CN102731674A - 一种从丹参醇提残渣中提取丹参多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种从丹参醇提残渣中提取丹参多糖的方法，通过对经醇提后的丹参残渣进行超声波辅助复合酶法提取、抽虑、浓缩、离心、透析、醇沉、抽虑、真空干燥、含量测定等工艺流程，得到丹参多糖，多糖得率为11.46%，多糖含量在80%以上，本发明所采用的材料为工业生产丹参醇提物后的残渣，在实现资源的可持续利用的同时，不仅节省了丹参多糖的生产成本和工业垃圾的处理成本，还减少了丹参多糖的提取环节，节约了资源，提高了效率。本发明采用超声波辅助复合酶法进行丹参多糖的提取，采用的木瓜蛋白酶有很好的除蛋白效果，省去了额外的除蛋白工艺。本发明所制得产品纯度高，其中多糖含量可高达80%以上。
Description
技术领域
本发明属于中药材资源综合利用领域，涉及一种丹参废弃物的二次资源开发，尤其涉及一种从丹参醇提残渣中提取丹参多糖的方法。
背景技术
丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）是唇形科（Lamiaceae）鼠尾草属（SalviaLinn.）多年生草本植物。其性微寒、味苦、无毒，有活血通经、祛瘀止痛、清心安神之功效。药理研究表明丹参除对心血管系统作用十分显著外，还具有抗氧化、抗凝血、抗血栓、抗肿瘤、抗炎、抗菌、保肝等免疫调节作用，是许多治疗心血管疾病和炎症的中药配方和制剂的主要成分和原料。植物多糖具有丰富的营养价值和药理价值，水溶性丹参多糖的研究，丰富了丹参的理论研究，使对丹参的利用不仅仅停留在小分子物质的研究上。另外已有研究表明，丹参多糖具有抗血栓、保肝、抗肿瘤等功效。专利号为CN 1839935A的专利表示通过一定方法获得的丹参多糖含量大于10%的丹参提取物具有抗血栓的功效。
对于丹参多糖的提取专利号为CN 101225422的专利A中提出了纤维素酶和木瓜蛋白酶酶解作用后，进行超声波提取丹参多糖的方法，但是丹参多糖的提取率只有5%-11%。其他关于丹参多糖提取的研究，大多采用单一的酶法或者超声波提取的方法。
随着丹参药理研究的深入，市场对丹参中脂溶性丹参酮类有效成份的需求越来越大，生产丹参酮类产品的厂家应运而生，同时带来了大量的工业废料，而多糖的提取恰恰需要脱脂除杂，因此选择丹参醇提后的残渣作的再次利用，不仅实现了资源的可持续利用，同时也大大降低了提取成本。
发明内容
根据以上技术问题，本发明提供一种从丹参醇提残渣中提取丹参多糖的方法，其特征在于通过对经醇提后的丹参残渣进行超声波辅助复合酶法提取、抽虑、浓缩、离心、透析、醇沉、抽虑、真空干燥、含量测定等工艺流程，得到丹参多糖，多糖得率为11.46%，多糖含量在80%以上，包括如下步骤：
1.超声波提取：取干燥丹参醇提残渣，加到20-25倍的水中，在超声波功率150-200W，超声波温度55-65℃的条件下，超声波提取25-35min；
2.复合酶法提取：按照果胶酶→纤维素酶→木瓜蛋白酶的加酶顺序对超声波处理后的残渣水混合物进行酶法提取，调节pH到3.5-4.0，温度55-65℃，加入0.410%-0.470%的纤维素酶，酶解25-35min，8-11min沸水浴将酶灭活后，调节pH到3.51-4.01，温度35-40℃，加入0.410%-1.420%的纤维素酶，酶解25-35min，8-11min沸水浴将酶灭活后，调节pH到6.11-6.33，温度35-40℃，加入0.351-0.401%的木瓜蛋白酶酶解30-35min，5-15min沸水浴将酶灭活；
3.丹参多糖的制备：对冷却后的残渣水混合物进行抽虑，将得到的提取液真空浓缩体积的85%-95%后离心，得到上清液与沉淀物，取上清液用蒸馏水透析10-13小时后换成超纯水透析34-36小时，收集透析袋中的溶液，加入无水乙醇沉淀多糖，抽虑后得到沉淀物，用无水乙醇，丙酮分别洗沉淀2次，将沉淀42-46℃真空烘干后得到丹参多糖。
所述的超声波功率为180W，超声波温度为61℃，超声波时间为31min。
