CN112029777B

CN112029777B - 一种降低水稻结实率的OsALIS4基因及其编码得到的蛋白和应用

Info

Publication number: CN112029777B
Application number: CN202010954719.4A
Authority: CN
Inventors: 樊世军; 胥磊; 梁潆俪; 高鹏; 何凯; 袁华; 涂斌; 马炳田; 王玉平; 钦鹏; 李仕贵
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2020-09-11
Filing date: 2020-09-11
Publication date: 2022-02-18
Anticipated expiration: 2040-09-11
Also published as: CN112029777A

Abstract

本发明公开了一种降低水稻结实率的OsALIS4基因及其编码得到的蛋白和应用，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明为阐明结实率这一复杂的农艺性状相关的分子机制提供了新的思路，为水稻育种提供了潜在的新基因资源。

Description

一种降低水稻结实率的OsALIS4基因及其编码得到的蛋白和应用

技术领域

本发明属于生物技术和育种领域，尤其涉及一种降低水稻结实率的OsALIS4基因及其编码得到的蛋白和应用。

背景技术

水稻是重要的粮食作物，是全世界一半人口的主粮。水稻产量主要受到每穗粒数、单株有效穗、千粒重和结实率几大因素的影响。过去十几年中，水稻穗部发育和粒重的研究已经取得了卓越的进展，然而，作为重要的产量构成要素，结实率的研究仍亟待推进。鉴于此，发掘和克隆更多结实率相关基因并解析其遗传机制，对水稻遗传育种具有十分重要的现实意义。

现有研究表明，结实率是十分复杂的农艺性状，许多原因会导致小穗不育，包括花粉粒缺陷、胚囊异常和生殖期温度异常等。目前已报道与水稻结实相关的基因较少，如类驱动蛋白PSS1，通过控制雄性减数分裂的染色体动力学，在调节水稻结实中起重要作用；李双成等报道的RING型E3泛素连接酶基因PTB1，通过调控花粉管的伸长来调节结实率；OsCNGC13，一种环状核苷酸门控通道蛋白，通过影响钙离子分布和浓度调节花粉管伸长并最终影响水稻结实。尽管如此，关于影响水稻结实的各个因素仍旧十分不明确。

CDC50家族(拟南芥中命名为ALIS)是生物体中一类极度保守的基因，该类基因在多个物种中被证明可作为分子伴侣协助另一类磷脂翻转酶实现跨膜转运。但不同物种中研究均表明，该类基因的保守性决定了他们的之间高度的功能冗余性，目前鲜有关于该类基因单独控制某类生物学功能的报道。

发明内容

本发明的目的在于：针对上述现有技术中存在的不足，提供一种降低水稻结实率的OsALIS4基因及其编码得到的蛋白和应用，为进一步水稻产量育种研究和利用奠定理论基础。

本发明采用的技术方案如下：

OsALIS4基因在降低水稻结实率中的应用，基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述基因在水稻种质资源改良中的应用。

