组载体；

（2）将所述步骤（1）构建好的CRISPR/Cas9重组载体导入农杆菌EHA105中；

（3）将成熟饱满的水稻种子脱壳后用次氯酸钠消毒滤干，接种到诱导培养基上诱导愈伤组织；

（4）将所述步骤（2）后得到的农杆菌EHA105的菌液浸染所述步骤（3）后得到的愈伤组织，再经过共培养、筛选培养、分化培养、生根培养后，得到的T₀代小苗移栽至土中，收到种子再种植繁殖一代获得T₁代植株，进行靶位点基因型检测，筛选靶位点发生突变的单株，即完成水稻镉积累特性的改良或镉低积累水稻品种的培育。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中，两段靶序列的长度为20bp，第一条靶序列为位于所述基因OsABCG38编码区起始密码子ATG下游254-273 bp的正义链，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，第二条靶序列为位于所述基因OsABCG38编码区起始密码子ATG下游297-316 bp的反义链，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤（4）中，所述共培养、筛选培养、分化培养、生根培养的具体操作包括：将所述步骤（2）后得到的农杆菌EHA105的菌液浸染所述步骤（3）后得到的愈伤组织，再转到共培养基上24℃暗培养3天，清洗愈伤组织，转到含潮霉素的选择培养基上进行筛选培养30天；经选择后的抗性愈伤组织转到预分化培养基7-10天，再转到分化培养基光照培养，待小苗长至2-4 cm时转至生根培养基生长3周，得到T₀代小苗。

7.根据权利要求4-6中任一项所述的应用，其特征在于，所述步骤（4）中，进行靶位点基因型检测所采用的扩增引物包括正向引物ABCG38-CAS9-F和反向引物ABCG38-CAS9-R，所述正向引物ABCG38-CAS9-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，所述反向引物ABCG38-CAS9-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。