CN114773444B

CN114773444B - 硫素蛋白基因OsThi9在植物育种调控中的应用

Info

Publication number: CN114773444B
Application number: CN202210512340.7A
Authority: CN
Inventors: 易继财; 张树昌; 龚晓梅; 李芳柏; 刘秀莲; 陈华梅; 叶荣; 梁莹
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2022-05-12
Filing date: 2022-05-12
Publication date: 2023-10-20
Anticipated expiration: 2042-05-12
Also published as: CN114773444A

Abstract

本发明公开了硫素蛋白基因OsThi9在植物育种调控中的应用。属于植物基因工程领域。硫素蛋白基因OsThi9在植物育种调控中的应用，所述的硫素蛋白基因OsThi9的氨基酸序列如SEQID No:3所示。本发明通过将硫素蛋白基因OsThi9在水稻中过量表达，使得镉胁迫下过表达植株的生长明显优于野生型植株，而且过表达植株中的镉从根部到茎叶部的转移比野生型植株显著减少、籽粒镉含量比野生型植株显著降低，从而为水稻低镉分子育种、甚至将来创造具有多种抗性(抗病、抗重金属)且籽粒低镉的安全水稻提供了一种新的候选基因资源，也为水稻镉污染治理提供了一种潜在的修复方法。

Description

硫素蛋白基因OsThi9在植物育种调控中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及硫素蛋白基因OsThi9在植物育种调控中的应用。

背景技术

随着经济发展和人类活动增加，农田土壤重金属镉污染日趋严重。水稻对镉富集较强，即使在低/中度污染土壤中，稻米镉也可能超标。水稻是人类的主粮，稻米镉已成为人体摄入镉的主要来源。镉是毒性很强的重金属元素，可能导致人体发生严重疾病，如骨痛病、癌症等。在水稻体内，镉与疏基结合，或竞争取代必需元素，干扰细胞的重要生物学过程，可能导致水稻的生长阻碍甚至产量下降。目前，与水稻镉耐性或积累调控相关的基因资源非常有限。开发新的镉基因资源，对于水稻低镉分子育种及镉污染修复具有十分重要意义。

植物为了适应环境，自身产生了许多防御机制来应对镉毒害，如限制镉的吸收及向上转运、与镉螯合、将镉隔离、激活植物自身抗氧化系统等。与这些机制相关的基因，都可应用于水稻镉耐性或积累的调控。其中，富含半胱氨酸的多肽或蛋白质，如植物螯合肽(phytochelatin，PC)、金属硫蛋白(metallothionein，MT)等，通过螯合镉离子，降低其金属毒性，从而能影响植物的镉耐性或积累。

硫素蛋白(thionin)是植物中分布广泛的一类重要抗菌肽，它通过破坏细菌、真菌的细胞膜而起杀菌作用，在植物先天免疫系统中扮演重要角色(Stec，2006)。硫素蛋白也富含半胱氨酸，但是它与植物螯合肽、金属硫蛋白都不相同，因为大多数硫素蛋白N端还含有信号肽。因此，硫素蛋白不仅能结合镉离子，而且由于自身信号肽的作用，能将结合的镉随成熟蛋白的外排而转移到细胞壁，这种机制不仅提高水稻的镉耐性，还减少镉通过共质体途径向籽粒的输送，降低籽粒镉含量。关于硫素蛋白在水稻中的抗镉作用，目前尚未见报道。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供硫素蛋白基因OsThi9在植物育种调控中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

硫素蛋白基因OsThi9在植物育种调控中的应用，所述的硫素蛋白基因OsThi9的氨基酸序列如SEQID No:3所示。

所述的硫素蛋白基因OsThi9的核苷酸序列如SEQID No:1所示。

所述的植物育种调控是指在植物中过表达硫素蛋白基因OsThi9，提高植物对镉的耐受性，增加水稻生物量，降低植物籽粒中的镉含量。

所述的植物优选为禾本科植物；进一步优选为小麦、玉米和水稻中的至少一种；更优选为水稻。

硫素蛋白基因OsThi9在提高植物对镉的耐受性和/或制备/培育籽粒镉低积累植物品种中的应用。

包含硫素蛋白基因OsThi9的植物表达载体、宿主细胞在提高植物对镉的耐受性和/或制备/培育籽粒镉低积累植物品种中的应用。

一种增强植物对镉的耐受性和/或降低植物籽粒中的镉含量的方法，包括将硫素蛋白基因OsThi9过表达的步骤。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明通过将硫素蛋白基因OsThi9在水稻中过量表达，使得镉胁迫下过表达植株的生长明显优于野生型植株，而且过表达植株中的镉从根部到茎叶部的转移比野生型植株显著减少、籽粒镉含量比野生型植株显著降低，从而为水稻低镉分子育种、甚至将来创造具有多种抗性(抗病、抗重金属)且籽粒低镉的安全水稻提供了一种新的候选基因资源，也为水稻镉污染治理提供了一种潜在的修复方法。

