CN103917646B - 镉吸收控制基因、蛋白质、及镉吸收抑制水稻 - Google Patents

镉吸收控制基因、蛋白质、及镉吸收抑制水稻 Download PDF

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Abstract

本发明提供与根的Cd吸收的促进或抑制有关的转运蛋白基因、其突变基因及转运蛋白、以及抑制Cd吸收的水稻及Cd吸收抑制水稻的筛选、育成方法。是包含由序列编号2所表示的DNA碱基序列且编码与镉吸收的抑制相关的转运蛋白的基因、包含由序列编号3所表示的DNA碱基序列且编码与镉吸收的抑制相关的转运蛋白的基因、包含由序列编号4所表示的DNA碱基序列且编码与镉吸收的抑制相关的转运蛋白的基因、及包含序列编号1所记载的氨基酸序列且与镉吸收的抑制相关的转运蛋白。

Description

镉吸收控制基因、蛋白质、及镉吸收抑制水稻
技术领域
本发明涉及抑制根的镉(以下简称为Cd。)吸收的突变转运蛋白基因及突变转运蛋白、以及Cd吸收受到抑制的水稻突变体及低Cd吸收水稻品种。
背景技术
FAO/WHO的合同食品规格委员会为了减轻因食品中所含的Cd的摄取而导致的健康受害风险，而制定了规定食品中的Cd浓度的国际基准值。接受该基准值，日本在2011年2月修改了食品卫生法，稻米的规定值从1mgkg-1(糙米)大幅地变更为0.4mgkg-1(糙米和精米)。因此，当务之急是开发出使水稻的Cd吸收减少的技术。
作为水稻的Cd吸收减少技术，到目前为止，实施了利用换土而进行的土壤复原、土壤改良材料的投入、蓄水管理等务农技术(参照例如专利文献1及2。)。但是，就已有的方法而言，在所需年数、成本、效果方面看，还存在很多问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2011－83194号公报
专利文献2：日本特开2011－6529号公报
发明内容
发明所要解决的课题
作为替代已有的方法的技术，虽然低Cd吸收水稻品种的开发、导入在经济上来说环境负荷少、并且具有可持续的优点，但是到目前为止尚无开发出低Cd吸收水稻品种的报告例。本发明的课题在于，提供抑制根的Cd吸收的突变转运蛋白、突变转运蛋白基因及其突变基因、以及Cd吸收受到抑制的水稻及Cd吸收抑制水稻的筛选、育成方法。
用于解决课题的手段
本发明人对水稻种子照射重离子束，从所得的植物体中筛选低Cd吸收水稻突变体。进而，确定出所得的突变体的原因基因，从而完成了本发明。即，本发明如下所述。
＜1＞
＜2＞进而，本发明为一种基因，其包含由序列编号3所表示的DNA碱基序列且编码抑制镉吸收的突变转运蛋白。
＜3＞进而，本发明为一种基因，其包含由序列编号4所表示的DNA碱基序列且编码抑制镉吸收的突变转运蛋白。
＜4＞
＜5＞进而，本发明为一种突变转运蛋白，其包含序列编号5中记载的氨基酸序列且抑制镉吸收。
＜6＞进而，本发明为一种突变转运蛋白，其包含下述(P)或(R)中的氨基酸序列且抑制镉吸收：
(P)序列编号6中记载的氨基酸序列，
(R)与序列编号6中记载的氨基酸序列具有至少95％以上的同源性的氨基酸序列，并且是抑制镉吸收的蛋白质的氨基酸序列。
＜7＞进而，本发明是一种包含上述＜2＞或＜3＞所述的DNA的重组载体。
＜8＞进而，本发明是一种包含上述＜2＞或＜3＞所述的DNA的转化体。
＜9＞进而，本发明是一种通过使用上述＜7＞所述的重组载体而得的转化体。
＜10＞进而，本发明是一种用于确定包含上述＜2＞或＜3＞所述的DNA碱基序列的个体的基因标记。
＜11＞
＜12＞进而，本发明是一种上述＜5＞或＜6＞所述的蛋白质进行表达的镉吸收抑制水稻。
＜13＞进而，本发明是上述＜12＞所述的镉吸收抑制水稻，其出穗、收获量、味道与水稻品种越光为相同程度。
＜14＞
＜15＞
＜16＞进而，本发明是一种镉吸收抑制水稻，其是通过上述＜12＞或＜13＞所述的镉吸收抑制水稻突变体与已有的水稻品种的杂交而得的。
发明效果
本发明提供实用性高的低Cd吸收水稻品种。进而，通过将本发明的低Cd吸收水稻品种作为母本，从而能够在不进行基因重组操作的情况下育成新型的低Cd吸收水稻品种，另外，通过使用本发明的DNA标记，从而能够高效地筛选出低Cd吸收水稻品种。
附图说明
图1是表示在Cd污染田地中栽培时的糙米(brown rice)的镉浓度。
图2是表示越光(Koshihikari)与低Cd突变系统的生育状态的说明图。
图3是表示将#3-6-4与カサラス(Kasalath)杂交而得的F2个体(92个体)的茎叶Cd浓度的频度分布的图。
图4是表示通过基因作图来推定的低Cd基因的存在位置的图。
图5是表示在#7-3-6和#3-6-4的基因组DNA上的碱基的缺失和插入位置的图。
图6是表示越光(Koshihikari)与突变体的通过PCR而得到的DNA扩增片段长度的差异的电泳结果图。
图7是表示对导入了TRECA基因和treca-1基因的各酵母突变株在SD琼脂培养基中分别进行处理时的酵母的增殖程度的结果图。
图8是表示TRECA蛋白与treca-1蛋白的局部存在性的荧光观察图。
图9是使用基因标记来表示越光(Koshihikari)与突变体(#3-6-4,#3-5-20)的DNA扩增片段长度的差异的电泳结果图。
图10是使用基因标记来表示越光(Koshihikari)与突变体(#7-3-6)的DNA扩增片段长度的差异的电泳图。
具体实施方式
