CN102241730B - 香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法，本发明经过大量实验筛选，首先高效地将香蒲假茎中的蛋白质提取出来，然后在优选条件下，采用双向电泳方法将蛋白质各成分和次生代谢物（如：色素、酚类、醌类等）成分进行分离，然后采用优选条件的硝酸银染色法进行定性分析和/或采用质谱仪对分离的蛋白质进行定性和定量分析。实验结果表明，本发明采用的双向电泳分析方法分离得到的蛋白点多，经PDQuest图像分析软件检测，蛋白点多于1000个，且图谱清晰，无横向、纵向条纹，该方法重复性和稳定性好，能方便鉴别香蒲这一药食两用植物的真伪，为对香蒲进行深入研究，为实现科学化种植、培育和开发利用提供质控标准和科学依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物的质量分析和鉴定方法，具体涉及一种香蒲假茎中的总蛋白质的提取和双向电泳分析方法，属于生物技术领域。
背景技术
香蒲(Typha latifolia L.)，又名蒲菜、蒲草、水蜡烛，为香蒲科香蒲属多年生宿根性沼泽草本植物，分布于世界各地的沼泽及淡水湖泊中。在我国部分地区，其营养体幼嫩部分被用来作为蔬菜食用，风味独特，营养丰富，并且蒲菜还具有药用价值，其性味甘平，微凉，具有清凉补血，利水消肿之功效，因而是一种营养丰富并具一定药疗功能的保健型蔬菜。蒲菜中的主要营养物质和和药效物质为蛋白质类化合物，但植株体内还含有较多的次生代谢产物（如：色素、酚类、醌类等物质），现有技术中还没有针对蒲菜中蛋白成分的质量分析方法。因此为了对香蒲这一药食两用植物进行深入研究，并能方便鉴别其真伪，并对香蒲进行质量控制，为实现科学化种植和培育提供质控标准，很有必要在现有技术的基础上研究设计一种能对香蒲中的总蛋白质进行分离，建立适用于香蒲蛋白质组分有效分离、分析的方法，该方法可为香蒲水生植物材料蛋白质组学研究提供实验基础和参考。
发明内容
发明目的：本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法。
技术方案：为了实现以上目的，本发明提供的香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法，具体包括以下步骤：
(1)采集香蒲假茎，用超纯水洗净，并用滤纸吸去多余水分，放入液氮中速冻，并移至-80℃冰箱保存备用；
(2)称取5g步骤(1)保藏的香蒲假茎迅速放入冰浴的研钵中，加液氮研磨成细粉，研磨过程中加入0.5g聚乙烯吡咯烷酮，把研磨后的细粉转入-20℃预冷的50ml离心管中，加入3倍体积-20℃预冷的三氯乙酸（TCA）/丙酮溶液，充分混合后，放在-20℃冰箱中静置2小时，备用；
(3)取步骤(2)得到的香蒲假茎细粉的三氯乙酸（TCA）/丙酮溶液，在35000 转/分钟，4℃离心30min，移去上清液，取沉淀，加入25ml预冷的样品洗涤液，充分混合后，放在-20℃保存1小时，期间间隔涡旋；然后在35000 转/分钟，4℃离心 30min，移去上清液，取沉淀，再加入25 ml -20℃预冷的样品洗涤液，充分混合后，放在-20℃保存1小时，期间间隔涡旋；然后在35000转/分钟，4℃离心 30min，去掉上清液后，用滤纸将离心管封口，真空冷冻干燥，得到香蒲假茎蛋白粉；备用；
(4)取步骤(3)得到的香蒲假茎蛋白粉在4℃溶于样品裂解液中1 小时，期间在裂解液中加玻璃珠，并用超声波超声三次，每次3分钟；然后在35000转/分钟，4℃离心 30min，得到上清液；然后用3倍体积预冷的样品洗涤液在-20℃沉淀1小时，然后再在35000转/分钟，4℃、离心30min，弃上清液，得离心沉淀后溶解于样品裂解液，在4℃溶解1小时，然后在35000转/分钟，4℃离心 30min，取上清液，得到香蒲假茎蛋白质提取液，备用；
(5)取步骤(4)得到的香蒲假茎蛋白质提取液，采用考马斯亮兰法（Bradford）测定其蛋白浓度，对蛋白质进行定量；
(6)取步骤(4)得到的香蒲假茎蛋白质提取液进行电泳分析或对蛋白质进行质谱检测和分析。:
