CN109207484A

CN109207484A - 一种烟草尼古丁含量调控基因iaa27及其克隆方法与应用

Info

Publication number: CN109207484A
Application number: CN201811090571.3A
Authority: CN
Inventors: 白戈; 逄涛; 谢贺; 李勇; 杨大海; 姚恒; 张谊寒; 肖炳光; 李永平
Original assignee: Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences
Current assignee: Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences
Priority date: 2018-09-19
Filing date: 2018-09-19
Publication date: 2019-01-15

Abstract

本发明公开了一种烟草尼古丁含量调控基因IAA27及其克隆方法与应用；所述的烟草尼古丁含量调控基因IAA27核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；克隆方法包括烟草叶片cDNA合成：提取烟草叶片总RNA，反转录得到第一链cDNA；IAA27基因的PCR扩增：以烟草叶片cDNA为模板，根据IAA27基因序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序。应用为所述的烟草尼古丁含量调控基因IAA27在获得高尼古丁含量的转基因烟草植株中的应用。本发明在烟草植株内抑制IAA27基因的表达，可以明显提高烟叶中尼古丁的含量，在实际生产中拥有广阔的应用前景。

Description

一种烟草尼古丁含量调控基因IAA27及其克隆方法与应用

技术领域

本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种烟草尼古丁含量调控基因IAA27及其克隆方法与应用。

背景技术

研究烟草尼古丁的代谢调控是非常有意义的一项工作，通过基因调控可以提供不同尼古丁含量的烟草品种，为烟草商业生产个性化烟碱烟草产品提供原材料。尼古丁对人体有很强的生理刺激作用，是烟草商业性使用的物质基础。许多世界顶级烟草公司如菲利普莫里斯，帝国烟草、日本烟草、英美烟草等公司都投入巨资对烟草尼古丁的代谢途径、调控机制进行研究。

尼古丁是一种吡啶类生物碱，主要存在于茄科烟草属(Nicotiana)植物中，是烟草体内的一种重要的次生代谢产物。烟草尼古丁的合成和转运受到多个因素的调控，目前已经鉴别和克隆出来了一些尼古丁合成途径中的关键基因，如QPT、PMT、MPO、JAZ、MYC2a等。

从分子生物学角度对尼古丁的合成代谢途径研究尚未完全透彻。通过氯离子通道调控尼古丁合成基因，从而影响尼古丁含量的研究未见报道。尼古丁调控基因对于烟草商业生产至关重要，目前大多数的烟碱合成基因相关专利都掌握在国外烟草公司手中。因此，研究尼古丁合成途径相关调控基因对中国烟草企业改良烟草产品中尼古丁含量具有重要意义。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种烟草尼古丁含量调控基因IAA27；第二目的在于提供所述的烟草尼古丁含量调控基因IAA27的克隆方法；第三目的在于提供所述的烟草尼古丁含量调控基因IAA27的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的烟草尼古丁含量调控基因IAA27的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：

A、烟草叶片cDNA合成：提取烟草叶片总RNA，反转录得到第一链cDNA；

B、IAA27基因的PCR扩增：以烟草叶片cDNA为模板，根据IAA27基因序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序。

本发明的第三目的是这样实现的，所述的烟草尼古丁含量调控基因IAA27在获得高尼古丁含量的转基因烟草植株中的应用，即在烟草植株体内抑制所述IAA27基因的表达，可提高烟草中尼古丁的含量。

本发明还提供一种所述烟草尼古丁含量调控基因IAA27的重组载体。

本发明还提供提供一种所述烟草尼古丁含量调控基因IAA27的表达盒。

本发明还提供一种所述烟草尼古丁含量调控基因IAA27的转基因细胞系。

本发明还提供一种所述烟草尼古丁含量调控基因IAA27的重组菌。

本发明所述的烟草尼古丁含量调控基因IAA27编码一种调控烟草尼古丁含量的多肽，所述多肽包含的氨基酸序列如SEQ ID：No.2所示。所述多肽还可能为由SEQ ID No：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成，且具有调控烟草尼古丁含量的衍生多肽。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

本发明所述烟草尼古丁含量调控基因IAA27包含的核苷酸序列如SEQ ID：No.1所示。或者在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；或者与序列表中SEQ ID No：1限定的DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