(2)本发明通过过表达硫素蛋白基因OsThi9，能够有效提高水稻对镉的耐受性，降低水稻籽粒中的镉含量，为水稻低镉分子育种及镉污染治理提供了一种候选的基因资源和潜在的修复方法。

附图说明

图1为硫素蛋白基因OsThi9及其编码蛋白质的结构信息图；其中，(a)为硫素蛋白基因OsThi9的结构信息图；(b)为硫素蛋白基因OsThi9编码蛋白质的结构信息图；SP表示信号肽。

图2为硫素蛋白基因OsThi9表达对镉响应的qRT-PCR检测结果图；其中，(a)为不同Cd²⁺浓度下根部OsThi9基因的表达量结果图；(b)为不同Cd²⁺浓度下茎叶部OsThi9基因的表达量结果图；(c)为终浓度为0.1μM的CdCl₂溶液处理水稻根部不同时间后，根部OsThi9基因的表达量结果图；(d)为终浓度为0.1μM的CdCl₂溶液处理水稻根部不同时间后，茎叶部OsThi9基因的表达量结果图；3次独立生物学重复；每个重复3株；误差线表示±SD；t测验；*表示P<0.05。

图3为pOx载体的示意图。

图4为OsThi9基因过量表达的独立稳定纯合株系(O1、O2)及日本晴水稻野生型(WT)植株的表型观察及干重测定结果图；其中，(a)为OsThi9基因过量表达的独立稳定纯合株系(O1、O2)及日本晴水稻野生型(WT)植株的表型观察图；(b)为OsThi9基因过量表达的独立稳定纯合株系(O1、O2)及日本晴水稻野生型(WT)植株的根部和茎叶部的干重结果图；3次独立生物学重复；(a)的标尺为5mm；(b)中*代表P<0.05。

图5为分别经终浓度为100μM的CdCl₂溶液处理1周的OsThi9基因过量表达的独立稳定纯合株系(O1、O2)和日本晴水稻野生型(WT)各部位镉含量结果图；其中，(a)为镉处理(100μM)1周后OsThi9基因过量表达的独立稳定纯合株系(O1、O2)和日本晴水稻野生型(WT)的茎叶部和根部镉含量结果图；(b)为镉处理(100μM)1周后OsThi9基因过量表达的独立稳定纯合株系(O1、O2)和日本晴水稻野生型(WT)中的镉从根部到茎叶部的转移系数结果图；(c)为镉处理(100μM)1周后OsThi9基因过量表达的独立稳定纯合株系(O1、O2)和日本晴水稻野生型(WT)细胞壁中的镉浓度结果图；(d)为镉处理(100μM)1周后OsThi9基因过量表达的独立稳定纯合株系(O1、O2)和日本晴水稻野生型(WT)细胞壁中的镉占细胞总镉百分比结果图；3次独立生物学重复。*代表P<0.05；**代表P<0.01。

图6为土壤盆栽实验中OsThi9基因过量表达的独立稳定纯合株系(O1)和野生型(WT)植株的表型观察及镉含量分析结果图；其中，(a)为土壤盆栽实验中OsThi9基因过量表达的独立稳定纯合株系(O1)和野生型(WT)植株的表型观察结果图；(b)为土壤盆栽实验中OsThi9基因过量表达的独立稳定纯合株系(O1)和野生型(WT)植株长出的稻穗的表型观察结果图；(c)为土壤盆栽实验中OsThi9基因过量表达的独立稳定纯合株系(O1)和野生型(WT)植株的糙米和米壳中的镉含量结果图；(a)标尺为10cm；(b)标尺为5cm；*代表P<0.05。

