CN101280002A - 一种适合双向电泳的枣蛋白质提取方法 - Google Patents
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Abstract
一种适合双向电泳的枣蛋白质提取方法，以0.2g枣树叶片、枝皮或花为试材，在液氮中充分研磨后，转移到10mL离心管；加－20℃冻存的丙酮清洗样品粉末2次，4℃10000g离心5min，取沉淀；再用－20℃冻存的10％三氯乙酸(丙酮配制)洗沉淀4次至无色；用常温10％三氯乙酸水溶液和－20℃冻存的丙酮分别洗沉淀2次，沉淀室温干燥30min，得到蛋白粗提干粉，称干粉0.05－0.1g，溶于苯酚和SDS溶液中，充分涡旋30s，10000g离心5min，将上层酚相吸出，置于新离心管中，加5倍体积的－20℃冻存的冷甲醇与0.1M醋酸铵混合液到苯酚相，置于－20℃30min，离心后，用－20℃冻存的冷甲醇与0.1M醋酸铵混合液洗沉淀2次，－20℃冻存的丙酮洗沉淀2次，沉淀室温干燥30min，即可获得高质量的蛋白粉末，完全能满足后续双向电泳分析的要求。
Description
技术领域
本发明涉及一种适合蛋白质双向电泳分析的枣蛋白质提取方法。
背景技术
随着蛋白质组这一概念的提出，蛋白质组在生物学界得到了充分关注。双向电泳技术(two-dimensional electrophoresis，2-DE)作为蛋白质组研究的三大关键核心技术之一(另两种是质谱技术和计算机图像数据处理与蛋白质组数据库即蛋白质组信息技术)，是分离蛋白质的重要手段，是目前唯一可以在一块胶上同时分离数千乃至上万个蛋白质的方法，且分离得到的蛋白质组分纯度可以达到90％以上。因此，对于植物蛋白质组的研究，双向电泳技术的应用越来越受到人们的广泛关注。
双向电泳是指利用蛋白质的带电性和分子量大小的差异，通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质群的技术。双向电泳技术包括蛋白样品制备、干胶条水合、等电聚焦、在平衡液中平衡胶条和SDS-PAGE电泳等步骤。随着此项技术应用越来越广泛，技术体系也越来越成熟，只要能保证提取蛋白的质量，利用成熟的后续步骤就可获得高质量的电泳图谱。所以，对一种新的植物材料，获得理想的双向电泳图谱的关键就是必须提取得到高质量的蛋白样品。
枣树是原产我国的特色优势果树，资源非常丰富。枣树的组织器官因为富含糖类等杂质，提取高质量的蛋白比较困难。本发明利用田间的枣树试材(包括叶、花及枝皮)，通过蛋白提取步骤的大量摸索，最终建立了一套适合枣双向电泳的蛋白提取技术体系。
发明内容
本发明建立了一套成熟、实用的适合双向电泳的枣蛋白质提取方法，为枣的蛋白质组学研究提供了技术保障。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：以枣树叶片、枝皮和花等为试材，通过研磨，丙酮、三氯乙酸及苯酚和SDS等一系列试剂的抽提离心过程，最终去除杂质，获得高质量的蛋白样品。双向电泳结果表明，用此提取方法获得的蛋白质可以完全满足后续的双向电泳分析要求。
本发明的具体内容，即蛋白质提取的具体方法如下：
(1)取新鲜枝皮或-70℃冻存的枝皮、花或叶片0.2g，在液氮中研磨后，转移到10mL离心管中；
(2)加-20℃冻存的丙酮5.0mL，充分涡旋30s，4℃10000g离心5min，弃上清，取沉淀；
(3)沉淀加-20℃冻存的丙酮5.0mL，充分涡旋30s，4℃10000g离心5min，弃上清，取沉淀；
(4)用-20℃冻存的10％三氯乙酸(丙酮配制)洗沉淀4次，直至无色，每次均充分涡旋30s，4℃10000g离心5min，弃上清，取沉淀；
(5)用10％三氯乙酸水溶液(常温)洗沉淀2次，每次均充分涡旋30s，4℃10000g离心5min，弃上清，取沉淀；
(6)用-20℃冻存的丙酮洗沉淀2次，每次均充分涡旋30s，4℃10000g离心5min，弃上清，取沉淀；
(7)室温干燥沉淀30min，得到蛋白粗提干粉；