第一向等电聚焦电泳：按上样量500μg，上样体积450μl, 用水化液对已定量好的香蒲假茎蛋白样品进行稀释；将香蒲假茎蛋白样品加入水化盘内后，再将线性IPG胶条（优选pH 4-7，24cm，GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA）胶面向下放入水化盘中，除去胶面与蛋白样品液间的气泡，每个胶条用7ml矿物油覆盖胶条，进行水化；水化结束后进行等电聚焦；
(7)胶条平衡处理：将步骤(6)等电聚焦完成后的IPG胶条进行平衡2次，每次平衡时间为15min，二次平衡缓冲液配制如下：
胶条平衡缓冲液母液：6mol/L的尿素，质量体积比2%的十二烷基磺酸钠（SDS），0.375mol/L的Tris-HCl（优选pH为8.8），体积比30%甘油，溶剂为水；
第一次胶条平衡缓冲液 
为：每1ml胶条平衡缓冲液母液加入20mg 二硫苏糖醇(DTT)；
第二次胶条平衡缓冲液为：每1ml胶条平衡缓冲液母液加入25mg碘乙酰胺；
第二向聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳：将平衡后的胶条置于胶浓度为12.5%（质量体积比）的SDS-PAGE凝胶上，用浓度为0.5%（质量体积比）低熔点琼脂糖的封胶液封住顶部,其中琼脂糖中含有质量体积比为0.002%的溴酚蓝，然后按如下参数进行电泳：16℃恒温，恒功率条件下，用2瓦/根胶条电泳1.5h，再用12瓦/根胶条电泳4~6h，直到溴酚蓝移动到需要的位置为止；
(8)电泳结束后对胶条采用硝酸银法进行染色分析或对蛋白质进行质谱检测和分析。。
作为优选方案，以上所述的香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法，步骤(2)所述的三氯乙酸（TCA）/丙酮溶液由下列物质组成：质量体积比10%的三氯乙酸，质量体积比0.07%的二硫苏糖醇（DTT），1mmol/L的苯甲基磺酰氟（PMSF），其余溶剂为丙酮。
作为优选方案，以上所述的香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法，步骤(3)所述的样品洗涤液由下列物质组成：质量体积比0.07% 的二硫苏糖醇和1mmol/L的苯甲基磺酰氟，其余溶剂为丙酮。
作为优选方案，以上所述的香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法，步骤(4)样品裂解液由下列物质组成：7mol/L的尿素、2mol/的硫脲、质量体积比4%的3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸（CHAPS）、65mmol/L的二硫苏糖醇、1mmol/L苯甲基磺酰氟、体积比0.2%的载体两性电解质（所用的载体两性电解质可为 carrier ampholytes, GE），溶剂为水。实验过程中裂解液需现用现配。
在香蒲假茎总蛋白提取过程中，本发明经过大量实验研究，对三氯乙酸（TCA）/丙酮溶液、样品洗涤液和裂解液的组成及配比进行大量筛选，以香蒲假茎总蛋白的提取率和总蛋白中各蛋白的提取完整性为指标进行筛选，优化得到最佳配比的三氯乙酸（TCA）/丙酮溶液、样品洗涤液和裂解液，采用本发明提供的三氯乙酸（TCA）/丙酮溶液、样品洗涤液和裂解液对香蒲进行处理后香蒲假茎中总蛋白的提取率高，且能保证各蛋白全部提出，为后续分析和鉴定香蒲假茎总蛋白质提供有利依据。
作为优选方案，以上所述的香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法，步骤(6)所述的水化液由下列物质组成：7mol/L的尿素、2mol/的硫脲、质量体积比2%的3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸（CHAPS）、65mmol/L的二硫苏糖醇、体积比0.2%的载体两性电解质（所用的载体两性电解质可为carrier ampholytes, GE），溶剂为水。实验过程中水化液需现用现配。
作为优选方案，以上所述的香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法，步骤(6)所述的等电聚焦的参数设置如下：30伏水化，12小时；200伏（升压模式为step-n-hold），1小时；500伏（升压模式为step-n-hold），1小时；2000伏（升压模式为step-n-hold），1小时；8000伏（升压模式为gradiet），4小时；8000伏（升压模式为step-n-hold），60000Vh；500伏（升压模式为step-n-hold，保持）。