本发明是通过对将在花的育种等中经常使用的重离子束照射于水稻而得的低Cd吸收水稻品种的基因进行分析而得的、抑制Cd吸收的突变转运(Transporter regulatingcadmium absorption，调控镉吸收的转运蛋白、以下简称为TRECA。)蛋白、TRECA基因及该TRECA基因的突变基因(以下简称为treca。)，进而是包含该突变基因的低Cd吸收水稻品种及使用该低Cd吸收水稻品种而得的新的低Cd吸收水稻品种。以下，对于本发明详细进行说明。
＜关于TRECA基因＞
本发明的TRECA基因是编码序列编号1所示的与镉吸收相关的转运蛋白的、序列编号2所示的基因。序列编号2所示的碱基序列是通过对照射上述重离子束而得的Cd吸收抑制水稻的基因进行分析而确定出的碱基序列。本发明是来自TRECA基因的重金属转运蛋白基因的起始密码子至终止密码子为止的、所谓的开放阅读框(以下称作ORF。)。
上述TRECA基因是在RAP-DB(The Rice Annotation Project Database)、NCBI(The National Center for Biotechnology Information)等记载了遗传信息的数据库中，根据与功能已知的拟南芥的碱基序列的同源性等注视为具有重金属输送功能的基因的Nramp基因的一种。在RAP-DB中，记载为“similar to OsNramp1”，在NCBI中记载为“OsNramp5”，但对于其功能来说，尤其是对于为与水稻的镉吸收有关的基因而言，是以往完全不知道的。
本发明所述的TRECA基因优选为包含由序列编号2所示的碱基序列构成的多核苷酸的ORF，只要包含相当于该部分的部分，就可以为任意基因。例如，在该ORF上加入5'以及3'UTR后的基因也包含在本发明中。
对于本发明的TRECA基因来说，包括例如编码包含在序列编号1中记载的氨基酸序列中1个或数个氨基酸发生了置换、缺失、添加和/或插入后的氨基酸序列的蛋白质的突变体、诱导体。
另外，即使在碱基序列发生了突变的情况下，也存在其不伴随蛋白质中的氨基酸突变的情况(简并突变)，这样的简并突变体也包括在本发明的基因中。
获得上述基因的方法并没有特别限定，可采用一般的方法。例如，从具有该基因的生物的基因组DNA、基因组DNA文库等中利用适当的限制性内切酶将该基因切出并进行纯化即可。即，本发明的重金属转运蛋白基因中包括基因组DNA以及化学合成DNA。基因组DNA的制备可以利用对于本领域技术人员而言常规的手段来进行。基因组DNA例如能够通过如下方式加以制备：从对象生物中提取基因组DNA，制成基因组文库(作为载体，可利用质粒、噬菌体、黏粒、BAC、PAC等)，将其展开，使用以编码本发明的蛋白质的DNA(序列编号2)作为基础而制备出的探针，进行菌落杂交或噬菌斑杂交，由此来进行制备。
另外，还能够如下地加以制备：制成对编码本发明的重金属转运蛋白的DNA(序列编号2)特异的引物，进行利用该引物的PCR。
具体来说，为了制备编码与序列编号1中记载的重金属转运蛋白在功能上同等的蛋白质的基因，作为本领域技术人员熟知的方法，可举出利用“Southern, E.M. Journalof Molecular Biology, 98, 503 (1975)”所记载的杂交技术、“Saiki, R.K. 等Science,230, 1350-1354 (1985)、Saiki, R.K.等Science, 239, 487-491 (1988)”所记载的聚合酶链式反应(PCR)技术的方法。能够这样地通过杂交技术或PCR技术而分离出的编码与本发明的重金属转运蛋白具有同等的功能的蛋白质的基因也包括在本发明的基因中。
对于通过上述而分离出的基因来说，可认为在其编码的氨基酸水平上与本发明的蛋白质的氨基酸序列(序列编号1)具有高同源性。高同源性是指，在氨基酸序列全体中为80％以上、进一步优选为90％以上、特别优选为95％以上的序列的相同性。序列的相同性可通过FASTA检索(Pearson W.R.和D.J. Lipman (1988) Proc.Natl.Acad.Sci. USA.85:2444-2448)或BLASTP检索来确定。
＜关于TRECA蛋白＞
本发明所述的TRECA蛋白是由TRECA基因来编码、存在于细胞膜上、与镉及锰的吸收有关的蛋白质。在后述的全部缺失了编码本发明的TRECA蛋白的基因的系统(#7-2-13)或一部分发生了突变的系统(#3-6-4或#7-3-6等)中，镉及锰的吸收被大幅地抑制，由此可知，该蛋白质与镉及锰的吸收相关。另外，在酵母中导入有TRECA基因的系统中，TRECA蛋白显示出铁的输送活性，而在带有突变型的treca蛋白的酵母中未显示出铁的输送活性，因此，TRECA蛋白还涉及铁的吸收。但是，上述的缺失系统或突变系统在铁的浓度上并没有变化(表2)，由此可预测出：与目前为止所报告的作为铁吸收相关蛋白质的IRT或ZIP家族(Bughio N.等(2002) Journal of Experimental Botany. 53:1677-1682)相比，铁吸收能力低。
本发明所述的TRECA蛋白是包含以序列编号1所表示的氨基酸序列的蛋白质；或者是包含在以序列编号1所表示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸发生了缺失、置换或添加的氨基酸序列、且具有TRECA蛋白的重金属输送功能的蛋白质；或者与包含以序列编号1所表示的氨基酸序列的蛋白质在氨基酸水平上显示出80％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上的同源性、且具有TRECA蛋白的重金属输送功能的蛋白质。
＜关于TRECA基因的突变型treca-1基因及treca-1蛋白＞