一种含有上述基因的表达载体。

一种降低水稻结实率的制剂，包括上述的蛋白。

SEQ ID NO.1

ATGGATCCTTTGGAATCTGAAGGTGGCTCACAGAAATCCAACAATAAGCCCAAATATTCTAAGTTTACGCAACAGGAGCTTCCAGCATGCAAGCCACTACTAACTCCTGGAATTGTGGTTGCTACCTTCTTGCTGATTGGTATCATATTTGTCCCAATTGGGCTCGCGTCTCTATCTGCATCGCAAGAGATCGTCGAACTGGTGGATCGATATGACACAAATTGTGTGTCCACGCTTGACAAGGTTGGGTTCATTCAGAACACCGATACTGACAAGACATGCACAAGAACACTGACTGTGCCTAAACATATGAAGAGCCCAATCCAGATATATTACCAGATCGGCGACTTCTATCAAAACCATCGACGGTATGTGAAAAGTCGAAGTGATAAACAATTGCGGTATAAGAATGCTGTGCACTTGACAAAGGATTGTGATCCTGAAGGTAATACTGTTGATGGTGCTCCAATTATTCCATGTGGCCTTATTGCTTGGAGCTTGTTCAATGATACATATACAATTTCGGTGAACAAGAAGGCCATTGAAGTGAATAAAAAGGATATAGCTTGGAAGAGTGACAAGACCGATAAATTTGGCAGTGATATTTACCCAAGTAATTTTCAGAAGGGCAGTCTAATAGGCGGTGCTAAACTAAATGAGAGCATACCTTTAAGTGAGCAAGAAGACCTCATTGTTTGGATGAGAACCGCTGCCCTCCCAACTTTCAGAAAGCTTTATGGCAGAATCGAGACAGATATTATGGCAAATGATCAATTAACAGTGGTTATACAGAATAACTATAACACATATAGTTTTGGAGGGTCTAAAGCGTTGGTCCTTTCAACTACTTCTTGGATTGGAGGCAAAAACAACTTCATTGGTGTTGCATATCTGACTATCGGAGGCCTATGCATTTTCCTTGCAGTGGGCTTCGTAGTTCTTCTCTACATGGTTAAACCAAGGACTCTTGGAGACCCCTCGTACTTGTCATGGAATAGAGATACTCCAGACCGTCCAAACTAA

SEQ ID NO.2

MDPLESEGGSQKSNNKPKYSKFTQQELPACKPLLTPGIVVATFLLIGIIFVPIGLASLSASQEIVELVDRYDTNCVSTLDKVGFIQNTDTDKTCTRTLTVPKHMKSPIQIYYQIGDFYQNHRRYVKSRSDKQLRYKNAVHLTKDCDPEGNTVDGAPIIPCGLIAWSLFNDTYTISVNKKAIEVNKKDIAWKSDKTDKFGSDIYPSNFQKGSLIGGAKLNESIPLSEQEDLIVWMRTAALPTFRKLYGRIETDIMANDQLTVVIQNNYNTYSFGGSKALVLSTTSWIGGKNNFIGVAYLTIGGLCIFLAVGFVVLLYMVKPRTLGDPSYLSWNRDTPDRPN

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

1、本发明中，从反向遗传学的角度在水稻中首次解析了CDC50基因OsALIS4的生物学功能，并通过转基因实验证明该基因参与调控水稻结实率表型，为进一步水稻产量育种研究和利用奠定理论基础；

2、本发明提供一种新的控制水稻结实性状的蛋白质，并提供编码上述蛋白质的基因，该基因影响水稻结实，且其功能在籼稻和粳稻两个背景下均高度保守；同时还提供含有敲除上述基因的表达载体；

3、本发明通过物种间序列同源比对方式获得水稻中可能的功能保守新基因，并运用CRISPR/Cas9系统在籼稻和粳稻背景下分别将其敲除，相比传统突变体的研究方式，本发明提供了新的结实率相关基因研究思路，为水稻结实的分子机理提供了很好的研究基础；

4、本发明打破了多个物种中对于CDC50担任分子伴侣且功能高度冗余的固有“角色认知”，发掘了该类基因在水稻中独有的生物学功能；

5、本发明提供该基因在水稻结实调控途径研究中的用途，为阐明结实率这一复杂的农艺性状相关的分子机制提供了新的思路，为水稻育种提供了潜在的新基因资源。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例中不同物种中CDC50家族蛋白进化树分析；

图2为实施例中OsALIS4基因敲除靶位点示意图；

图3为实施例中OsALIS4基因编辑载体示意图；

图4为实施例中粳稻背景下OsALIS4基因不同敲除株系编辑结果；

图5为实施例中粳稻背景下OsALIS4基因敲除后结实率表型；

图6为实施例中籼稻背景下OsALIS4基因不同敲除株系编辑结果；

图7为实施例中籼稻背景下OsALIS4基因敲除后结实率表型。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。