作为优选方案，以上所述的香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法，步骤(6)第二向聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳中聚丙烯酰胺凝胶的溶剂由体积比为31：42：25：1：1：0.14的水、质量体积比30%的丙烯酰胺、0.375mol/L的Tris-HCl （优选pH为8.8）、质量体积比为10%的十二烷基硫酸钠、质量体积比为10%的过硫酸铵和体积比为10%的四甲基乙二胺组成。
作为优选方案，以上所述的香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法，步骤(6)中电极缓冲液配制方法如下：按质量体积比0.1%的十二烷基硫酸钠，0.025mol/L的三羟甲基氨基甲烷（Tris）和0.192mol/L的甘氨酸进行配制，溶剂为水，并调制pH值为8.3。
作为优选方案，以上所述的香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法，步骤(8)中所述的硝酸银染色分析方法包括如下程序：
步骤a：将电泳结束后凝胶条放入盛有超纯水的染色盘中，用超纯水在摇床上洗3次，每次10min；
步骤b：然后加入100ml 冰乙酸、400ml无水乙醇、加水至1000ml固定2h或过夜；
步骤c: 然后取2g 硫代硫酸钠，112.72g 三水合乙酸钠，300ml无水乙醇，加水
至1000ml将胶条敏化30min；然后再用600ml 超纯水漂洗三遍，每次5~10 min；
步骤d：然后将2.5g 硝酸银溶于1000ml水，避光条件下对胶条染色30min；然后用600ml 超纯水漂洗二遍，每次1~5min；
步骤e：然后用25g 无水碳酸钠，0.4ml 甲醛，加水至1000ml，显色共2次；第一次待溶液变黄后倒掉，第二次显色到蛋白质点显现到理想的程度和清晰度为止；
步骤f：最后将凝胶条放入由14.6g Na2EDTA溶于1000ml体积的水制成的终止液中终止10min以上或过夜，即可。
以上所述的香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法，步骤(8)所述的质谱检测和分析，采用EI-MS或MS-MS串联质谱法分析。
以上所述的香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法中，整个过程的溶液配制均需用超纯水，实验过程所需的DTT和碘乙酰胺均需现用现加。
有益效果：本发明提供的香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法具有以下优点：
本发明所述的香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法，经过大量实验筛选，首先可以高效的将香蒲及其假茎中的蛋白质进行提取出来，然后根据香蒲及其假茎中所含化合物的特点，在大量实验优选条件下，采用双向电泳方法不仅能将蛋白质和次生代谢物（如：色素、酚类、醌类等）成分进行分离，而且能将香蒲假茎中各蛋白质成分进行分离，实验结果表明，本发明采用的双向电泳分析方法分离得到的蛋白点多，经PDQuest图像分析软件检测，蛋白点多于1000个，且图谱清晰，无横向、纵向条纹，重复性好，可在香蒲及其假茎蛋白质组学中直接运用，并且本发明再对分离的蛋白质采用优选的硝酸银染色法定性分析和/或采用质谱仪对蛋白质进行定性和定量分析。
本发明所述的香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法体系，能方便鉴别香蒲这一药食两用植物的真伪，为对香蒲进行深入研究，为实现科学化种植和培育提供质控标准和科学依据。
附图说明
图1为实施例1中香蒲室内水培假茎总蛋白质双向电泳图谱。