本发明是序列编号3所示的TRECA基因的突变基因(以下称作treca-1基因。)。序列编号3所示的碱基序列是来自上述照射重离子束而得的Cd吸收抑制水稻#3-6-4的基因，是在上述序列编号2所示的TRECA基因中对cDNA的第10外显子的末端部位、碱基编号第1025至第1056的32bp加以置换而成为50bp后的基因。
本发明是上述序列编号3所示的treca-1基因的起始密码子至终止密码子为止的ORF，但只要含有相当于该部分的部分，就可以为任意基因。例如，在该ORF中加入5'和3'UTR而得的基因也包含在本发明中。
另外，本发明的treca-1基因包括例如编码包含在序列编号5中记载的氨基酸序列中1个或数个氨基酸发生了置换、缺失、添加和/或插入后的氨基酸序列的蛋白质的突变体、诱导体。
本发明所述的由treca-1基因编码的treca-1蛋白是氨基酸序列如序列编号5所示地从上述TRECA蛋白发生了突变且抑制了Cd吸收功能的蛋白质。treca-1蛋白是包含以序列编号5所表示的氨基酸序列的蛋白质；或者是包含在以序列编号5所表示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸发生了缺失、置换或添加后的氨基酸序列、并且丧失了TRECA蛋白的重金属输送功能的蛋白质；或是与包含以序列编号5所表示的氨基酸序列的蛋白质在氨基酸水平上显示出80％以上、优选90％以上、进一步优选95％以上的同源性、且丧失了TRECA蛋白的重金属输送功能的蛋白质。
＜关于TRECA基因的突变型treca-2基因及treca-2蛋白＞
本发明是序列编号4所示的TRECA基因的突变基因(以下称作treca-2基因。)。序列编号4所示的碱基序列是来自照射上述重离子束而得的Cd吸收抑制水稻#7-3-6的基因，在上述序列编号2所示的TRECA基因(cDNA)中的碱基编号第915处发生了一个碱基缺失(胞嘧啶的缺失)。
本发明所述的treca-2基因优选为包含由序列编号4所示的碱基序列构成的多核苷酸的ORF，但是只要包含相当于该部分的部分，就可以为任意基因。例如，在该ORF中加入5'和3'UTR而得的基因也包含在本发明中。
本发明的treca-2基因包括例如编码包含在序列编号6中记载的氨基酸序列中1个或数个氨基酸发生了置换、缺失、添加和/或插入后的氨基酸序列的蛋白质的突变体、诱导体。
由本发明所述的treca-2基因编码的treca-2蛋白是氨基酸序列如序列编号6所示地由上述TRECA蛋白发生了突变且抑制了Cd吸收功能的蛋白质。treca-2蛋白是包含以序列编号6所表示的氨基酸序列的蛋白质；或者是包含在以序列编号6所表示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸发生了缺失、置换或添加后的氨基酸序列、且丧失了TRECA蛋白的重金属输送功能的蛋白质；或是与包含以序列编号6所表示的氨基酸序列的蛋白质在氨基酸水平上显示出80％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上的同源性、且丧失了TRECA蛋白的重金属输送功能的蛋白质。
＜关于TRECA基因以及其突变型treca基因的重组载体＞
基于本发明的重组载体是编入有上述TRECA基因、突变型的treca-1基因或treca-2基因中的任一种基因的重组载体。上述载体通过公知的转化方法被以能够表达的方式导入到目标植物中，由此使被编入到该植物中的基因或基因片段进行表达，从而能够获得本发明所述的蛋白质。
基于本发明的重组载体优选为双元载体(binary vector)，其中，特别优选日本特开平10-155485号公报中记载的“大容量双元穿梭载体(binary shuttle vector)”。
＜关于转化体＞
在制作本发明的表达基因的转化体的情况下，将插入有上述基因的上述载体导入到目标植物细胞中。向该植物细胞中导入载体可使用公知的方法，例如可使用土壤农杆菌法、电穿孔法、基因枪法、显微注射法等，其中，最优选土壤农杆菌法。
上述本发明的表达基因的转化体并不限定为水稻，只要是具有控制根的Cd吸收的蛋白质、基因的植物，就没有限制。
＜关于基因标记＞
本发明中的基因标记是根据上述TRECA基因与突变型treca基因的碱基序列的不同来识别个体的标记。
上述基因标记是根据碱基序列的不同来判断本发明的基因是否通过杂交或转化而被导入到另一水稻品种中的记号。以从水稻中提取出的基因组DNA为模版，使用具有根据基因组DNA的碱基序列而适当地选择的碱基序列的合成寡核苷酸作为引物，在使其混合后的反应液中进行PCR扩增反应，将包含其产物的反应液加入到例如琼脂糖电泳中后，可将扩增后的各种DNA片段区分，从而能够确认出该DNA片段对应于本发明的基因组DNA。
根据本方法，例如从越光(Koshihikari)等水稻品种和#3-6-4突变体中提取基因组DNA，根据能够将目标碱基部分(插入了碱基的部分)扩增的引物组的种类，将提取物的基于PCR的DNA扩增片段加入到电泳中后可分别区分为200～500bp和600～800bp，从而能够用于各个体的识别。在为#7-2-13突变体的情况下，通过不显现出DNA的扩增片段而能够与其他品种进行识别。需要说明的是，引物只要是能够将突变区域扩增的碱基序列，就没有限制。
在为#7-3-6突变体的情况下，利用能够将包含一个碱基缺失(一塩基欠損)区域的碱基部分扩增的引物组[例如[Os7g2572_F2976g(5'-TATATTCAGCCTGGGCAGATCGAG-3'：序列编号7)、Os7g2572_R3815g(5'-TGATGTACTGTCCAGCGTATGTGC-3'：序列编号8)]等，通过PCR反应使DNA片段扩增，将带有因一个碱基缺失而新产生的限制性内切酶位点的DNA扩增片段利用特定的限制性内切酶(例如FspI)等加以切断处理，从而能够与其他品种进行。需要说明的是，引物只要是能够将突变区域扩增的碱基序列，则没有限制。另外，限制性内切酶只要能够将突变区域切断，就没有限制。