图7为不同水稻植株根部细胞的镉荧光染色分析结果图；其中，(a)为野生型(WT)植株根部表皮细胞的镉荧光染色分析结果图；(b)为OsThi9基因过量表达的独立稳定纯合株系(O1)根部表皮细胞的镉荧光染色分析结果图；(c)为OsThi9基因过量表达的独立稳定纯合株系(O2)根部表皮细胞的镉荧光染色分析结果图；(a)-(c)的标尺为20μm。

图8为蛋白质亚细胞定位GFP空载体pYL322dl载体的示意图；(a)为GFP融合到目的蛋白N端的空载体示意图；(b)为GFP融合到目的蛋白C端的空载体示意图。

图9为硫素蛋白OsThi9在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位分析结果图；其中，(a)为绿色荧光蛋白(GFP)融合到OsThi9蛋白C端的瞬时表达载体转化洋葱表皮细胞结果图；(b)为绿色荧光蛋白(GFP)融合到OsThi9蛋白N端的瞬时表达载体转化洋葱表皮细胞结果图；(c)为GFP空载体转化洋葱表皮细胞结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。如非特殊说明，实施例中提及的载体(包括过量表达载体、亚细胞定位载体)的构建按照常规基因工程领域的操作方法，所用的骨架载体pCambia1300序列以及启动子元件(包括35S、Ubi)、报告基因(包括GFP)等序列，均为基因工程领域中已在相关网站或数据库公开的序列(https://cambia.org和https://www.ncbi.nlm.nih.gov)。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。实施例中所使用的化学试剂均为进口或国产分析纯。

pOx载体由华南农业大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室刘耀光院士提供。pOx载体已在Li YH,Yang YQ,Liu Y,Li CX,Zhao YH,Li ZJ,Liu Y,Jiang DG,LiJ,Zhou H,Chen JH,Zhuang CX,Liu ZL.Overexpression of OsAGO1b induces adaxiallyrolled leaves by affecting leaf abaxial sclerenchymatous cell development inrice.Rice(N Y),2019,12(1):60.一文中公开。

pYL322dl载体由华南农业大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室刘耀光院士提供。pYL322dl载体已在Han JL,Ma K,Li HL,Su J,Zhou L,Tang JT,ZhangSJ,Hou YK,Chen LT,Liu YG,Zhu QL.All-in-one:a robust fluorescent fusionprotein vector toolbox for protein localization and BiFC analyses inplants.Plant Biotechnol J,2022Feb 18.doi:10.1111/pbi.13790.一文中公开。

实施例中除非特殊说明，所用的水稻为野生型日本晴水稻，通过市售得到。

实施例1：

(1)水稻硫素蛋白基因OsThi9在GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的检索号为Os06g0514800，该基因位于水稻的第6染色体，其DNA长度为1153bp(如SEQIDNo:1所示)，含有3个外显子和2个内含子(图1(a))。OsThi9基因的mRNA长度为817bp(如SEQID No:2所示)，CDS长度为408bp(如SEQ ID No:4所示)，预测其编码的蛋白质氨基酸序列(如SEQID No:3所示)长度为135个氨基酸(图1(b))。利用信号肽预测软件SignalP-5.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0)，预测OsThi9蛋白质的N端1～27位氨基酸为信号肽序列(图1(b))。

在人工气候室中对日本晴水稻幼苗进行水培培养，每3d更换一次Kimura B营养液，培养条件为12h光照、28℃/12h黑暗、25℃，相对湿度60％。对培养4周龄的水稻幼苗根部进行镉处理(将CdCl₂溶液加入到水培液中，CdCl₂的终浓度分别为0μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM，处理1d；另外，按同样方法用终浓度为0.1μM的CdCl₂溶液分别处理水稻根部0h、3h、6h、9h、12h、1d、3d和7d)，选取根部和茎叶部为材料，采用基因工程领域的常规方法，依据试剂公司的操作手册，利用Invitrogen公司(美国)的Trizol试剂抽提水稻组织的RNA，利用Vazayme公司(中国)的II qRT SuperMix试剂盒反转录得到cDNA，然后利用Biorad公司(美国)的SYBR GREEN Master Mix定量PCR试剂盒对根部和茎叶部中OsThi9基因的表达量进行qRT-PCR检测。qRT-PCR检测所用引物为：5’-AGCCCTCTTGCTTTAGTT-3’(正向引物)和5’-CGTTTCTTGCTGTGGTGG-3’(反向引物)；扩增程序为：95℃变性3min，然后95℃变性15s，60℃退火20s，72℃延伸20s，共30个循环。以水稻Actin基因(Os10g0510000)为内标，所用引物为5’-CACATTCCAGCAGATGTGGA-3’(正向引物)和5’-GCGATAACAGCTCCTCTTGG-3’(反向引物)。