图2 为实施例2中湖泊生长的香蒲假茎总蛋白质双向电泳图谱。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例1和2所用的离心机为高速冷冻离心机（Beckmen）、双向电泳为双向电泳Ettan2-2A （GE Healthcare）。
实施例1
室内水培香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法，具体包括以下步骤：
(1)采集室内水培香蒲假茎，用超纯水洗净，并用滤纸吸去多余水分，放入液氮中速冻，并移至-80℃冰箱保存备用；
(2)称取5g步骤(1)保藏的香蒲假茎迅速放入冰浴的研钵中，加液氮研磨成细粉，研磨过程中加入0.5g聚乙烯吡咯烷酮，把研磨后的细粉转入-20℃预冷的50ml离心管中，加入3倍体积-20℃预冷的三氯乙酸（TCA）/丙酮溶液，充分混合后，放在-20℃冰箱中静置2小时，备用；其中所述的三氯乙酸（TCA）/丙酮溶液由下列物质组成：质量体积比10%的三氯乙酸，质量体积比0.07%的二硫苏糖醇（DTT），1mmol/L的苯甲基磺酰氟（PMSF），其余溶剂为丙酮。
(3)取步骤(2)得到的香蒲假茎细粉的三氯乙酸（TCA）/丙酮溶液，在35000 转/分钟，4℃离心30min，移去上清液，取沉淀，加入25ml预冷的样品洗涤液，充分混合后，放在-20℃保存1小时，期间间隔涡旋；然后在35000 转/分钟，4℃离心 30min，移去上清液，取沉淀，再加入25 ml -20℃预冷的样品洗涤液，充分混合后，放在-20℃保存1小时，期间间隔涡旋；然后在35000转/分钟，4℃离心 30min，去掉上清液后，用滤纸将离心管封口，真空冷冻干燥，得到香蒲假茎蛋白粉；备用；其中所述的样品洗涤液由下列物质组成：质量体积比0.07% 的二硫苏糖醇和1mmol/L的苯甲基磺酰氟，其余溶剂为丙酮。
(4)取步骤(3)得到的香蒲假茎蛋白粉在4℃溶于样品裂解液中1 小时，期间在裂解液中加玻璃珠，并用超声波超声三次，每次3分钟；然后在35000转/分钟，4℃离心 30min，得到上清液；然后用3倍体积预冷的样品洗涤液在-20℃沉淀1小时，然后再在35000转/分钟，4℃、离心30min，弃上清液，得离心沉淀后溶解于样品裂解液，在4℃溶解1小时，然后在35000转/分钟，4℃离心 30min，取上清液，得到香蒲假茎蛋白质提取液，备用；其中样品裂解液由下列物质组成：7mol/L的尿素、2mol/的硫脲、质量体积比4%的3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸（CHAPS）、65mmol/L的二硫苏糖醇、1mmol/L苯甲基磺酰氟、体积比0.2%的载体两性电解质（carrier ampholytes, GE）。实验过程中裂解液需现用现配。
(5)取步骤(4)得到的香蒲假茎蛋白质提取液，采用Bradford 法测定其蛋白浓度，对蛋白质进行定量；
(6)取步骤(4)得到的香蒲假茎蛋白质提取液进行电泳分析:
第一向等电聚焦电泳：按上样量500μg，上样体积450μl，用水化液对已定量好的香蒲假茎蛋白样品进行稀释；将香蒲假茎蛋白样品加入水化盘内后，再将线性IPG胶条（pH 4-7，24cm，GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA）胶面向下放入水化盘中，除去胶面与蛋白样品液间的气泡，每个胶条用7ml矿物油覆盖胶条，进行水化；水化结束后进行等电聚焦（等电聚焦的参数设置如下30伏水化，12小时；200伏（升压模式为step-n-hold），1小时；500伏（升压模式为step-n-hold），1小时；2000伏（升压模式为step-n-hold），1小时；8000伏（升压模式为gradiet），4小时；8000伏（升压模式为step-n-hold），60000Vh；500伏（升压模式为step-n-hold，保持）；其中所述的水化液由下列物质组成：7mol/L的尿素、2mol/的硫脲、质量体积比2%的3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸（CHAPS）、65mmol/L的二硫苏糖醇、体积比0.2%的载体两性电解质。实验过程中水化液需现用现配。
(7)胶条平衡处理：将步骤(6)等电聚焦完成后的IPG胶条进行平衡两次，每次平衡时间为15min，二次平衡缓冲液配制如下：