因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，术语“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例

本发明较佳的实施例提供OsALIS4基因在降低水稻结实率中的应用，具体包括：

1.同源基因序列获得及进化树制作

蛋白质序列酵母、拟南芥、人类均来源于NCBI，水稻来源于Rice GenomeAnnotation Project，线虫来源于Worm Base。其中，获得水稻蛋白序列的代号如下：OsALIS1(LOC_Os09g38768),OsALIS2(LOC_Os02g07750),OsALIS3(LOC_Os06g45430),OsALIS4(LOC_Os03g02830),OsALIS5(LOC_Os05g45370),OsALIS6(LOC_Os03g57170)。使用Clustal Omega比对并用MEGA5.1制作进化树。序列分析结果如图1所示，水稻中CDS50基因共6个，依照拟南芥命名方式，分别将其命名为OsALIS1-6,其中OsALIS1-5均在同一个进化分枝上，然后对其中的OsALIS4展开研究。

2.基因编辑位点设计

本发明在OsALIS4第一外显子起始位置选择含有AGG作为识别位点的ATGGATCCTTTGGAATCTGA作为OsALIS4的敲除靶位点(图2)，期望获得功能丧失型转基因植株以明确OsALIS4基因功能。

3.CRISPR/Cas9载体构建

先将10uM靶位点前后引物各5ul混合后99℃退火5min获得含双链敲除位点的序列，然后利用Bas1(NEB公司)边酶切边连接(37℃)，将靶位点序列连至中间载体pYLsgRNA-OsU6a上，随后利用通用扩增引物5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’(UF)和5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’(gR-R)分别与靶位点后引物和前引物结合使用，经过PCR扩增从中间载体pYLsgRNA-OsU6a上获取含有靶位点的一大一小两个片段，然后经过一次overlapping将两个片段融合，最后再次利用Bas1(NEB公司)边酶切边连接(37℃)3个小时将融合片段连接至终载体pylcrispr/Cas9P35S-N(15011bp)，构建成功的终载体如图3所示。

4.大肠杆菌转化

将大肠杆菌细胞T1感受态(全式金)从-80℃取出后置于冰上解冻，待细胞溶解后迅速加入上一步连接产物，用移液枪轻轻混匀后冰上静置30分钟，随后42℃热激30秒，再次冰上静置2分钟，接着向转化产物中加入10倍体积LB无抗培养液，37℃200rpm培养50分钟取出，4000rpm离心后去掉大部分上清，剩余液体(约100ul)将菌体重悬后涂板(LB+卡那霉素抗性)，37℃过夜静置培养后挑取单克隆菌落扩大培养3ml(LB+卡那霉素抗性)，通用引物(SP-L1:5’-GCGGTGTCATCTATGTTACTA-3’)测序验证靶位点序列获得阳性克隆；

5.农杆菌转化

将农杆菌EHA105细胞感受态(化转法制备)从-80℃取出后置于冰上解冻，加入阳性克隆质粒2ul，轻轻混匀后置于冰上30分钟，随后液氮中冻2分钟，迅速取出置于37℃金属浴中将细胞溶解2分钟，接着向转化产物中加入10倍体积LB无抗培养液，28℃250rpm培养2-3小时取出，5000rpm离心后去掉大部分上清，剩余液体(约100ul)将菌体重悬后涂板(LB+利福平+卡那霉素)，28℃过夜静置培养后挑取单克隆菌落，用G418引物检测获得阳性克隆并扩大培养3ml(LB+利福平+卡那霉素)待用。

6.水稻遗传转化

取蜀恢527(R527)和日本晴种子各500颗左右，无菌水和50％次氯酸钠分别清洗后滤纸吸干水分，用NMB培养基诱导愈伤发生；接着将备用的农杆菌菌液扩大培养50ml，5000rpm收集菌体后用加入AS(乙酰丁香酮)的AAM液体培养基重悬菌体，然后将挑选好的愈伤浸润在重悬的菌体环境下约30分钟，后吸去菌体，愈伤在培养基上继续培养2天；培养后的愈伤无菌水和含头孢霉素的无菌水分别清洗后，置于选择培养基上约三周；最后分别用分化培养基继续诱导愈伤生根，待苗高约10cm时，可在室内炼苗准备后续检测和移栽。