(8)称量步骤(7)所得干粉0.05-0.1g，溶于1mL苯酚(Tris配制pH8.0)和1mLSDS溶液(30％蔗糖，2％SDS，0.1MTris-HCl pH8.0，5％β-巯基乙醇)，于10mL离心管中；
(9)充分涡旋30s，10000g离心5min，苯酚相被分开；吸出上层的苯酚相，置于新的离心管中，加至少5倍体积-20℃冻存的甲醇与0.1M醋酸铵混合液到苯酚相，置于-20℃30min；
(10)10000g离心5min，再用-20℃冻存的甲醇与0.1M醋酸铵混合液洗沉淀2次；
(11)加-20℃冻存的丙酮洗沉淀2次，将洗净的沉淀在室温干燥30min，即获得高质量的蛋白质粉末。
本发明专利的有益效果是，在将样品充分研磨后，通过丙酮、三氯乙酸及苯酚和SDS等一系列试剂的抽提离心过程，最终去除了色素、酚及糖类杂质，获得了高质量的蛋白质样品，进行双向电泳分析获得了重复性好、分辨率高的电泳图谱。从而建立了一套适合双向电泳分析的枣蛋白质提取方法，为枣的蛋白质组学研究提供了技术支撑。
附图说明
图1是利用本发明提取的枣枝皮韧皮部蛋白质获得的双向电泳图谱。
图2是利用本发明提取的枣叶片蛋白质获得的双向电泳图谱。
图3是利用本发明提取的枣花蛋白质获得的双向电泳图谱。
具体实施方式
以枣树叶片、枝皮或花为试材，取0.2g，在液氮中充分研磨后，转移到10mL离心管；加-20℃冻存的丙酮清洗样品粉末2次，4℃10000g离心5min，弃上清，取沉淀；再用-20℃冻存10％三氯乙酸(丙酮配制)洗沉淀4次，直至无色；用常温10％三氯乙酸水溶液再洗沉淀2次，取沉淀；用-20℃冻存的丙酮洗沉淀2次，取沉淀；室温干燥30min，得到蛋白粗提干粉，称取干粉0.05-0.1g，溶于1mL苯酚和1mL SDS buffer中，充分涡旋30s，10000g离心5min，将上层酚相吸出，至于新的离心管中，加至少5倍体积的-20℃冻存的冷甲醇与0.1M醋酸铵混合液到苯酚相，置于-20℃30min，离心后，沉淀再用-20℃冻存的冷甲醇与0.1M醋酸铵混合液洗2次；加-20℃冻存的丙酮洗沉淀2次，沉淀室温干燥30min，即可获得高质量的蛋白粉末，满足后续的双向电泳分析要求。
Claims (2)
1.一种适合双向电泳的枣蛋白质提取方法，其特征在于用液氮研磨破碎细胞、丙酮和三氯乙酸多次抽提去除色素、苯酚和SDS抽提去除糖类杂质等一系列步骤，最终获得高质量的蛋白样品，可满足双向电泳分析要求。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)取新鲜枝皮或-70℃冻存的枝皮、花或叶片0.2g，在液氮中研磨后，转移到10mL离心管中；
(2)加-20℃冻存的丙酮5.0mL，充分涡旋30s，4℃10000g离心5min，弃上清，取沉淀；
(3)沉淀加-20℃冻存的丙酮5.0mL，充分涡旋30s，4℃10000g离心5min，弃上清，取沉淀；
(4)用-20℃冻存的10％三氯乙酸(丙酮配制)洗沉淀4次，直至无色，每次均充分涡旋30s，4℃10000g离心5min，弃上清，取沉淀；
(5)用10％三氯乙酸水溶液(常温)洗沉淀2次，每次均充分涡旋30s，4℃10000g离心5min，弃上清，取沉淀；
(6)用-20℃冻存的丙酮洗沉淀2次，每次均充分涡旋30s，4℃10000g离心5min，弃上清，取沉淀；
(7)室温干燥沉淀30min，得到蛋白粗提干粉；
(8)称量步骤(7)所得干粉0.05-0.1g，溶于1mL苯酚(Tris配制pH8.0)和1mLSDS溶液(30％蔗糖，2％SDS，0.1MTris-HCl pH8.0，5％β-巯基乙醇)，于10mL离心管中；
(9)充分涡旋30s，10000g离心5min，苯酚相被分开；吸出上层的苯酚相，置于新的离心管中，加至少5倍体积-20℃冻存的甲醇与0.1M醋酸铵混合液到苯酚相，置于-20℃30min；
(10)10000g离心5min，再用-20℃冻存的甲醇与0.1M醋酸铵混合液洗沉淀2次；
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20081008 |