结果显示无论幼苗的根部还是茎叶部，不同浓度(0.1～100μM)CdCl₂溶液处理1d后，OsThi9基因表达量都比无Cd处理对照显著升高(图2(a)，图2(b))，表明OsThi9基因表达对Cd胁迫有响应，但是该基因的表达量不随Cd浓度升高而上升(图2(a)，图2(b))。将4周龄幼苗用0.1μM CdCl₂溶液处理不同时间(3h～7d)，结果显示无论根部还是茎叶部，Cd处理9h后至第3d，OsThi9基因的表达量即显著上升，且随Cd处理时间延长而逐渐上升(图2(c)，图2(d))。

(2)采用基因工程领域常规操作方法，按前述方法抽提水稻叶片组织的RNA、反转录得到单链cDNA，然后利用Vazyme(中国)公司的高保真酶Max Super-FidelityDNA Polymerase，扩增出包含OsThi9基因全长CDS序列的双链cDNA片段。PCR扩增的程序为95℃变性5min，然后95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃总延伸5min。PCR所用引物为：5’-CATGGAAGGAGTGAAGAGTTTG-3’(正向引物)和5’-TGCTTGCATGTTGCACTTGC-3’(反向引物)。经测序验证正确后，按基因工程领域的常规操作，将包含OsThi9基因全长CDS序列的双链cDNA片段插入到本研究室保存的含有Ubi启动子的过量表达载体pOx载体(见图3)中，得到由Ubi启动子驱动的OsThi9基因过量表达载体，即pUbi::OsThi9，然后转化日本晴水稻。对转化苗及后代进行种植和鉴定，获得OsThi9基因过量表达的独立稳定纯合株系(O1、O2)。

选取水培生长4周龄的OsThi9基因过量表达的独立稳定纯合株系(O1、O2)及日本晴水稻野生型(WT)植株幼苗，在加镉(将CdCl₂溶液加入到水培液中，CdCl₂的终浓度分别为10μM、100μM)或不加镉的水培液中培养1周。观察OsThi9基因过量表达的独立稳定纯合株系(O1、O2)及日本晴水稻野生型(WT)植株表型，测定终浓度为100μM的CdCl₂溶液处理下OsThi9基因过量表达的独立稳定纯合株系(O1、O2)及日本晴水稻野生型(WT)植株干重。

在无镉处理下，OsThi9基因过量表达的独立稳定纯合株系与日本晴水稻野生型(WT)生长均无明显差异(图4(a))；加镉处理后，所有株系幼苗的生长都受到明显抑制，但是OsThi9基因过量表达的独立稳定纯合株系(O1、O2)幼苗的生长均优于日本晴水稻野生型(WT)，且随镉处理浓度升高其生长差异越明显(图4(a))。对植株干重进行测定，发现镉处理(终浓度为100μM的CdCl₂溶液)1周后OsThi9基因过量表达的独立稳定纯合株系(O1、O2)幼苗的根部和茎叶部干重均比野生型(WT)显著增加，而无镉处理下OsThi9基因过量表达的独立稳定纯合株系(O1、O2)的干重与野生型(WT)相比无显著差异(图4(b))。这些结果表明，OsThi9基因过量表达提高了水稻镉耐性，促进了水稻生物量增加。

对上述分别经终浓度为100μM的CdCl₂溶液处理1周的OsThi9基因过量表达的独立稳定纯合株系(O1、O2)及日本晴水稻野生型(WT)水稻植株各部位(根部和茎叶部)中的镉浓度进行测定，方法如下：将植物样品用自来水洗净，于60℃烘干3～4d，直至恒重。称取适量样品(一般称取籽粒1.0g，叶1.0g，茎0.5g，根0.3g)，放入消煮杯中，加入10mL混酸(浓硝酸:高氯酸＝87:13，体积比)，利用石墨消解炉进行消解，直到杯中样品体积≤0.5mL时结束消煮。待样品冷却后加入5mL5％稀硝酸，混匀，倒入容量瓶中；再用超纯水润洗消煮杯2～3次，也倒入容量瓶中，最后定容到50mL。将样品混匀，用滤纸过滤杂质，收集溶液，转移到15mL离心管中。利用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES，PerkinElmer，美国)测定Cd浓度。