另外，在为#7-3-6突变体的情况下，将DNA扩增片段通过离心柱(spin column)法、玻璃珠吸附法等加以纯化，通过序列分析仪来读取扩增部分的DNA碱基序列，由此对本发明的DNA碱基序列中包含的一个碱基缺失进行检测，以该信息为基础开发SNP(单核苷酸多态性)标记，由此能够进行个体的识别。
＜利用了重离子束的镉吸收抑制水稻突变体的制作＞
对水稻种子照射重离子束。作为用于制作出镉吸收抑制水稻突变体的重离子束的辐射剂量，只要在不对水稻种子造成损伤且能够诱发突变的范围内，就没有特别限定，如果为能够高频度地诱发的碳离子束，则优选为20～60Gray的范围。
上述照射重离子束后的种子(第1代种子、以下简称为M1。第2代以后也同样。)可供于通常的栽培，所得的M2种子可供于低Cd突变体的筛选。使用M2种子来筛选低Cd突变体的方法有下述的两种方法。
在M2的筛选中，将播种后经过10天的幼苗利用加入有Cd的水培液加以处理后，将幼苗的茎部切断，将从切断面流出的导管液利用原子吸光光度计等测定Cd浓度，筛选低Cd的突变体，此种方法在不仅为培养室等节省空间，而且在无法获得Cd污染土壤的情况下特别优选。另外，下一代种子(M3种子)可通过使从切断后的残株中长出的新芽(蘖)生长而加以确保。进而，通过使该种子(M3种子)自我繁殖，从而能够获得M4、M5等代发展了的低Cd吸收水稻。
在能够利用Cd污染土壤的情况下，将M2种子播种在培养土中后，将经过1个月的幼苗移植到Cd污染土壤中，经过收获、干燥、脱壳、磨皮的步骤而得到糙米，对于该糙米分析Cd浓度，筛选出糙米Cd浓度低的个体，从而能够得到低Cd吸收水稻(M3种子)。进而，通过使该种子进行自我繁殖，从而能够获得M4、M5等代发展了的低Cd吸收水稻，在这方面与上述水培栽培相同。
＜由低Cd吸收水稻的重金属转运蛋白基因的获得＞
作为获得本发明所涉及的基因的方法，可举出杂交技术、聚合酶链式反应(PCR)技术。前者例如制备与本发明的基因的碱基序列或其一部分特异地进行杂交的探针，筛选基因组DNA文库、cDNA文库。后者例如使用公知的日本晴的序列信息，设计通过PCR法使本发明的基因发生扩增的引物组(5’侧和3’侧)，将cDNA作为模版进行PCR，使两引物所夹持的DNA区域扩增，从而能够获得发明所涉及的基因。
＜重金属转运蛋白的鉴定＞
对于本发明所涉及的蛋白质来说，通过循环测序法来确定上述分离出的基因的碱基序列，从而能够根据密码子而将碱基序列转换成氨基酸序列。将该氨基酸序列对照水稻基因组数据库(RAP-DB)，从而能够鉴定出蛋白质。
＜将低Cd吸收水稻突变体作为母本的新的低Cd吸收水稻的育种方法＞
将具有根据本发明所得的DNA的低Cd吸收水稻突变体与已有的品种进行杂交，利用基于本发明的基因标记，由此能够效率良好地制作出新的低Cd吸收水稻品种。
作为该制作方法，具有以下的步骤。
1)将低Cd吸收水稻(A植物)与已有的水稻品种(B植物)进行杂交而作出F1。
2)使上述F1与上述B植物杂交。
3)从杂交后的植物中利用基因标记筛选出具有低Cd基因的个体。
4)通过与B植物重复地杂交的“回交”，而有目的地将A植物所具有的低Cd基因(例如treca-1基因或treca-2基因)导入到B植物中。
5)此时，为了从多数回交个体中仅筛选出具有低Cd基因的个体，能够活用基因标记。本发明的基因标记能够识别具有低Cd基因的个体及其以外的个体。
6)在筛选上述个体时，使用从幼苗阶段的茎叶、根中提取出的基因组DNA即可。
7)反复与B植物进行杂交，用标记筛选出进入有低Cd基因的个体，由此能够制作出基因组结构的大部分为B植物，仅Cd吸收为A植物的遗传性状的新品种(例如低Cd的Akitakomachi(あきたこまち))。
8)B植物可以为粳稻(Japonica)种，也可以为籼稻(Indica)种。
实施例
以下，通过实施例对本发明的内容进一步具体地示出，本发明并不限于本实施例的记载。
＜实施例1－Cd吸收少的水稻突变体的筛选＞
(重离子束照射)
使用独立行政法人日本原子力研究研发机构高崎量子应用研究所的TIARA，将经重离子束照射(碳离子、320MeV,40Gy)后的水稻(品种越光(Koshihikari))种子(该种子为第1代种子，以下简称为M1，而将第2、第3代等称作M2、M3等。)3500粒播种在培养土(住友化学公司制、商品名：ボンソル1号)中，将所得的幼苗逐个地移植到(独)农业环境技术研究所所有的水田田地中，通过(独)农业环境技术研究所的例行的栽培管理而由各个体获得M2种子。将所得的M2种子约100,000粒全部混合，供试于以下的低Cd突变体的筛选步骤。
(低Cd突变体的筛选方法以其1－导管Cd浓度为指标的简易筛选法)
将M2的催芽种子播种在底面开孔为3mm口径的孔的96孔的PCR板中，使板载于由聚苯乙烯泡沫塑料制成的漂浮台上，置于加入了木村B水培液(1/2浓度)的20L容量的盛装容器中。
将播种后经过10天的幼苗在加入了0.1ppm的Cd浓度后的水培液中处理4天。处理后，将各个体的茎部在距离板2cm上部切断，使从切断面流出的导管液吸入到脱脂棉中，通过离心分离(2,000rpm、1分钟)，仅回收导管液。对于所选取使用的板，在96孔PCR板的底部开出2mm口径的孔，填充脱脂棉后，与未开孔的板二板相重叠。使导管液吸入到脱脂棉中，通过离心分离(2,000rpm、1分钟)，回收到下方的板处。