7.1粳稻日本晴背景下OsALIS4基因编辑

1)转基因苗检测

农杆菌侵染转化共获得23株苗子，首先用G418检测引物检测载体转化情况，接着用跨靶位点的扩增引物U683(5’-TTTGATTCTGATGGCGTTGA-3’)+U684(5’-CAACGCCATCAGAATCAAAA-3’)将转化阳性单株中序列扩增后送有康测序公司测序，结果如图4所示，获得序列经过比对分析显示共获得2种敲除方式的转基因植株，蛋白质序列分析的结果显示两种敲除方式均将OsALIS4蛋白翻译提前终止。

2)表型调查

在T0代将植株根据不同敲除方式归类后，初步分析其农艺性状，结果显示，转基因植株在株高、有效穗、千粒重等各个农艺性状均无明显变化，但多个阳性植株均表现出结实变差表型。

3)结实率分析

在T1代种植中，将不同株系分3次田间实验重复种植，每个重复种植2行，首先测序检测确认靶位点存在稳定突变。考察农艺性状时，每个重复去掉边行和杂株，选择5-10株稳定株系，考察单株结实情况，并进行统计学分析。结果显示，稳定株系的敲除后代确实表现出结实率降低(图5)。

7.2籼稻R527背景下OsALIS4基因编辑

1)转基因苗检测

农杆菌侵染转化共获得24株苗子，同样分别用G418检测引物检测载体转化情况，接着用跨靶位点的扩增引物U683+684将转化阳性单株中序列扩增后送有康测序公司测序，结果如图6所示，最终序列比对结果显示共获得3种敲除方式的转基因植株，蛋白质序列分析的结果显示两种敲除方式均将OsALIS4蛋白翻译提前终止。

2)表型调查

在T0代将植株根据不同敲除方式归类后，初步分析其农艺性状，结果显示，转基因植株在株高、有效穗、千粒重等各个农艺性状均无明显变化，但多个阳性植株均表现出结实变差表型，这一结果与日本晴背景敲除相一致。

3)结实率分析

在T1代种植中，继续采用日本晴背景的播种方式，分小区和实验重复考察单株结实情况，并进行统计学分析。结果显示，稳定株系的敲除后代确实表现出结实率降低(图7)。由此表明，OsALIS4确实影响着水稻结实，且这一表型在籼稻和粳稻中均功能保守。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种降低水稻结实率的OsALIS4基因及其编码得到的蛋白和应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1023

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggatcctt tggaatctga aggtggctca cagaaatcca acaataagcc caaatattct 60