结果显示，镉处理(100μM)1周后OsThi9基因过量表达的独立稳定纯合株系(O1、O2)根部镉浓度均显著高于野生型(WT)，而其茎叶部镉浓度与WT相比无显著差异(图5(a))。

计算镉从根部到茎叶部的转移系数(镉从根部到茎叶部的转移系数＝茎叶部镉浓度/根部镉浓度)，显示镉处理(100μM)1周后，OsThi9基因过量表达的独立稳定纯合株系的镉转移系数均比野生型(WT)显著降低(图5(b))。

茎叶部细胞壁中的镉浓度测定结果显示，镉处理(100μM)1周后，OsThi9基因过量表达的独立稳定纯合株系(O1、O2)中细胞壁镉浓度均显著高于野生型(WT)(图5(c))。

计算细胞壁镉占细胞总镉百分比，显示镉处理(100μM)1周后，OsThi9基因过量表达的独立稳定纯合株系(O1、O2)细胞壁中的镉占细胞总镉的比例均显著高于野生型(WT)(图5(d))。

以上结果表明，OsThi9基因过量表达增加了镉在水稻根部的滞留、降低了镉从根部到茎叶部的转移，并改变了镉在细胞中的分配。

选取OsThi9基因过量表达的独立稳定纯合株系(O1)，以日本晴水稻野生型(WT)植株为对照，利用原位镉污染土(取自广东省清远市英德铁矿区周围的镉污染农田，土壤Cd含量为0.723mg/kg)进行盆栽实验。污染土经自然风干后过2mm筛，每盆装土10kg。将水稻种子消毒、萌发、催芽，沙床育苗20d后，挑选整齐一致的苗移栽到盆中。每盆种植3株，共30株。设置4～6组重复。土壤盆栽实验在网室内进行，自然光照和通风，生长期间保持淹水，日常管理，待水稻成熟后进行性状调查和元素测定。

结果显示，OsThi9基因过量表达的独立稳定纯合株系(O1)的表型与野生型(WT)植株相比无明显差异(图6(a)，6(b))，而且其产量、必需元素含量等性状与野生型(WT)植株相比也都无显著差异。但是，OsThi9基因过量表达的独立稳定纯合株系(O1)长出的糙米中的镉含量比野生型(WT)显著降低(降低了79％)，其米壳中的镉含量也比野生型(WT)下降了25％(图6(c))。这些结果表明，OsThi9基因过量表达的独立稳定纯合株系(O1)可以减少镉污染土壤中水稻籽粒中的镉含量，而不影响水稻生长及必需元素含量，可用于低镉水稻安全生产及镉污染治理。

选取水培生长4周龄的OsThi9基因过量表达的独立稳定纯合株系(O1、O2)及日本晴水稻野生型(WT)植株幼苗，向水培液中添加CdCl₂溶液，使CdCl₂的终浓度为100μM，继续培养1周。取水稻根部，用ddH₂O将根部洗净，放入含有1mL 20mM的Na₂-EDTA溶液的离心管中，室温放置10min，取出根部，用ddH₂O清洗3次，除尽残留的Na₂-EDTA。向Cd离子绿色荧光探针染料(Leadmium^TM绿色AM染料，Invitrogen公司，USA)中加入50μL DMSO，混匀，然后用0.85％NaCl溶液将染液稀释20倍。将稀释好的染液加入离心管中，淹没根组织，在40℃黑暗条件下反应2～3h。将根组织取出，置于载玻片上，利用激光共聚焦扫描显微镜(LSM710，ZEISS，德国)进行观察和拍照(激发波长和发射波长分别为488、515nm)。

结果显示，WT植株根表皮细胞的细胞壁和细胞质中都能观察到镉荧光信号，且细胞壁镉荧光比细胞质稍强(图7(a))；在OsThi9基因过量表达的独立稳定纯合株系(O1、O2)中，根表皮细胞中镉荧光都明显集中于细胞壁(图7(b)和图7(c))，且其细胞壁镉荧光比WT显著增强(图7(a)-(c))。这些结果表明，硫素蛋白OsThi9在细胞内可与镉结合，而且其过量表达时与镉结合增多，并促使镉定位到细胞壁上。