本发明所述烟草尼古丁含量调控基因IAA27的应用为在烟草植株体内抑制所述IAA27基因的表达，可提高烟草中尼古丁的含量。可通过由RNA介导的多种方法抑制IAA27基因的表达，如：植物病毒载体介导基因沉默的方法、农杆菌介导转化RNAi干扰载体、优化修改基因编码匡、优化基因启动子等方法。本发明所述的抑制基因表达的方法并不限于上述几种方法，只要能抑制IAA27表达即可。

本发明的IAA27基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、荧光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜蓿等。携带有本发明Ribosomal L4/L1基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株。

含有本发明所述IAA27基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、和重组菌等基因工程产品均属于本发明的保护范围。

本发明的烟草尼古丁调控相关蛋白及其编码基因为农作物尤其是烟草尼古丁含量育种提供基因与技术的支持。

本发明中，在烟草植株内抑制烟草内源基因IAA27的表达，会使烟草烟叶的烟碱含量明显升高，在植物尼古丁育种领域具有广阔的应用前景，其经济效益潜力巨大。

附图说明

图1 IAA27的PCR产物电泳图；

图中，M-分子量标记；1- PCR产物；

图2 中间载体pdonr-zeo图；

图3 IAA27基因植物RNAi干扰载体pHellsgate12图；

图4 转IAA27基因RNAi干扰载体的烟草株系基因表达水平柱状图；

图中，K326-野生型对照；RNAi-1和RNAi-2为转基因烟株；

图5 IAA27基因RNAi干扰烟草植株的尼古丁含量；

图中，K326-野生型对照；RNAi-1和RNAi-2为转基因烟株。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的烟草尼古丁含量调控基因IAA27的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

所述的烟草尼古丁含量调控基因IAA27编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明所述的烟草尼古丁含量调控基因IAA27的克隆方法，包括以下步骤：

B步骤中所述的引物为：

正向引物：5’- ATGTCTATACCATTAGAACATG -3’

反向引物：5’- TCAGTTGTACATACACTCAAC -3’。

B步骤中所述的PCR反应体系和反应条件为：

。

B步骤中所述的测序的具体操作是将扩增获得的PCR产物在0.8%的琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，采用Qiagen公司PCR产物纯化试剂盒，按照产品说明回收纯化所述的PCR产物，并送Invitrogen测序，验证序列结果。

本发明所述的烟草尼古丁含量调控基因IAA27的应用为所述的烟草尼古丁含量调控基因IAA27在获得高尼古丁含量的转基因烟草植株中的应用。

本发明还提供一种含有所述的烟草尼古丁含量调控基因IAA27的重组载体。

本发明还提供一种含有所述的烟草尼古丁含量调控基因IAA27的表达盒。

本发明还提供一种含有所述的烟草尼古丁含量调控基因IAA27的转基因细胞系或重组菌。

下面结合具体实施案例对本发明进行进一步的说明：

实施例中所有的植物组织材料取自烤烟（Nicotiania tabacum)品种‘K326’及RNAi干扰IAA27基因表达的K326转基因植株。烟草植株的生长和发育阶段都是在人工气候室中，并保持生长温度在22-25℃之间，以尽量减少外界环境因素对烟草尼古丁合成过程中的影响。实验选取的烟草材料为旺长期，发育表型相近的非转基因烟株及转基因烟株。采取非转基因烟株及转基因烟株的上部、中部及下部叶片。对于另一组，对非转基因烟株及转基因烟株进行打顶处理，然后采取非转基因烟株及转基因烟株的上部、中部及下部叶片。将这些烟草材料杀青以进行尼古丁含量检验。

实施例1

克隆IAA27基因

以烟草叶片cDNA为模板，根据烟草基因组数据库信息设计引物，进行IAA27基因的PCR扩增，得到PCR扩增产物。设计引物如下所示：

正向引物：5’-ATGTCTATACCATTAGAACATG -3’；

反向引物：5’- TCAGTTGTACATACACTCAAC -3’。

PCR反应体系和扩增条件如表1所示。

表1 PCR反应体系与条件

将扩增获得的PCR产物在0.8%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶电泳结果如图1所示。电泳结束后，采用Qiagen公司PCR产物纯化试剂盒，按照产品说明回收纯化所述的PCR产物，并送Invitrogen测序，验证序列结果。