aagtttacgc aacaggagct tccagcatgc aagccactac taactcctgg aattgtggtt 120

gctaccttct tgctgattgg tatcatattt gtcccaattg ggctcgcgtc tctatctgca 180

tcgcaagaga tcgtcgaact ggtggatcga tatgacacaa attgtgtgtc cacgcttgac 240

aaggttgggt tcattcagaa caccgatact gacaagacat gcacaagaac actgactgtg 300

cctaaacata tgaagagccc aatccagata tattaccaga tcggcgactt ctatcaaaac 360

catcgacggt atgtgaaaag tcgaagtgat aaacaattgc ggtataagaa tgctgtgcac 420

ttgacaaagg attgtgatcc tgaaggtaat actgttgatg gtgctccaat tattccatgt 480

ggccttattg cttggagctt gttcaatgat acatatacaa tttcggtgaa caagaaggcc 540

attgaagtga ataaaaagga tatagcttgg aagagtgaca agaccgataa atttggcagt 600

gatatttacc caagtaattt tcagaagggc agtctaatag gcggtgctaa actaaatgag 660

agcatacctt taagtgagca agaagacctc attgtttgga tgagaaccgc tgccctccca 720

actttcagaa agctttatgg cagaatcgag acagatatta tggcaaatga tcaattaaca 780

gtggttatac agaataacta taacacatat agttttggag ggtctaaagc gttggtcctt 840

tcaactactt cttggattgg aggcaaaaac aacttcattg gtgttgcata tctgactatc 900

ggaggcctat gcattttcct tgcagtgggc ttcgtagttc ttctctacat ggttaaacca 960

aggactcttg gagacccctc gtacttgtca tggaatagag atactccaga ccgtccaaac 1020

taa 1023

<210> 2

<211> 340

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Asp Pro Leu Glu Ser Glu Gly Gly Ser Gln Lys Ser Asn Asn Lys

1 5 10 15

Pro Lys Tyr Ser Lys Phe Thr Gln Gln Glu Leu Pro Ala Cys Lys Pro

20 25 30

Leu Leu Thr Pro Gly Ile Val Val Ala Thr Phe Leu Leu Ile Gly Ile

35 40 45

Ile Phe Val Pro Ile Gly Leu Ala Ser Leu Ser Ala Ser Gln Glu Ile

50 55 60

Val Glu Leu Val Asp Arg Tyr Asp Thr Asn Cys Val Ser Thr Leu Asp

65 70 75 80

Lys Val Gly Phe Ile Gln Asn Thr Asp Thr Asp Lys Thr Cys Thr Arg

85 90 95

Thr Leu Thr Val Pro Lys His Met Lys Ser Pro Ile Gln Ile Tyr Tyr

100 105 110

Gln Ile Gly Asp Phe Tyr Gln Asn His Arg Arg Tyr Val Lys Ser Arg

115 120 125

Ser Asp Lys Gln Leu Arg Tyr Lys Asn Ala Val His Leu Thr Lys Asp

130 135 140

Cys Asp Pro Glu Gly Asn Thr Val Asp Gly Ala Pro Ile Ile Pro Cys

145 150 155 160

Gly Leu Ile Ala Trp Ser Leu Phe Asn Asp Thr Tyr Thr Ile Ser Val

165 170 175

Asn Lys Lys Ala Ile Glu Val Asn Lys Lys Asp Ile Ala Trp Lys Ser

180 185 190

Asp Lys Thr Asp Lys Phe Gly Ser Asp Ile Tyr Pro Ser Asn Phe Gln

195 200 205

Lys Gly Ser Leu Ile Gly Gly Ala Lys Leu Asn Glu Ser Ile Pro Leu

210 215 220

Ser Glu Gln Glu Asp Leu Ile Val Trp Met Arg Thr Ala Ala Leu Pro

225 230 235 240

Thr Phe Arg Lys Leu Tyr Gly Arg Ile Glu Thr Asp Ile Met Ala Asn

245 250 255

Asp Gln Leu Thr Val Val Ile Gln Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Ser Phe

260 265 270

Gly Gly Ser Lys Ala Leu Val Leu Ser Thr Thr Ser Trp Ile Gly Gly

275 280 285

Lys Asn Asn Phe Ile Gly Val Ala Tyr Leu Thr Ile Gly Gly Leu Cys

290 295 300

Ile Phe Leu Ala Val Gly Phe Val Val Leu Leu Tyr Met Val Lys Pro

305 310 315 320

Arg Thr Leu Gly Asp Pro Ser Tyr Leu Ser Trp Asn Arg Asp Thr Pro

325 330 335

Asp Arg Pro Asn

340

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctccgtttta cctgtggaat cg 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cggaggaaaa ttccatccac 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcggtgtcat ctatgttact a 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tttgattctg atggcgttga 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caacgccatc agaatcaaaa 20

Claims

1.OsALIS4基因在降低水稻结实率中的应用，其特征在于，所述OsALIS4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。