胶条平衡缓冲液母液：6mol/L的尿素，质量体积比2%的十二烷基磺酸钠（SDS），0.375mol/L的Tris-HCl（pH为8.8），体积比30%甘油，溶剂为水；
第一次胶条平衡缓冲液
为：每1ml胶条平衡缓冲液母液加入20mg 二硫苏糖醇(DTT)；
第二次胶条平衡缓冲液
为：每1ml胶条平衡缓冲液母液加入25mg碘乙酰胺；
第二向聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳：将平衡后的胶条置于胶浓度为12.5%（质量体积比）的SDS-PAGE凝胶上，用浓度为0.5%（质量体积比）低熔点琼脂糖的封胶液封住顶部,其中琼脂糖中含有质量体积比为0.002%的溴酚蓝，然后按如下参数进行电泳：16℃恒温，恒功率条件下，用2瓦/根胶条电泳1.5h，再用12瓦/根胶条电泳4~6h，直到溴酚蓝移动到需要的位置为止；其中电极缓冲液配制方法如下：按质量体积比0.1%的十二烷基硫酸钠，0.025mol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)和0.192mol/L的甘氨酸进行配制，溶剂为水，并调制pH值为8.3。
并且第二向SDS-PAGE电泳中聚丙烯酰胺凝胶的溶剂由体积比为31：42：25：1：1：0.14的水、质量体积比30%丙烯酰胺、0.375mol/L的Tris-HCl （pH为8.8）、质量体积比为10%的十二烷基硫酸钠、质量体积比为10%的过硫酸铵和体积比为10%的四甲基乙二胺组成。
(8)电泳结束后对胶条采用硝酸银法进行染色分析，具体程序如下：
步骤a：将电泳结束后凝胶条放入盛有超纯水的染色盘中，用超纯水在摇床上洗3次，每次10min；
步骤b：然后加入100ml 冰乙酸、400ml无水乙醇、加水至1000ml固定2h或过夜；
步骤c: 然后取2g 硫代硫酸钠，112.72g 三水合乙酸钠，300ml无水乙醇，加水
至1000ml将胶条敏化30min；然后再用600ml 超纯水漂洗三遍，每次5~10 min；
步骤d：然后将2.5g 硝酸银溶于1000ml水，避光条件下对胶条染色30min；然后用600ml 超纯水漂洗二遍，每次1~5min；
步骤e：然后用25g 无水碳酸钠，0.4ml 甲醛，加水至1000ml，显色共2次；第一次待溶液变黄后倒掉，第二次显色到蛋白质点显现到理想的程度和清晰度为止；
步骤f：最后将凝胶条放入由14.6g Na2EDTA溶于1000ml体积的水制成的终止液中终止10min以上或过夜，即可。
通过上述方法对室内培养的香蒲假茎总蛋白质进行提取和双向电泳分离，具体实验结果如图1所示，该图表明香蒲假茎总蛋白质样品分离效果好，图谱清晰，蛋白点多，无横向、纵向条纹，经PDQuest软件点检测和分析，蛋白点多于1000个。并且图1中横向为等电聚焦，横向数字为蛋白质凝胶等电点分布；纵向为SDS-PAGE，纵向数字为蛋白质分子量标准，单位是kD，并且经质谱分析确定图1中蛋白点1、2、3、4、5、6、7和8分别为：甲硫氨酸合成酶、烯醇化酶、硫腺苷甲硫氨酸合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、膜粘连蛋白-2、抗坏血酸过氧化物酶和苹果酸脱氢酶。以上实验结果表明，本发明提供的香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法，不仅可以有效的将香蒲及其假茎中总蛋白质提取出来，而且还能将各蛋白化合物进行有效分离，通过硝酸银染色定性分析和通过质谱可确定蛋白质的具体成分，为香蒲及其假茎蛋白质组学研究提供科学依据，为香蒲及其假茎提供质量控制方法。
实施例2
江苏省淮安市沿湖所种植的香蒲假茎中总蛋白质的提取和双向电泳分析方法，具体包括以下步骤：
(1)采集江苏省淮安市沿湖所种植的香蒲假茎，用超纯水洗净，并用滤纸吸去多余水分，放入液氮中速冻，并移至-80℃冰箱保存备用；
(2)称取5g步骤(1)保藏的香蒲假茎迅速放入冰浴的研钵中，加液氮研磨成细粉，研磨过程中加入0.5g聚乙烯吡咯烷酮，把研磨后的细粉转入-20℃预冷的50ml离心管中，加入3倍体积-20℃预冷的三氯乙酸（TCA）/丙酮溶液，充分混合后，放在-20℃冰箱中静置2小时，备用；其中所述的三氯乙酸（TCA）/丙酮溶液由下列物质组成：质量体积比10%的三氯乙酸，质量体积比0.07%的二硫苏糖醇（DTT），1mmol/L的苯甲基磺酰氟（PMSF），其余溶剂为丙酮。