实施例2

植物RNAi载体的构建

以实施例1中IAA27全长片段为模板，用含有gateway接头序列的引物进行PCR扩增，扩增产物经PCR产物纯化后，经过BP反应插入到invitrogen公司pdonr-zeo载体（图2）中。将构建好的BP反应载体通过LR反应将IAA27片段置换到pHellsgate12 RNAi干扰载体（图3）中。

（1）gateway反应引物序列如下：

IAA27_F：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCATGTCTATACCATTAGAACATGATTATATAG-3’；

IAA27_R：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGCAATTAATGGACAAATCCCATTTTCCAG-3’。

（2）PCR反应均采用Phusion高保真聚合酶进行PCR克隆。

PCR反应体系与条件与实施例1相同。

（3）BP反应：

（a）在200 μL离心管中准备8 μL的反应体系，包括：1-7 μL的attB-PCR产物（约15 ~150 ng，质量浓度≥10 ng/μL）、1 μL 150 ng/μL的pdonr-zeo载体和适量的TE缓冲液（pH8.0），在室温下混匀；

（b）将BP Clonase™ II酶混合物在冰上静置2 min融化，轻轻震荡2次，混匀待用；

（c）向（1）准备的样品中加入2 μL的BP Clonase™ II酶混合物，轻轻地将体系混匀；

（d）将BP Clonase™ II酶混合物放回到-20°C或者-80°C保存；

（e）将反应体系放在25°C温浴1 h；

（f）向反应体系中加入1 μL的蛋白酶K溶液，轻轻震荡，然后将样品放在37°C温浴10min，以便终止BP反应；

（g）将混合液转化大肠杆菌后，取转化菌液涂在含Zeacin抗性的LB平板上，挑取菌落至含相应抗生素培养基溶液中摇菌培养，确认后提取阳性克隆的pDONR-Zeocin质粒（图2）备用。

（4）LR反应：

（a）在200 μL离心管中准备8 μL的反应物，包括：1-7 μL的获得的pDONR-Zeocin质粒（50-150 ng）、1 μL150 ng/μL的目的载体和适量的TE缓冲液（pH 8.0），在室温下混匀；

（b）将LR Clonase™ II酶混合物静置在冰上2 min融化，轻轻震荡2次以混匀；

（c）加入2 μL的LR Clonase™ II酶混合物，轻轻震荡将体系混匀；

（d）将LR Clonase™ II酶混合物放回到-20℃ 或者-80℃冰箱保存；

（e）将反应体系放在 25℃温浴反应1 h；

（f）向反应体系中加入1 μL的蛋白酶K溶液以终止LR反应，轻轻震荡后，将样品放在37℃ 静置10 min；得到pHellsgate12 RNAi干扰载体。

实施例3

农杆菌介导的烟草转化及转基因植株的鉴定

（1）冻融法转化农杆菌

将1 μg（200 ng/μL）pHellsgate12重组载体加入到100 μL感受态农杆菌LBA4404中，混匀后在冰上静置5 min，放入液氮中冷冻5 min，然后从液氮中取出，放入37℃水浴锅中水浴5 min，再在冰上静置5 min后，加入500 μL LB溶液，在28℃、充分震荡条件下恢复培养4 h，最后将菌液均匀涂抹于选择性平板培养基上，28℃下培养48 h。

(2) 叶盘法转化烟草品种K326。

具体方法如下:

(a) 无菌条件下，将烟草K326种子放入EP管中用无菌水冲洗2-3次；

(b) 于75%的酒精中浸泡30-60 s；

(c) 再用0.1%的升汞处理5min，最后用无菌水冲洗5次；

(d) 播种于MS培养基上，培养在云南烟草农业科学研究院组织培养室中，暗培养4 d,25℃光照培养20-30 d。

(e ) 待烟草苗长至3-5cm时（20-30d），取顶芽放于MS+BA 0.2 mg/L（壮芽，使其快速成长）培养基上，继代培养。

(f) 继代培养14天后（有小叶片即可），取叶片，大小1cm×1cm，切去叶柄，叶片表面及叶边缘划伤，放入MS+ BA1.0mg/L pH 6.0-6.5的预培养培养基上，正面朝下紧贴培养基放置，于黑暗条件下预培养2-3 d。