所述加酶顺序为：果胶酶→纤维素酶→木瓜蛋白酶。
所述果胶酶酶解的条件为：pH3.94，温度53℃，时间31min，加酶量为0.430%。纤维素酶酶解的条件为：pH3.78，温度36℃，时间33min，加酶量为0.411%。木瓜蛋白酶酶解的条件为：pH6.22，温度36℃，时间31min，加酶量为0.390%。
本发明的有益效果为：本发明所采用的材料为工业生产丹参醇提物后的残渣，在实现资源的可持续利用的同时，不仅节省了丹参多糖的生产成本和工业垃圾的处理成本，还减少了丹参多糖的提取环节，节约了资源，提高了效率。本发明采用超声波辅助复合酶法进行丹参多糖的提取，采用的木瓜蛋白酶有很好的除蛋白效果，省去了额外的除蛋白工艺。另外传统的除蛋白多采用Sevag试剂法，三氯乙酸法等有机溶剂法，这些方法除蛋白不能保证最终产品中是否存在有机试剂的残留，且有机溶剂回收难，易造成环境污染，而酶法除蛋白反应条件温和，多糖损失率低，无溶剂污染，具有安全无毒的特点。本发明所制得产品纯度高，其中多糖含量可高达80%以上。
附图说明
图1超声波提取功率与提取温度对丹参多糖提取率影响的响应面图；
图2超声波提取功率与提取时间对丹参多糖提取率影响的响应面图；
图3超声波提取温度与提取时间对丹参多糖提取率影响的响应面图；
图4超声波提取功率与提取温度对丹参多糖提取率影响的响应面图；
图5超声波提取功率与提取时间对丹参多糖提取率影响的响应面图；
图6超声波提取温度与提取时间对丹参多糖提取率影响的响应面图；
图7总糖含量测定标准曲线；
图8还原糖含量测定标准曲线。
具体实施方式
下面结合图1—图8对本发明进行进一步说明，但发明的保护范围并不仅仅限于此：
实施例1
1、材料与试剂
丹参醇提残渣；纤维素酶，果胶酶，木瓜蛋白酶，无水乙醇，浓硫酸（优级纯），葡萄糖，苯酚，3-5-二硝基水杨酸，酒石酸钾钠，除标明外其他均为分析纯。
2、实验仪器
紫外可见分光光度计（Shimazu UV-1750），PHS-320型智能酸度计，HH.S11-Ni6电热恒温水浴锅，KQ-300GDV型恒温数控超声波清洗器，sartorius系列电子天平，GL-2050M高速冷冻离心机，DZ-2BC真空干燥箱，RE-52AA/RE-52A旋转蒸发器等。
3实验方法
3.1多糖提取技术路线
称一定量干燥丹参醇提残渣→加到20-25倍体积的水中→超声波提取→复合酶提取→将残渣水混合物抽虑后得到提取液→真空浓缩提取液体积的90%得到浓缩液→浓缩液离心→取上清液用蒸馏水透析12小时后换成超纯水透析36小时→收集透析袋中的溶液，加入无水乙醇沉淀多糖→抽虑得到沉淀物，用无水乙醇，丙酮分别洗沉淀2次→将沉淀45℃真空烘干后得到丹参多糖→取一定质量干燥后的丹参多糖，用超纯水溶解后定容至一定体积→多糖含量测定。
3.2总糖标准曲线的制作
采用改进后的苯酚-硫酸法进行总糖含量的测定。首先配制0.4mg/mL的葡萄糖标准溶液，分别取100，200，600，800，1000μL的葡萄糖标准溶液于试管中，补超纯水到1mL；混合均匀后分别加入5mL浓硫酸-苯酚显色剂，震荡摇匀后沸水浴30min。最后在490nm下测定吸光值。
3.3还原糖标准曲线的制作
DNS试剂的配制：40g3-5-二硝基水杨酸，8g苯酚，2g亚硫酸钠，800g酒石酸钾钠，加入到2 L 2%（W/V）氢氧化钠中，用水稀释至4L。
配制10mg/mL的葡萄糖标准溶液。通过10mg/mL葡萄糖标准溶液配置一系列的葡萄糖浓度梯度的葡萄糖标准溶液（3.00mg/mL，4.00mg/mL，5.00mg/mL，6.00mg/mL，7.00mg/mL，8.00mg/mL，9.00mg/mL，10.00mg/mL）。分别取各浓度梯度的葡萄糖标准溶液2.00mL，各加入5.00 mL DNS试剂，沸水浴5min后，迅速冷却至室温，定容至25.00mL,540nm测定吸光值。
3.4多糖提取率的计算
多糖提取率（%）=（总糖含量-还原糖含量）/丹参醇提残渣质量×100
3.5实验条件优化