硫素蛋白OsThi9的N端1～27位氨基酸为信号肽序列(图1(b))，可引导成熟蛋白外排到细胞壁。按照基因工程领域常规操作方法，将绿色荧光蛋白(GFP)融合到OsThi9蛋白N端或C端，插入到本研究室保存的含有35S启动子的蛋白质亚细胞定位GFP空载体pYL322dl载体(图8)中，得到由35S启动子驱动的洋葱细胞瞬时表达重组载体，即p35S::GFP-OsThi9和p35S::OsThi9-GFP。转化洋葱表皮细胞，用0.3g/mL蔗糖溶液处理5～10分钟，以诱导质壁分离。

结果显示，当GFP融合到OsThi9蛋白C端时，荧光信号定位于细胞壁(图9(a))，而当GFP融合到OsThi9蛋白N端时，荧光信号位置(图9(b))与GFP空载体对照(图9(c))类似，即定位于原生质体。这些结果表明，OsThi9成熟蛋白的亚细胞定位为细胞壁，而GFP融合到OsThi9蛋白N端会干扰N端信号肽发生作用，故硫素蛋白N端信号肽对于成熟蛋白的细胞壁定位及镉外排具有决定作用。

因此，我们认为硫素蛋白OsThi9具有与镉结合、并在信号肽引导下促使细胞质镉外排到细胞壁的作用，从而提高水稻细胞的镉耐性，并同时减少细胞质镉经共质体途径向籽粒的输送，降低了籽粒镉含量。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 硫素蛋白基因OsThi9在植物育种调控中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1153