(g) 然后取出预培养的叶片或茎段，放入农杆菌侵染液中进行侵染。侵染前一天晚上，摇菌农杆菌2瓶。将2 mL离心管装满菌液，4000 r/min离心5min，用悬菌液清洗两次。以1:10比例（10 mL悬菌液放1管1.5 mL菌体）放入悬菌液，加入As 25 mg/L（40 mL中加40 μL As）不断摇晃侵染液，使其与叶片及茎段切口处充分接触，10 min后，取出，放于灭过菌的干燥滤纸上吸干菌液。

其中，农杆菌侵染液的制备方法如下：

1) 取-80℃冰箱保存的已被转化的农杆菌，划平板培养，LB固体平板中加入50mg/Lspec和50mg/L Rif；

2) 挑取单菌斑到含50mg/L spec和50mg/L Rif的5mL LB液体培养基中，放入摇床中28℃、200 r/min培养过夜（12-16h）；

3) 保存菌种，750 μL菌液加入灭过菌的甘油250 μL，-80℃冰箱保存备用。

4) 摇菌，LB液体培养基10 mL加spec（所需浓度50mg/L）10 μL、Rif（所需浓度50mg/L）10 μL及菌液10 μL，28℃、200r/min过夜培养（12-16h）。

5) 当菌液浓度达到OD₆₀₀=1.5左右时，取2mL菌液加入到离心管中，4000r/min离心5min；

6) 倒掉上清液，吸1mL新的MS液体培养基，重悬农杆菌，4000 r/min离心5min。

7) 重复步骤（6）1次；

8) 用1mL的MS液体培养基重悬菌后，再加入到40mL的MS的液体培养基中（含40ul25mg/L的As），即为侵染液。放置2h以上，再侵染。

200 mL悬菌液的配制如下：

20×大量元素 10 mL

200×有机元素 1ml

200×铁盐 1mL

200×微量元素 1mL

蔗糖5.6g

(h) 将叶片及茎段放回到预培养基上，28℃黑暗条件下共培养2-3天，至叶片切口周围有微菌斑形成；

(i) 洗菌，取出共培养的烟草叶片及茎段，用添加500 mg/L Cef的无菌水冲洗5次，第一次放置于摇床摇30 min，后面每次5 min，以洗去外植体表面的农杆菌；

(j) 取出后，用滤纸吸干，转移到烟草诱芽培养基上，诱芽培养基为MS+ BA 1.0mg/L +Hyg 25mg/L + Cef 500 mg/L pH 5.8；过2周观察，如果发现不长菌，则降低Cef浓度。如果长菌，则继续保持Cef浓度。

(k) 每2周更换1次培养基，直至长出不定芽（一般情况为2周）。切下再生的小苗（1cm 左右），转入继代培养基MS+ BA 0.2-0.1mg/L+ Hyg 25mg/L + Cef 500mg/L pH 5.8；

(l) 至小苗长至2cm长时（有小芽即可），转接入生根培养基MS+ NAA 0.2-0.1mg/L上，24 士1℃、12h 光照、1500 lx 培养3周左右, 长出粗壮根系。

(m) 待根生长至2-3cm。苗高7-10cm左右时，移出三角瓶洗去根部培养基，移栽于花盆中，温室培养。

（3）得到稳定的转基因株系

采用Qiagen公司DNA提取试剂盒，提取转基因烟草幼苗的基因组DNA，设计Kan抗性基因引物进行PCR扩增，筛选阳性植株,检测到25株阳性植株。

Kan抗性基因引物为

Kan F：tctggacgaagagcatcagg

Kan R：atgaatccagaaaagcggcc

按照实施例2中所述方法提取野生型植株和25株转pHellsgate12的RNA

基因T0代植株的总RNA，进行Real time-PCR分析，内参基因为26s，分析不同株系的表达情况。选取表达量最低的2株植株（图4）。单株收取种子分别播种，用Kan抗生素筛选Tl代植株的分离情况，如此重复直至T3代获得遗传稳定的转基因株系。