3.5.1超声波提取工艺条件的优化
先进行超声波提取工艺的单因素设计，包括超声波的提取功率，提取温度和提取时间。
经各单因素提取条件实验后，设定料液比为固定值，提取功率，提取温度，提取时间为自变量，根据Box-Benhnken Design的设计原理，采用三因素三水平的响应面优化法，研究了各因素及其交互作用后对丹参多糖提取率的因素。
3.5.2酶提取工艺条件的优化
采用均匀设计法分别考查纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶的最佳酶解条件。精确称取适量丹参醇提残渣10g，按均匀设计表U10(108)及U10*(108)设计实验表进行实验。用0.1mol/L的HCl溶液和NaOH溶液调节pH值，最后测定多糖含量，得到多糖的提取率，实验平行3次。
将实验结果分别输入DPS分析软件，采用最小二乘法进行回归分析，分析各因素对多糖提取率的影响，以及各因素之间的相关性，得到各酶最优作用条件。
3.5.3复合酶提取丹参多糖的工艺研究
根据单酶实验的优化结果，进行三种酶加酶顺序的实验。即分别按照A→B→C、B→C→A、C→B→A、C→A→B、A→C→B、B→A→C(A代表纤维素酶、B代表果胶酶、C代表木瓜蛋白酶)的次序加入三种酶进行酶法提取丹参多糖的实验，提取方法与单酶提取丹参多糖的实验方法相同，每种酶酶解作用后进行酶灭活处理。另外进行了同时加酶的实验，即在同一条件下将三种酶同时加入，进行酶法提取的实验，最后将分步加酶和同时加酶的多糖提取率进行比较，得出最佳的复合酶作用方式。
4实验结果
4.1总糖标准曲线
曲线方程为：y=3.5109x-0.0225，R2=0.9997
4.2还原糖标准曲线
曲线方程为：y=-0.00871+0.00832x，R2=0.9994
表1响应面优化设计各因素水平表
表2Box-Behnken实验设计及实验结果
4.3响应面优化超声波提取工艺条件
根据单因素实验结果，分别用X1、X2、X3来表示超声波的提取功率，提取温度和提取时间，按方程xi=（Xi-X0）/ΔX对自变量进行编码，其中xi为自变量的编码值，Xi为变量的真实值，X0为实验中心变量的真实值，ΔX为步长。每次实验平行3次，最后取平均值，进行实验结果的处理,Y表示多糖提取率。
表3Box-Behnken实验设计回归模型方差分析结果
注：*表示在0.05水平显著，**表示在0.01水平显著。
Box-Behnken响应面优化的结果显示，超声波提取功率，超声波提取温度和超声波提取时间对丹参多糖提取率的影响，在95%的概率水平上差异显著。实验结果拟合方程为：R2=0.9947，R2 （Adj)=0.9880，变异系数为1.54，说明此模型与实际试验拟合较好，由表2可知试验失拟项不显著，因此可用该回归方程代替试验真实点对实验结果进行分析。试验优化条件为：超声波功率172.21W，超声波提取温度为60.02℃，超声波提取时间为30.53min，优化多糖的最大提取率为22.41%。考虑实际操作条件，选择功率180W，温度60℃，时间31min为超声波提取的条件进行后续实验。
4.4均匀设计法优化复合酶提取工艺条件
表4均匀设计实验结果
表3为三种酶分别均匀设计实验的试验结果。采用偏最小二乘回归分析方法，借助DPS分析软件，分析各因素对多糖提取率的影响，以及各因素之间的相关性，分别得到纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶分别酶解作用时的最佳酶解条件。
对三种酶建模分析得到的回归方程分别为：
数据标准化后模型误差平方和、Press残差平方和以及拟合的决定系数如表4所示，偏最小二乘回归能较好地解决自变量之间的相关性问题，克服变量多重相关性在系统建模中的不良作用。采用这一方法建立的酶法提取丹参多糖试验模型，通过计算、拟合和分析，说明建立的回归模型具有较好的拟合性和稳定性。其实验优化结果显示，纤维素酶的最佳提取条件为：pH3.78，温度36℃，时间33min，加酶量为0.411%，料水比1：26，理论多糖提取率为12.83%；果胶酶的最佳提取条件为：pH3.94，温度53℃，时间31min，加酶量为0.430%，料水比为1：23，理论多糖提取率为13.66%；木瓜蛋白酶的最佳提取条件为：pH6.22，温度36℃，时间31min，加酶量为0.390%，料水比1：16，理论多糖提取率为21.08%。