通过上述回收的导管液在用0.1M硝酸稀释50～200倍后，利用原子吸光光度计(安捷伦科技公司制、商品名；spectrAA220Z)测定Cd浓度。需要说明的是，与从越光(Koshihikari)收集的导管液的Cd浓度相比，仅回收显示为其1/5以下的Cd浓度的个体，为了易于产生蘖(从茬中长出的新芽)而确保下一代种子(M3)，移植到培养土中后进行收集。
通过上述方法，对约3,000个体进行Cd处理，从其中筛选生育与越光同等、且导管Cd浓度为越光的1/5～1/20的4种突变体(#3-5-20,#6-4-10,#11-6-12,#12-3-5)，另外，通过上述方法收集M3种子。将该突变体的导管Cd浓度示于表1。需要说明的是，在表1中，在同一板上分别对所栽培的越光与突变体进行比较。
【表1】
(低Cd突变体的筛选方法以其2－糙米Cd浓度为指标的筛选法)
以导管液的Cd浓度为指标的筛选法是节省空间、且能够简便地实施的方法，但另一方面，对于是否筛选了糙米Cd浓度低的个体无法进行评价。因此，以筛选糙米Cd浓度低的突变体为目的，优选直接分析糙米Cd浓度的方法，然而为了将多数的突变体在Cd污染田地一直栽培到成熟期，而只能在特定的场所来实施。在此，如果存在少量的Cd污染土壤和温室等比较节省空间，则设计出能够栽培多数的突变体，能够通过糙米Cd浓度而筛选出低Cd突变体的方法。
将M2的催芽种子播种在培养土中后，将经过1个月的幼苗2,592个体逐个移植到装有Cd污染土壤(0.1M盐酸提取的土壤Cd浓度：1.8mgkg-1)的小型聚乙烯钵(Y形壶、7.5cm径、底面有孔)，作为对照而将未经重离子束处理的越光288个体同样地进行移植。在塑料盛放容器(新T0托盘(ニューT0トレイ))中40个壶分开配置，进行蓄水(湛水)管理直至孕穂期。然后，通过进行排水(落水する)使土壤中所含的Cd溶出，在土壤不干燥的程度下持续地给予自来水直至灌浆期。对于施肥，在最大分蘖期给予各壶0.05g-N/壶(土壤300g)。对于收获来说，对各个个体分别进行实施，经过干燥、脱壳、稻谷去皮的步骤后得到第M3代的糙米。将所得的M3糙米完全溶解在硝酸－高氯酸中，其分解液用mill-Q水适当地稀释后，对稀释液中的Cd浓度利用电感耦合等离子体质谱分析装置(珀金埃尔默公司制、商品名；ELAN DRC-e)进行测定。
通过上述方法，筛选出M3种子的糙米Cd浓度低的3种突变体(#3-6-4,#7-3-6,#7-2-13)。
＜实施例2－低Cd突变性状的稳定性确认＞
(水培栽培条件下的评价)
播种以糙米Cd浓度为指标所筛选出的低Cd突变体(#3-6-4,#7-3-6,#7-2-13)的M3系统和未经重离子束处理的越光(以下简单地称为越光。)的种子，利用水培法对与实施例1同样地经过10天后的苗进行Cd处理。进行Cd处理后在经过4天后，进行收获，分为茎叶部和根部而进行干燥。利用与实施例3的糙米相同的方法利用强酸对该干燥物进行分解。在分解液中，除了Cd以外，还包含对于植物来说作为必须元素的锰(Mn)、铜(Cu)、铁(Fe)、锌(Zn)的含量，这些所有的元素通过电感耦合等离子体发光分析装置(ICP-OES)(安捷伦公司制、商品名；Vista-Pro)同时进行测定。结果示于表2中。
【表2】
根据表2，与越光进行比较，突变系统的茎叶部Cd浓度均为1/7左右。另外，在根Cd浓度中，在所有的突变系统中均为越光的1/4左右。由此可知，所有的突变系统中的低Cd的原因是由根的Cd吸收低所引起的。另外，对其他的重金属浓度进行比较，其结果，对于突变系统来说，其特征在于，茎叶部、根部的锰浓度均明显变低，在所有的变异系统中都确认到了相同的现象。
(Cd污染田地条件下的评价)
将以实施例1的糙米Cd浓度所筛选出的低Cd突变体(#3-6-4,#7-3-6,#7-2-13)繁殖至M4代的系统与越光栽培到Cd污染田地(Cd浓度1.8mgkg-1)中。水管理依照水稻栽培的例行法，以中干(中干)与间断灌溉来进行。对于施肥来说，作为基肥而给予5kg-N/10a、8kg-P2O5/10a、8kg-K2O/10a，作为穗肥而使用了2kg-N/10a。收获灌浆期的糙米，利用强酸进行分解后，对于溶液中所含的Cd以ICP-MS(珀金埃尔默公司制、商品名；ELAN DRC-e)进行测定，对于其他的重金属以ICP-OES(安捷伦公司制、商品名；Vista-Pro)进行测定。结果示于图1，将栽培时的生育状况示于图2中。
根据图1可知，3个突变系统的M5糙米的Cd浓度与越光相比明显变低，对于低Cd突变性状来说，即使为世代发展了的糙米，也稳定地保持得较低。进而，与(水培栽培条件下的评价)同样地，即使为糙米，锰浓度也低，且为越光的一半以下。糙米的锌、铜、铁浓度在突变系统和越光中是相同程度的。
由图2可知，在实施例1中所筛选出的突变体中，1个系统(#7－2－13)与越光相比，出穗早出2周，作物生长高度小。其他的突变系统与越光为同等的出穗期，在达观的评价中，与越光没有区别。完全没有发现因锰浓度少所致的对于叶色的影响或不稔等。
＜实施例3－遗传分析＞
(微阵列芯片实验)
利用上述突变体(#3-6-4)与越光的根，根据RNA纯化试剂盒(株式会社Rizo(リーゾ)制、商品名：RNAすいすい-S)的规程，提取RNA。对于RNA浓度，利用分光光度计(ThermoFisher Scientific制、商品名：ナノドロップNanoDrop1000)检测所提取出的RNA是否分解，对于其品质，利用Agilent公司的バイオアナライザー2100进行检测。