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<223> 硫素蛋白基因OsThi9的DNA序列

<400> 1

ctccaatcag atgcacaacc acaagaccaa ggaagcacta gcctttcagc cctcttgctt 60

tagtttgttg atccctgact aaatctcatt ggaaaacaag ctagaaaaca tggaaggagt 120

gaagagtttg atcatgtgta tgctagtgct aggcttagtc ctgcaacaag agaagatcca 180

ggtggaagca aagagttgtt gcccatccac cacagcaaga aacgtctata actcatgtcg 240

tttcgcgggt ggctcaagag acacctgtgc taaactttct ggctgcaaaa ttgttgatgg 300

gaactgcaag cctccttacg ttcaccatac ccttcaccca gaagctggta aattagaaac 360

attaactctc cttgtctata tttctatctt gcattcacca cgcccttcac cccagctaac 420

ctaggaaaat taaaacatat taactccctt tgtgtaaact tttgggctat taattttgta 480

atatctattg gtacaagcat ttattcatgc atatacatga ttttgcagag gaatcggagg 540

tagttgactt ctgcaagctg ggatgtgctt cgtctgtgtg cagcaccatg agcactcgta 600

agcgagaaaa aacatcaagc taaattacca ttgatttgca accaaaaaaa taaatattca 660

gctaaattac cattgatttg caaccaaaaa aataaatatt ctttgttcta tatagctaat 720

gtatagattg aaacgtttgt tttccttttc agtttttgcc aatgaagaag ccaatcatgc 780

cgtcgatcgt tgcaacgaag catgccgccg cttctgtacc aaggaagctg agactgtcac 840

cgttgtttcc taagcaagtg caacatgcaa gcataagggg cttcacacat ggaagcccat 900

ggtaggctat gccaccctgg agtactcata aataaaatgg atatcatgat atccaatcca 960

gtgtgccatc gatctctctt gatttctgtc acgttgtatt tccaataagc tatgataatc 1020

acgatctgcc atcatatatt atcttttctt gaggatgtga gcatatgtag agtgatgata 1080

tcattgccta agaaataaat cttgtcatcg ggatggatcc cttttgttaa agttatataa 1140

tgcatgctac ata 1153

<210> 2

<211> 817

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<223> 硫素蛋白基因OsThi9的mRNA序列

<400> 2

ctccaatcag atgcacaacc acaagaccaa ggaagcacta gcctttcagc cctcttgctt 60

tagtttgttg atccctgact aaatctcatt ggaaaacaag ctagaaaaca tggaaggagt 120

gaagagtttg atcatgtgta tgctagtgct aggcttagtc ctgcaacaag agaagatcca 180

ggtggaagca aagagttgtt gcccatccac cacagcaaga aacgtctata actcatgtcg 240

tttcgcgggt ggctcaagag acacctgtgc taaactttct ggctgcaaaa ttgttgatgg 300

gaactgcaag cctccttacg ttcaccatac ccttcaccca gaagctgagg aatcggaggt 360

agttgacttc tgcaagctgg gatgtgcttc gtctgtgtgc agcaccatga gcactctttt 420

tgccaatgaa gaagccaatc atgccgtcga tcgttgcaac gaagcatgcc gccgcttctg 480

taccaaggaa gctgagactg tcaccgttgt ttcctaagca agtgcaacat gcaagcataa 540

ggggcttcac acatggaagc ccatggtagg ctatgccacc ctggagtact cataaataaa 600

atggatatca tgatatccaa tccagtgtgc catcgatctc tcttgatttc tgtcacgttg 660

tatttccaat aagctatgat aatcacgatc tgccatcata tattatcttt tcttgaggat 720

gtgagcatat gtagagtgat gatatcattg cctaagaaat aaatcttgtc atcgggatgg 780

atcccttttg ttaaagttat ataatgcatg ctacata 817

<210> 3

<211> 135

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<223> 硫素蛋白基因OsThi9的氨基酸序列

<400> 3

Met Glu Gly Val Lys Ser Leu Ile Met Cys Met Leu Val Leu Gly Leu

1 5 10 15

Val Leu Gln Gln Glu Lys Ile Gln Val Glu Ala Lys Ser Cys Cys Pro

20 25 30

Ser Thr Thr Ala Arg Asn Val Tyr Asn Ser Cys Arg Phe Ala Gly Gly

35 40 45

Ser Arg Asp Thr Cys Ala Lys Leu Ser Gly Cys Lys Ile Val Asp Gly

50 55 60

Asn Cys Lys Pro Pro Tyr Val His His Thr Leu His Pro Glu Ala Glu

65 70 75 80

Glu Ser Glu Val Val Asp Phe Cys Lys Leu Gly Cys Ala Ser Ser Val

85 90 95

Cys Ser Thr Met Ser Thr Leu Phe Ala Asn Glu Glu Ala Asn His Ala

100 105 110

Val Asp Arg Cys Asn Glu Ala Cys Arg Arg Phe Cys Thr Lys Glu Ala

115 120 125

Glu Thr Val Thr Val Val Ser

130 135

<210> 4

<211> 408

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<223> 硫素蛋白基因OsThi9的CDS序列

<400> 4

atggaaggag tgaagagttt gatcatgtgt atgctagtgc taggcttagt cctgcaacaa 60

gagaagatcc aggtggaagc aaagagttgt tgcccatcca ccacagcaag aaacgtctat 120

aactcatgtc gtttcgcggg tggctcaaga gacacctgtg ctaaactttc tggctgcaaa 180

attgttgatg ggaactgcaa gcctccttac gttcaccata cccttcaccc agaagctgag 240

gaatcggagg tagttgactt ctgcaagctg ggatgtgctt cgtctgtgtg cagcaccatg 300

agcactcttt ttgccaatga agaagccaat catgccgtcg atcgttgcaa cgaagcatgc 360

cgccgcttct gtaccaagga agctgagact gtcaccgttg tttcctaa 408

Claims

1.硫素蛋白基因OsThi9过表达在降低水稻籽粒中的镉含量中的应用，其特征在于，所述的基因表达的硫素蛋白OsThi9的氨基酸序列如SEQID No:3所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的硫素蛋白基因OsThi9的核苷酸序列如SEQID No:1所示。

3.硫素蛋白基因OsThi9过表达在培育籽粒镉低积累水稻品种中的应用，其特征在于，所述的基因表达的硫素蛋白OsThi9的氨基酸序列如SEQID No:3所示。

4.包含硫素蛋白基因OsThi9过表达的植物表达载体在培育籽粒镉低积累水稻品种中的应用，其特征在于，所述的基因表达的硫素蛋白OsThi9的氨基酸序列如SEQID No:3所示。

5.包含硫素蛋白基因OsThi9过表达的宿主细胞在培育籽粒镉低积累水稻品种中的应用，其特征在于，所述的基因表达的硫素蛋白OsThi9的氨基酸序列如SEQID No:3所示。

6.根据权利要求3-5任一项所述的应用，其特征在于，所述的硫素蛋白基因OsThi9的核苷酸序列如SEQID No:1所示。

7.一种降低水稻籽粒中的镉含量的方法，其特征在于，包括将硫素蛋白基因OsThi9过表达的步骤；

所述的硫素蛋白基因OsThi9的核苷酸序列如SEQID No:1所示。