(3)取步骤(2)得到的香蒲假茎细粉的三氯乙酸（TCA）/丙酮溶液，在35000 转/分钟，4℃离心30min，移去上清液，取沉淀，加入25ml预冷的样品洗涤液，充分混合后，放在-20℃保存1小时，期间间隔涡旋；然后在35000 转/分钟，4℃离心 30min，移去上清液，取沉淀，再加入25 ml -20℃预冷的样品洗涤液，充分混合后，放在-20℃保存1小时，期间间隔涡旋；然后在35000转/分钟，4℃离心 30min，去掉上清液后，用滤纸将离心管封口，真空冷冻干燥，得到香蒲假茎蛋白粉；备用；其中所述的样品洗涤液由下列物质组成：质量体积比0.07% 的二硫苏糖醇和1mmol/L的苯甲基磺酰氟，其余溶剂为丙酮。
(4)取步骤(3)得到的香蒲假茎蛋白粉在4℃溶于样品裂解液中1 小时，期间在裂解液中加玻璃珠，并用超声波超声三次，每次3分钟；然后在35000转/分钟，4℃离心 30min，得到上清液；然后用3倍体积预冷的样品洗涤液在-20℃沉淀1小时，然后再在35000转/分钟，4℃、离心30min，弃上清液，得离心沉淀后溶解于样品裂解液，在4℃溶解1小时，然后在35000转/分钟，4℃离心 30min，取上清液，得到香蒲假茎蛋白质提取液，备用；其中样品裂解液由下列物质组成：7mol/L的尿素、2mol/的硫脲、质量体积比4%的3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸（CHAPS）、65mmol/L的二硫苏糖醇、1mmol/L苯甲基磺酰氟、体积比0.2%的载体两性电解质（carrier ampholytes, GE），实验过程中裂解液需现用现配。
(5)取步骤(4)得到的香蒲假茎蛋白质提取液，采用Bradford 法测定其蛋白浓度，对蛋白质进行定量；
(6)取步骤(4)得到的香蒲假茎蛋白质提取液进行电泳分析:
第一向等电聚焦电泳：按上样量500μg，上样体积450μl，用水化液对已定量好的香蒲假茎蛋白样品进行稀释；将香蒲假茎蛋白样品加入水化盘内后，再将线性IPG胶条（pH 4-7，24cm，GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA）胶面向下放入水化盘中，除去胶面与蛋白样品液间的气泡，每个胶条用7ml矿物油覆盖胶条，进行水化；水化结束后进行等电聚焦（等电聚焦的参数设置如下：30伏水化，12小时；200伏（升压模式为step-n-hold），1小时；500伏（升压模式为step-n-hold），1小时；2000伏（升压模式为step-n-hold），1小时；8000伏（升压模式为gradiet），4小时；8000伏（升压模式为step-n-hold），60000Vh；500伏（升压模式为step-n-hold，保持）；其中所述的水化液由下列物质组成：7mol/L的尿素、2mol/的硫脲、质量体积比2%的3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸（CHAPS）、65mmol/L的二硫苏糖醇、体积比0.2%的载体两性电解质。实验过程中水化液需现用现配。
(7)胶条平衡处理：将步骤(6)等电聚焦完成后的IPG胶条进行平衡2次，每次平衡时间为15min，二次平衡缓冲液配制如下：
胶条平衡缓冲液母液：6mol/L的尿素，质量体积比2%的十二烷基磺酸钠（SDS），0.375mol/L的Tris-HCl（pH为8.8），体积比30%甘油，溶剂为水；
第一次胶条平衡缓冲液
为：每1ml胶条平衡缓冲液母液加入20mg 二硫苏糖醇(DTT)；
第二次胶条平衡缓冲液
为：每1ml胶条平衡缓冲液母液加入25mg碘乙酰胺；
第二向聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳：将平衡后的胶条置于胶浓度为12.5%（质量体积比）的SDS-PAGE凝胶上，用浓度为0.5%（质量体积比）低熔点琼脂糖的封胶液封住顶部,其中琼脂糖中含有质量体积比为0.002%的溴酚蓝，然后按如下参数进行电泳：16℃恒温，恒功率条件下，用2瓦/根胶条电泳1.5h，再用12瓦/根胶条电泳4~6h，直到溴酚蓝移动到需要的位置为止；其中电极缓冲液配制方法如下：按质量体积比0.1%的十二烷基硫酸钠，0.025mol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)和0.192mol/L的甘氨酸进行配制，溶剂为水，并调制pH值为8.3。