IAA27 qRT-PCR引物

IAA27 _qRT_F：5’- ACTGGCCACCAAAAAGAATG -3’；

IAA27 _qRT_R：5’- TGGTGCACTGCCCAATACTA -3’。

26s内参基因引物

26s_F：5’-GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC-3’；

26s_R：5’-TCTCCCTTTAACACCAACGG-3’。

实施例4

测定烟叶中尼古丁含量

依据标准YC/T 160-2002检测中烟草材料的尼古丁含量。选取的烟草材料为旺长期，发育表型相近的非转基因烟株及转基因烟株为处理对象，以野生型烟草K326为对照。取5株非转基因烟株及转基因烟株的上部、中部及下部叶片。对于另一组，对5株非转基因烟株及转基因烟株进行打顶处理，然后采取非转基因烟株及转基因烟株的上部、中部及下部叶片。

用5%乙酸水溶液萃取烟草样品，萃取液中的总植物碱（以烟碱计）与对氨基苯磺酸和氯化氰反应，氯化氰由氰化钾和氯胺T 在线反应产生。反应产物用比色计在460nm测定。

主要仪器设备：连续流动分析仪(美国API) (德国SEAL AA3) (法国ALLIANCE)。

配置试剂：

Brij 35 溶液（聚乙氧基月桂醚）：水中加5滴22% Brij35，搅拌均匀。

缓冲溶液A：称取2.35g氯化钠(NaCl)，7.60g硼酸钠(Na₂B₄O₃·10H₂O)，用水溶解，然后转入1L容量瓶中，加入1 mL Brij 35，用蒸馏水稀释至1L。使用前用定性滤纸过滤。

缓冲溶液B：称26g磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)，10.4g柠檬酸[COH(COOH)(CH₂COOH)₂·H₂O]，7g对氨基苯磺酸(NH₂C₆H₄SO₃H)，用水溶解，然后转入1L容量瓶中，加入1 mL Brij 35，用蒸馏水稀释至1L。使用前用定性滤纸过滤。

氯胺T溶液（N-氯-4-甲基苯硫酰胺钠盐）[CH₃C₆H₄SO₂N（Na）Cl·3H₂O]：取8.65g氯胺T，溶于水中，然后转入500mL的容量瓶中，用水定容至刻度。使用前用定性滤纸过滤。

0.22 mol/L NaOH缓冲液：NaOH 8.8g，Na₂HPO₄ 26.0g，C₆H₈O₇•H₂O(一水柠檬酸)10.4g，用水溶解并定容至1000mL。

对氨基苯磺酸缓冲液：称取C₆H₇NO₃S(对氨基苯磺酸) 7g，Na₂HPO₄ 26.0g， C₆H₈O₇•H₂O(一水柠檬酸) 10.4g，用水溶解并定容至1000mL。

氯胺T：称取氯胺T 1.2g，用纯水溶解定容至100mL，用棕色试剂瓶保存。

氰化钾：KCN 0.4g，用纯水溶解定容至100mL。

NaCO₃溶液：10 g NaCO₃，蒸馏水溶解并定容至1000mL。

分析步骤：称取0.3g烟样于150mL三角瓶或塑料瓶中（精确至0.0001g）；加入50 mL5%乙酸溶液盖上塞子；在普通摇床上振荡萃取30min，转速控制170 r/min，用滤纸过滤上机。（如样品液浓度超出工作标准液的浓度范围，则应稀释）。

结果的计算与表述：

以干基计的总植物碱的含量，由下面公式得出：

式中：

C——样品液总植物碱的仪器观测值，单位为mg/mL;

V——萃取液的体积，单位为mL；

m——试料的质量，单位为mg；

W——试样的水分含量，单位为%。

以两次测定的平均值作为测定结果，结果精确至0.01%。

试验结果表明：RNAi-2株系烟碱在打顶前和打顶后都有所提高，而RNAi-1株系只有部分叶位的烟碱含量有所提高（图 5），RNAi-1株系中烟碱含量提高较少的原因可能是因为基因敲除不彻底的原因。说明IAA27基因能够影响打顶后烟草尼古丁含量。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南省烟草农业科学研究院