利用所提取出的全部RNA(400ng)，使用T7 promoter primer(启动子引物)(Agilent公司)进行逆转录反应，合成cDNA。添加用于荧光标记的Cyanine3(以下称为Cy3。)和Cyanine5(以下称为Cy5。)，通过在包含T7RNA聚合酶的Transcription Mix(转录混合)溶液(Agilent公司)中进行反应，从而合成了标记cRNA。
将由上述各个体所提取、合成的标记cRNA利用Qiagen RNeasy Kit(Qiagen公司制)进行纯化后，使用上述Agilen公司的バイオアナライザー(生物分析仪)2100来检测RNA浓度和品质。将以Cy3和Cy5加以标签化后的cRNA在cRNA靶溶液中混合，为了靶的片段化而添加fragmentation buffer(Agilent公司)，在60℃下孵化30分钟。将其溶液滴加至配置有水稻的寡聚DNA微阵列芯片4×44RAP-DB(Agilent公司制)的43,803的合成寡核苷酸的探针面，用保护玻璃覆盖后，在恒温槽内(60℃、17小时、10rpm)下使其发生杂交反应。
将上述保护玻璃用2种清洗液冲洗后，通过氮气除去水滴，使用微阵列芯片扫描器(Agilent公司制)来测定荧光信号。荧光信号的定量化采用Agilent公司的FeatureExtraction软件。有关微阵列芯片的操作步骤依照微阵列芯片实验和分析文本(マイクロアレイ実験&解析テキスト)(独立行政法人农业生物资源研究所编著、发行)来进行。
可认为对于通过上述实施例2所筛选出的低Cd突变体(#3-6-4)来说，在向细胞内运入镉和锰的转运蛋白中存在突变。因此，就上述的微阵列芯片实验的结果来说，目前为止对于拟南芥(Thomine等,2000,PNAS,97,4991-4996)、酵母(Cohen等,2000,J.Biol.Chem.,275,33388-33394)来说有报告例，且特别着眼于被特定作为2价阳离子(Fe2+或Mn2+等)的输送体的Nramp家族的基因表达。在水稻的Nramp家族中，发现了OsNramp1至OsNramp7(Takahishi等,2011,J.Exp.Bot.,62,4843-4850)，但是其中，OsNramp5(Os07g0257200)的基因表达在突变体与越光之间发现2.5倍的表达差，而对于其他的Nramp家族来说，没有有意义的表达差(1.0～1.7倍的差)。
(基因作图)
为了鉴定低Cd突变体(#3-6-4)所带有的低Cd吸收基因，进行了基因作图。播种由#3-6-4与作为籼稻品种的カサラス(Kasalath)的杂交而得到的F2种子，将92个体的幼苗在加入有0.02ppm的Cd浓度的木村B水培液(1/2浓度)中栽培4天，测定各个体的茎叶Cd浓度。结果示于图3，将Cd浓度以每4mgkg-1分级地示出。
由图3可知，将茎叶Cd浓度为8-12mg kg-1作为界限，分为2组，在92个体中，22个体成为低Cd组、其余的70个体成为高Cd组，其分离比示出为1:3(χ2＝0.058,p＝0.810)。由此可知，低Cd突变体由单一的隐性基因控制。
接下来，为了鉴定(作图)隐性基因在染色体上的位置，利用97个微卫星(SSR)标记来调查92个体的基因型。利用MAPMAKER/EXPver.3.0软件来构建连锁图。对于基因作图来说，以92个体的Cd浓度和基因型数据为基础，利用软件(QTL Cartographer ver.2.5)来实施。
基因作图的结果示于图4，由图4可知，低Cd基因存在于第7染色体上的SSR标记RM3767的附近。基于RAP-DB的基因检索的结果为，在该标记附近存在注释为重金属转运蛋白基因的OsNramp5，但是对于OsNramp5的功能、例如搬运何种重金属元素来说尚不清楚。
(碱基序列的确定)
根据上述(微阵列芯片实验和基因作图)的结果，在OsNramp5中引入靶，来确认变异有无插入。由突变体(#3-6-4、#7-3-6、#7-2-13)和越光的根，利用上述RNA纯化试剂盒(RNAすいすい-S)提取出RNA，然后通过逆转录酶(TOYOBO公司制、商品名：ReverTra Ace)来合成1根cDNA。将该cDNA作为模版，使用引物组CNPorf5(5′-CACCATGGAGATTGAGAGAGAGAGCAGTG-3′：序列编号9)和CNPrt3(5′-ACACCCTTGTCGATCGATCGATCTG-3′：序列编号10)(Operon(オペロン)公司制)来进行PCR，将包含全长ORF的扩增片段克隆进pENTR/D-TOPO载体(Invitrogen公司制)。使用本载体所含的Universal M13序列测定位点[M13Forward(-20)(5′-GTAAAACGACGGCCAG-3′：序列编号11)、M13Reverse(5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′：序列编号12)]以及TRECA基因特异的引物[CNP_Gcheck FW(5′-GCAAGTCGAGTGCGATCGTG-3′：序列编号13)、CNP_Gcheck RV(5’-CGCCGATGATGGAGACGATG-3’：序列编号14)]，利用DNA序列分析仪ABI3130xl(AppliedBiosystems公司制)来确定被克隆进pENTR/D-TOPO载体(Invitrogen公司制)的TRECA基因的碱基序列。
另外，为了解读候选基因(候補遺伝子)的基因组序列，根据Xu等(2005,PlantMolecular Biology Reporter23,291-295)的方法来提取基因组DNA。以RAP-DB的数据库为基础，设计在ORF序列中夹入发现了突变的区域的引物[CNP_Gcheck FW(5′-GCAAGTCGAGTGCGATCGTG-3′：序列编号13)、CNP_Gcheck RV(5’-CGCCGATGATGGAGACGATG-3’：序列编号14)]，利用PCR使基因组DNA发生扩增后，通过直接测序分析确定出碱基序列。