表5数据标准化后模型误差平方和、Press残差平方和及拟合的决定系数
4.5复合酶法提取丹参多糖的研究
从表5可以看出分步加酶法的提取效果优于同步加酶法，原因可能是采用分步加酶法各种酶在各自的最适条件下进行酶解反应，使3种酶的酶解效率得到提高。且采用先加果胶酶，再加纤维素酶，最后加木瓜蛋白酶的加酶次序提取效果最好，多糖提取率最高。
表5不同加酶方式的丹参多糖提取率
注：A代表纤维素酶，B代表果胶酶，C代表木瓜蛋白酶
4.6超声波协同复合酶作用提取丹参醇提残渣中丹参多糖的的研究
取丹参醇提残渣35g，加到20-25倍体积的水中，在超声波功率为180W，超声温度61℃条件下，超声处理30min后，进行分步加酶提取（先加入果胶酶：pH3.94，温度53℃，时间31min，加酶量为0.430%；然后加入纤维素酶：pH3.78，温度36℃，时间33min，加酶量为0.411%；最后加入木瓜蛋白酶：pH6.22，温度36℃，时间31min，加酶量为0.390%）。将提取液真空浓缩体积的90%后离心，取上清液用蒸馏水透析12小时后换成超纯水透析36小时。收集透析后透析袋中的溶液，加入无水乙醇沉淀多糖，抽虑得到沉淀物。用无水乙醇，丙酮分别洗沉淀2次，将沉淀45℃真空烘干后得到丹参多糖4.0125g。多糖得率为11.46%，多糖含量为92.00%。
Claims (4)
1.一种从丹参醇提残渣中提取丹参多糖的方法，其特征在于通过对经醇提后的丹参残渣进行超声波辅助复合酶法提取、抽虑、浓缩、离心、透析、醇沉、抽虑、真空干燥、含量测定等工艺流程，得到丹参多糖，多糖得率为11.46%，多糖含量在80%以上，包括如下步骤：
（1）、超声波提取：取干燥丹参醇提残渣，加到20-25倍的水中，在超声波功率150-200W，超声波温度55-65℃的条件下，超声波提取25-35min；
（2）、复合酶法提取：按照果胶酶→纤维素酶→木瓜蛋白酶的加酶顺序对超声波处理后的残渣水混合物进行酶法提取，调节pH到3.5-4.0，温度55-65℃，加入0.410%-0.470%的纤维素酶，酶解25-35min，8-11min沸水浴将酶灭活后，调节pH到3.51-4.01，温度35-40℃，加入0.410%-1.420%的纤维素酶，酶解25-35min，8-11min沸水浴将酶灭活后，调节pH到6.11-6.33，温度35-40℃，加入0.351-0.401%的木瓜蛋白酶酶解30-35min，5-15min沸水浴将酶灭活；
（3）、丹参多糖的制备：对冷却后的残渣水混合物进行抽虑，将得到的提取液真空浓缩体积的85%-95%后离心，得到上清液与沉淀物，取上清液用蒸馏水透析10-13小时后换成超纯水透析34-36小时，收集透析袋中的溶液，加入无水乙醇沉淀多糖，抽虑后得到沉淀物，用无水乙醇，丙酮分别洗沉淀2次，将沉淀42-46℃真空烘干后得到丹参多糖。
2.按照权利1所述的一种从丹参醇提残渣中提取丹参多糖的方法，其特征在于：所述的超声波功率为180W，超声波温度为61℃，超声波时间为31min。
3.按照权利1所述的一种从丹参醇提残渣中提取丹参多糖的方法，其特征在于：加酶顺序为：果胶酶→纤维素酶→木瓜蛋白酶。
4.按照权利1所述的一种从丹参醇提残渣中提取丹参多糖的方法，其特征在于果胶酶酶解的条件为：pH3.94，温度53℃，时间31min，加酶量为0.430%。纤维素酶酶解的条件为：pH3.78，温度36℃，时间33min，加酶量为0.411%。木瓜蛋白酶酶解的条件为：pH6.22，温度36℃，时间31min，加酶量为0.390%。
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