并且第二向SDS-PAGE电泳中聚丙烯酰胺凝胶的溶剂由体积比为31：42：25：1：1：0.14的水、质量体积比30%丙烯酰胺、0.375mol/L的Tris-HCl（pH为8.8）、质量体积比为10%的十二烷基硫酸钠、质量体积比为10%的过硫酸铵和体积比为10%的四甲基乙二胺组成。
(8)电泳结束后对胶条采用硝酸银法进行染色分析，具体程序如下：
步骤a：将电泳结束后凝胶条放入盛有超纯水的染色盘中，用超纯水在摇床上洗3次，每次10min；
步骤b：然后加入100ml 冰乙酸、400ml无水乙醇、加水至1000ml固定2h或过夜；
步骤c: 然后取2g 硫代硫酸钠，112.72g 三水合乙酸钠，300ml无水乙醇，加水
至1000ml将胶条敏化30min；然后再用600ml 超纯水漂洗三遍，每次5~10 min；
步骤d： 然后将2.5g 硝酸银溶于1000ml水，避光条件下对胶条染色30min；然后用600ml 超纯水漂洗二遍，每次1~5min；
步骤e：然后用25g 无水碳酸钠，0.4ml 甲醛，加水至1000ml，显色共2次；第一次待溶液变黄后倒掉，第二次显色到蛋白质点显现到理想的程度和清晰度为止；
步骤f：最后将凝胶条放入由14.6g Na2EDTA溶于1000ml体积的水制成的终止液中终止10min以上或过夜，即可。
通过上述方法对江苏省淮安市沿湖所种植的香蒲假茎总蛋白质进行提取和双向电泳分离，具体实验结果如图2所示，该图表明香蒲假茎总蛋白质样品分离效果好，图谱清晰，蛋白点多，无横向、纵向条纹，经PDQuest软件点检测和分析，蛋白点多于1000个。并且图2中横向为等电聚焦，横向数字为蛋白质凝胶等电点分布；纵向为SDS-PAGE，纵向数字为蛋白质分子量标准，单位是kD，经质谱确定图2中蛋白点1、2、3、4、5、6、7和8分别为：甲硫氨酸合成酶、烯醇化酶、硫腺苷甲硫氨酸合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、膜粘连蛋白-2、抗坏血酸过氧化物酶和苹果酸脱氢酶。以上实验结果表明，本发明提供的香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法，可以有效的对香蒲及其假茎中总蛋白质进行提取、分离和鉴定，该方法重复性和稳定性好，可作为鉴别香蒲真伪及其质量控制用，为实现香蒲科学化种植、培育和开发利用提供科学依据。
以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (5)
1.香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)采集香蒲假茎，用超纯水洗净，并用滤纸吸去多余水分，放入液氮中速冻，并移至-80℃冰箱保存备用；
(2)称取5g步骤(1)保藏的香蒲假茎迅速放入冰浴的研钵中，加液氮研磨成细粉，研磨过程中加入0.5g聚乙烯吡咯烷酮，把研磨后的细粉转入-20℃预冷的50ml离心管中，加入3倍体积-20℃预冷的三氯乙酸/丙酮溶液，充分混合后，放在-20℃冰箱中静置2小时，备用；
(3)取步骤(2)得到的香蒲假茎细粉的三氯乙酸/丙酮溶液，在35000转/分钟，4℃离心30min，移去上清液，取沉淀，加入25ml预冷的样品洗涤液，充分混合后，放在-20℃保存1小时，期间间隔涡旋；然后在35000转/分钟，4℃离心30min，移去上清液，取沉淀，再加入25ml-20℃预冷的样品洗涤液，充分混合后，放在-20℃保存1小时，期间间隔涡旋；然后在35000转/分钟，4℃离心30min，去掉上清液后，用滤纸将离心管封口，真空冷冻干燥，得到香蒲假茎蛋白粉；备用；
(4)取步骤(3)得到的香蒲假茎蛋白粉在4℃溶于样品裂解液中1小时，期间在裂解液中加玻璃珠，并用超声波超声三次，每次3分钟；然后在35000转/分钟，4℃离心30min，得到上清液；然后用3倍体积预冷的样品洗涤液在-20℃沉淀1小时，然后再在35000转/分钟，4℃、离心30min，弃上清液，得离心沉淀后溶解于样品裂解液，在4℃溶解1小时，然后在35000转/分钟，4℃离心30min，取上清液，得到香蒲假茎蛋白质提取液，备用；