<120> 一种烟草尼古丁含量调控基因IAA27及其克隆方法与应用

<130> 2018

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1182

<212> DNA

<213> 烟草尼古丁含量调控基因IAA27核苷酸序列

<400> 1

atggagagag attttatggg tttgactcat catgtgaagc aagaagtcac tgaagaacct 60

atagatccag cacctctgag aagttcagca atgcagtggt cattctcgaa caacatctcg 120

actcatcctc aatacctctc tttcaagggt gctcaagagg ataggccaaa aactggtttt 180

gattctcttg catcaactgg attggtgact ataaccacaa ctgaagctgt cgactcgagt 240

catcgatcat actctggtgt cgggcagaaa aatatgatgc ttgaaaagca aggtggaaca 300

cactacatgt cgacaacttt ctctcctcat cactatgatg cacacgccat gcatcgatct 360

catggtgtca gagtgctccc agtttccaac ccagcaaatc agatttctgt atcaatgact 420

atgcctggtc ataagtcctt tgtttctcct cttggacaga atccagttgc tagccccatt 480

tcagctgttc caactaacag cgctgtcgtg ggcacaactg atttaagggg tgctccgaaa 540

actcccccag gtcctgctca gttgaccatc ttttatgctg gttccgtctg cgtttatgat 600

aatgtttcac cagagaaggc tcaagctatt atgttgcttg ctggaaatgc accacctgtt 660

acgccaagtg caacatctgc tctatctcca gttcaggcgc ccatacctaa gtcctcttct 720

gttgactctt ttgttgtaaa tcagtcccat aacacaacac ctactctccc cagccccatt 780

tctataacat cccattgtgg atctcaatct gctggagtgt ctagtaatac aaatggagta 840

actattatca aatcaattgg ggtcctacca tctccttcta ataaagcaga actttctaaa 900

ttttccagtt ccataggatc tgttcctgcc acctttgttc aatcagctgt accacaggca 960

cgcaaggcat cattggctcg gttcttggag aagcgcaaag aaagggtaat aagtgcatca 1020

ccttacgaca gctgcaagca atccccagaa tgcagcactc ttggatatgg aagcagaagt 1080

ttcgcaaaag attctttagg ctcttttcct cccccatgta atcaatttgg tcaaggagac 1140

gtgaaatgcc aacagtggca aaataatgta gacacaaggt ga 1182

<210> 2

<211> 393

<212> PRT

<213> 烟草尼古丁含量调控基因IAA27氨基酸序列

<400> 2

Met Glu Arg Asp Phe Met Gly Leu Thr His His Val Lys Gln Glu Val

1 5 10 15

Thr Glu Glu Pro Ile Asp Pro Ala Pro Leu Arg Ser Ser Ala Met Gln

20 25 30

Trp Ser Phe Ser Asn Asn Ile Ser Thr His Pro Gln Tyr Leu Ser Phe

35 40 45

Lys Gly Ala Gln Glu Asp Arg Pro Lys Thr Gly Phe Asp Ser Leu Ala

50 55 60

Ser Thr Gly Leu Val Thr Ile Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ser Ser