在上述确定出的碱基序列中，日本晴和越光显示出完全相同的序列，将该序列示为序列编号2。另外，将突变体(#3-6-4)的ORF序列示为序列编号3，将突变体(#7-3-6)的ORF序列示为序列编号4。
上述越光/日本晴的ORF的长度为1617bp。发现#7-3-6的ORF是在越光/日本晴的序列第915处发生了一个碱基缺失(胞嘧啶缺失)。另外，#3-6-4的ORF为在越光/日本晴的ORF的第1025至1056处将32bp变为插入50bp，ORF的长度变成1635bp。
需要说明的是，#7-2-13无法获得基于PCR的扩增产物，因此判断候选基因的碱基序列大部分缺失。
在序列编号1中显示出越光/日本晴的氨基酸序列。#7-3-6由于一个碱基的缺失而引起读框移位(阅读框的偏移)，从第306处以后的氨基酸大幅地发生变化，另外，与越光相比在更靠前的位置出现终止密码子，因此，在第358处停止翻译。该突变体(#7-3-6)的氨基酸序列示为序列编号6。
另外，#3-6-4中有碱基的插入，因此，在第341～352处11个氨基酸(TGTYAGQYIMQ)被置换为17个氨基酸(RPVTMGVSLVCHAHLIG)。需要说明的是，即使是插入，在阅读框中也不发生偏移，其以后的氨基酸与越光完全相同。该突变体(#3-6-4)的氨基酸序列示为序列编号5。
进而，在#7-3-6与#3-6-4的基因组DNA上的碱基的缺失和插入位置示意性地示于图5中。#7-3-6的第9外显子内的第138处的胞嘧啶(C)发生缺失。在#3-6-4的第10外显子内的第73处的腺嘌呤(A)以后发现433bp的碱基的插入。在该433bp的碱基中，50bp被插入在外显子内，其余的383bp被插入在内含子内。所插入的433bp是被称作mPingA1的转座子(转位因子)。
另外，以导管液的Cd浓度为指标而筛选出的4种低Cd突变体(#3-5-20,#6-4-10,#11-6-12,#12-3-5)全部在与#3-6-4相同的位置发现相同碱基数的插入，若将突变位置的基于PCR的DNA扩增片段长度加以比较，则这些个体与#3-6-4相同。上述各突变体与越光的基于PCR的DNA扩增片段长度的差异示于图6中。
以这些结果为基础，由于预想了OsNramp5基因所编码的蛋白质控制了Cd吸收，所以将来自越光的OsNramp5基因命名为TRECA (Transporter regulating cadmiumabsorption)基因，将其突变型作为treca-1(#3-6-4由来)基因、treca-2(#7-3-6由来)基因、treca-3(#7-2-13由来)基因。
＜实施例4－使用酵母的功能分析＞
将越光及其突变体(#3-6-4)的cDNA作为模版，使用引物组CNPorf5(5′‐CACCATGGAGATTGAGAGAGAGAGCAGTG-3′：序列编号9)和CNPrt3(5′‐ACACCCTTGTCGATCGATCGATCTG-3′：序列编号10)(Operon公司制)进行PCR，将包含全长ORF的扩增片段克隆进pENTR/D-TOPO。
进而，通过LR反应分别插入多克隆位点gateway化后的酵母表达用载体pDR195(Rentsch等,1995)中。将各构建物(constract)和pDR195(载体对照)通过醋酸锂而分别导入到(1)Cd感受性突变株Δycf1(MATalpha trp1-63leu2-3,112gcn4-101his3-609ura3-52ycf1::TRP1)，(2)Mn要求性突变株Δsmf1(MATa,his3Δ1；leu2Δ0；met15Δ0；ura3Δ0；YOL122c::kanMX4)以及(3)Fe要求性突变株Δfet3fet4(MATa/MATalpha ade2/+can1/can1his3/his3leu2/leu2trp1/trp1ura3/ura3fet3-2::His3/fet3–2::HIS3fet4-1::LEU2/fet4-1::LEU2)中。
根据各酵母的氨基酸要求性，在SD液体培养基中进行培养后，在通常的SD琼脂培养基(-Cd,+Mn,+Fe)，或者(1)包含10μM CdCl2的(+Cd)、(2)包含10mM EGTA且不包含Mn的(-Mn)、(3)包含10μMBPDS的(-Fe)的、SD琼脂培养基中制作出稀释系列(OD600＝1、0.1、0.01、0.001)，进行斑点试验，在30℃下培养3天。将TRECA基因和treca-1基因分别导入到Cd感受性株(Δycf1)、Mn要求性突变株(Δsmf1)、Fe要求性突变株(Δfet3fet4)中，根据进行±Cd、±Mn、±Fe处理时的各突变酵母株的增殖程度，在图7中显示出2个基因所编码的蛋白质的重金属输送能力的差异。
根据上述图7，在导入了TRECA基因的株中，与载体对照(VC)相比，增殖少(特别是OD600＝0.1)，由此Cd感受性增大。这意味着酵母内吸收Cd，因Cd毒性的影响而无法增殖。另一方面，在导入了treca-1基因的Δycf1株中，Cd吸收能力发生缺失，因此，基于Cd所致的毒性的影响小，与VC显示出大致相同的增殖。Δsmf1是Mn输送能力发生缺失的酵母株。在导入了TRECA基因的株中，特别是在-Mn处理区发现了比VC高的增殖(OD600＝0.01)。另一方面，在treca-1基因导入株中，是与VC相同程度的增殖。认为这是由于通过TRECA基因的导入而使Mn吸收恢复的缘故。Δfet3fet4是铁输送能发生了缺失的酵母株。在+Fe或-Fe处理区中，均在TRECA基因导入酵母株中显示出比VC高的增殖。另一方面，在treca-1基因导入株中为与VC相同的增殖程度。由此可知，来自越光的TRECA蛋白带有输送Cd、Mn和Fe的功能且来自#3-6-4的treca-1蛋白丧失了对于Cd、Mn和Fe的输送活性。