65 70 75 80

His Arg Ser Tyr Ser Gly Val Gly Gln Lys Asn Met Met Leu Glu Lys

85 90 95

Gln Gly Gly Thr His Tyr Met Ser Thr Thr Phe Ser Pro His His Tyr

100 105 110

Asp Ala His Ala Met His Arg Ser His Gly Val Arg Val Leu Pro Val

115 120 125

Ser Asn Pro Ala Asn Gln Ile Ser Val Ser Met Thr Met Pro Gly His

130 135 140

Lys Ser Phe Val Ser Pro Leu Gly Gln Asn Pro Val Ala Ser Pro Ile

145 150 155 160

Ser Ala Val Pro Thr Asn Ser Ala Val Val Gly Thr Thr Asp Leu Arg

165 170 175

Gly Ala Pro Lys Thr Pro Pro Gly Pro Ala Gln Leu Thr Ile Phe Tyr

180 185 190

Ala Gly Ser Val Cys Val Tyr Asp Asn Val Ser Pro Glu Lys Ala Gln

195 200 205

Ala Ile Met Leu Leu Ala Gly Asn Ala Pro Pro Val Thr Pro Ser Ala

210 215 220

Thr Ser Ala Leu Ser Pro Val Gln Ala Pro Ile Pro Lys Ser Ser Ser

225 230 235 240

Val Asp Ser Phe Val Val Asn Gln Ser His Asn Thr Thr Pro Thr Leu

245 250 255

Pro Ser Pro Ile Ser Ile Thr Ser His Cys Gly Ser Gln Ser Ala Gly

260 265 270

Val Ser Ser Asn Thr Asn Gly Val Thr Ile Ile Lys Ser Ile Gly Val

275 280 285

Leu Pro Ser Pro Ser Asn Lys Ala Glu Leu Ser Lys Phe Ser Ser Ser

290 295 300

Ile Gly Ser Val Pro Ala Thr Phe Val Gln Ser Ala Val Pro Gln Ala

305 310 315 320

Arg Lys Ala Ser Leu Ala Arg Phe Leu Glu Lys Arg Lys Glu Arg Val

325 330 335

Ile Ser Ala Ser Pro Tyr Asp Ser Cys Lys Gln Ser Pro Glu Cys Ser

340 345 350

Thr Leu Gly Tyr Gly Ser Arg Ser Phe Ala Lys Asp Ser Leu Gly Ser

355 360 365

Phe Pro Pro Pro Cys Asn Gln Phe Gly Gln Gly Asp Val Lys Cys Gln

370 375 380

Gln Trp Gln Asn Asn Val Asp Thr Arg

385 390

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 正向引物

<400> 3

atgtctatac cattagaaca tg 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 反向引物

<400> 4

tcagttgtac atacactcaa c 21

<210> 5

<211> 62

<212> DNA

<213> IAA27_F

<400> 5

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctg catgtctata ccattagaac atgattatat 60

ag 62

<210> 6

<211> 59

<212> DNA

<213> IAA27_R

<400> 6

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc gcaattaatg gacaaatccc attttccag 59

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Kan F

<400> 7

tctggacgaa gagcatcagg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Kan R

<400> 8

atgaatccag aaaagcggcc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> IAA27 _qRT_F

<400> 9

actggccacc aaaaagaatg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> IAA27 _qRT_R

<400> 10

tggtgcactg cccaatacta 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 26s_F

<400> 11

gaagaaggtc ccaagggttc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 26s_R

<400> 12

tctcccttta acaccaacgg 20

Claims

1.一种烟草尼古丁含量调控基因IAA27，其特征在于所述的烟草尼古丁含量调控基因IAA27的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的烟草尼古丁含量调控基因IAA27，其特征在于所述的烟草尼古丁含量调控基因IAA27编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种权利要求1或2所述的烟草尼古丁含量调控基因IAA27的克隆方法，其特征在于包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的烟草尼古丁含量调控基因IAA27的克隆方法，其特征在于B步骤中所述的引物为：

正向引物：5’-ATGTCTATACCATTAGAACATG -3’

反向引物：5’- TCAGTTGTACATACACTCAAC -3’。

5.根据权利要求3所述的烟草尼古丁含量调控基因IAA27的克隆方法，其特征在于B步骤中所述的PCR反应体系和反应条件为：

。

6.根据权利要求3所述的烟草尼古丁含量调控基因IAA27的克隆方法，其特征在于B步骤中所述的测序的具体操作是将扩增获得的PCR产物在0.8%的琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，采用Qiagen公司PCR产物纯化试剂盒，按照产品说明回收纯化所述的PCR产物，并送Invitrogen测序，验证序列结果。

7.一种权利要求1或2所述的烟草尼古丁含量调控基因IAA27的应用，其特征在于所述的烟草尼古丁含量调控基因IAA27在获得高尼古丁含量的转基因烟草植株中的应用。

8.一种含有权利要求1或2所述的烟草尼古丁含量调控基因IAA27的重组载体。

9.一种含有权利要求1或2所述的烟草尼古丁含量调控基因IAA27的表达盒。

10.一种含有权利要求1或2所述的烟草尼古丁含量调控基因IAA27的转基因细胞系或重组菌。