＜实施例5－原因基因的局部存在性确认＞
以越光及其突变体(#3-6-4)的cDNA为模板，使用引物组CNPorf5(5′-CACCATGGAGATTGAGAGAGAGAGCAGTG-3′：序列编号9)和CNPorf3(5′-CCTTGGGAGCGGGATGTCGGCCAGG-3′：序列编号10)(Operon公司制)，进行PCR而使ORF区域扩增。
使该扩增片段克隆进pENTR/D-TOPO(invtrogen公司制)，获得各入门克隆。通过使用了LR clonase II(invtrogen公司制)的LR反应，而在pH7FWG2、0(Karimi等,2002)中插入各ORF。将所制作的构建物通过粒子轰击法而导入到洋葱表皮细胞中，在暗处静置。5～6小时后，使用LSM5Pascal laser-scanning confocal microscope(Carl Zeiss)来观察荧光。结果示于图8。
根据图8，使在来自越光的TRECA蛋白和来自#3-6-4株的treca-1蛋白的C末端侧连结有GFP的融合蛋白在洋葱表皮细胞中进行表达，观察GFP的绿色荧光，由此考察TRECA蛋白和treca-1蛋白的细胞内的局部存在。任一蛋白质均局部存在于细胞膜中。另外，两者的荧光强度方面也没有发现大的差异。
＜实施例6－基于DNA标记的低Cd水稻的判别方法＞
对于上述突变体(#3-5-20)、突变体(#3-6-4)、越光、及突变体(#3-6-4)与越光的F1个体，从它们的根或叶中提取基因组DNA，利用分光光度计(Thermo Fisher Scientific公司制、商品名：ナノドロップNanoDrop1000)来测定浓度。以实施例3的碱基序列数据为基础，设计出加入插入了突变的位置的引物组[Os7g2572_F3711g(5’-TTCAGAACGTGCTGGGCAAGTCG-3’：序列编号11)、Os7g2572_R3951g(5’-ACGGATTAACAAATTAATTATGTGGCAG-3’：序列编号12)]。使用KAPA2G Fast PCR Kit(快速PCR试剂盒)(KAPA BIOSYSTEMS公司制)，以基因组DNA为模版，进行基于PCR的DNA片段的扩增。使所得的PCR产物载于3％琼脂糖凝胶上，进行电泳。结果示于图9。
根据图9，越光在240bp处发现了DNA的扩增片段，而#3-5-20与#3-6-4在约700bp附近发现了DNA的扩增片段，能够将越光与存在插入的突变体加以区别。另外，还能够判别#3-6-4×越光的F1杂合个体(ヘテロ個体)，可作为共显性标记(共優性マーカー)而加以活用。
对于上述突变体(#7-3-6)和越光、以及突变体(#7-3-6)与越光的F1个体来说，利用前述同样的方法来提取基因组DNA，设计夹入一个碱基发生了缺失的位置的引物组[Os7g2572_F2976g(5'-TATATTCAGCCTGGGCAGATCGAG-3'：序列编号7)、Os7g2572_R3815g(5'-TGATGTACTGTCCAGCGTATGTGC-3'：序列编号8)，使用KAPA2G Fast PCR Kit来通过PCR反应使DNA片段扩增。将所得的PCR产物用限制性内切酶的FastDigest FspI (ThermoScientific公司制)切断。使切断后PCR产物载于1％琼脂糖凝胶上，进行电泳。另外，为了比较，将未用FspI进行处理的PCR产物也进行电泳。将结果示于图10。在图10中，分别用M表示尺寸标记(Size marker)、用LK2表示#7-3-6，用WT表示越光(Koshihikari)，用F1表示7-3-6×越光(#7-3-6×Koshihikari)。
在未用FspI进行处理的情况下，#7-3-6、越光、F1个体均在839bp处发现扩增片段，3者的带型没有差别。越光的DNA片段没有可被FspI切断的碱基的识别位点，因此，与未处理的带型是相同的。另一方面，#7-3-6由于一个碱基缺失而产生能够被FspI切断的新的识别位点，839bp别切断为419bp和420bp。切断后的尺寸长度基本是相同程度的，因此，2根带相互重合，在凝胶上显现为一根带。#7-3-6×越光的F1异型个体也可通过同样的方法进行判别。
产业实用性
根据本发明，可提供实用性高的划时代的低Cd吸收品种。进而，通过将本发明的低Cd吸收品种作为母本，能够在不进行基因重组操作的情况下育成新型的低Cd吸收水稻品种，另外，通过使用本发明的DNA标记，从而能够高效地筛选出低Cd吸收水稻品种。

Claims (8)

1.一种基因，其以由序列编号3所表示的DNA碱基序列构成且编码抑制镉吸收的突变转运蛋白。
2.一种基因，其以由序列编号4所表示的DNA碱基序列构成且编码抑制镉吸收的突变转运蛋白。
3.一种突变转运蛋白，其以序列编号5中记载的氨基酸序列构成且抑制镉吸收。
4.一种突变转运蛋白，其以下述(P)的氨基酸序列构成且抑制镉吸收：
(P)序列编号6中记载的氨基酸序列。
5.一种重组载体，其包含权利要求1或2所述的DNA。
6.一种转化体，其包含权利要求1或2所述的DNA。
7.一种转化体，其通过使用权利要求5所述的重组载体而得。
8.一种镉吸收抑制水稻的鉴定方法，其包括对水稻是否包含权利要求1或2所述的DNA碱基序列进行鉴定的步骤。
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