(5)取步骤(4)得到的香蒲假茎蛋白质提取液，采用考马斯亮兰法测定其蛋白浓度，对蛋白质进行定量；
(6)取步骤(4)得到的香蒲假茎蛋白质提取液进行电泳分析：
第一向等电聚焦电泳：按上样量500μg，上样体积450μl,用水化液对已定量好的香蒲假茎蛋白样品进行稀释；将香蒲假茎蛋白样品加入水化盘内后，再将线性IPG胶条胶面向下放入水化盘中，除去胶面与蛋白样品液间的气泡，每个胶条用7ml矿物油覆盖胶条，进行水化；水化结束后进行等电聚焦；
(7)胶条平衡处理：将步骤(6)等电聚焦完成后的IPG胶条进行平衡2次，每次平衡时间为15min，二次平衡缓冲液的配制分别如下：
胶条平衡缓冲液母液组成：6mol/L的尿素，质量体积比2%的十二烷基磺酸钠，0.375mol/L的Tris-HCl，体积比30%甘油，溶剂为水；
第一次胶条平衡缓冲液I为：每1ml胶条平衡缓冲液母液加入20mg二硫苏糖醇；
第二次胶条平衡缓冲液II为：每1ml胶条平衡缓冲液母液加入25mg碘乙酰胺；
第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳：将平衡后的胶条置于胶浓度为12.5%的SDS-PAGE凝胶上，用浓度为0.5%低熔点琼脂糖的封胶液封住顶部，其中琼脂糖中含有质量体积比为0.002%的溴酚蓝，然后按如下参数进行电泳：16℃恒温，恒功率条件下，用2瓦/根胶条电泳1.5h，再用12瓦/根胶条电泳4～6h，直到溴酚蓝移动到需要的位置为止；
(8)电泳结束后对蛋白采用硝酸银法进行染色分析或对蛋白质进行质谱检测和分析；
以上所述的三氯乙酸/丙酮溶液由下列物质组成：质量体积比10%的三氯乙酸，质量体积比0.07%的二硫苏糖醇，1mmol/L的苯甲基磺酰氟，其余溶剂为丙酮；
以上所述的样品洗涤液由下列物质组成：质量体积比0.07%的二硫苏糖醇和1mmol/L的苯甲基磺酰氟，其余溶剂为丙酮；
以上所述的样品裂解液由下列物质组成：7mol/L的尿素、2mol/L的硫脲、质量体积比4%的3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、65mmol/L的二硫苏糖醇、1mmol/L苯甲基磺酰氟、体积比0.2%的载体两性电解质，溶剂为水。
2.根据权利要求1所述的香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法，其特征在于，步骤(6)所述的水化液由下列物质组成：7mol/L的尿素、2mol/L的硫脲、质量体积比2%的3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、65mmol/L的二硫苏糖醇、体积比0.2%的载体两性电解质，溶剂为水。
3.根据权利要求1所述的香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法，其特征在于，步骤(6)所述的等电聚焦的参数设置如下：30伏水化，12小时；200伏，1小时；500伏，1小时；2000伏1小时；8000伏，4小时；8000伏，60000Vh；500伏，保持。
4.根据权利要求1所述的香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法，其特征在于，步骤(7)第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳中聚丙烯酰胺凝胶的溶剂由体积比为31：42：25：1：1：0.14的水、质量体积比30%丙烯酰胺、0.375mol/L的Tris-HCl、质量体积比为10%的十二烷基硫酸钠、质量体积比为10%的过硫酸铵和体积比为10%的四甲基乙二胺组成。
5.根据权利要求1所述的香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法，其特征在于，步骤(8)中所述的硝酸银染色分析方法程序如下：
步骤a：将电泳结束后凝胶条放入盛有超纯水的染色盘中，用超纯水于摇床上洗3次，每次10min；
步骤b：然后取100ml冰乙酸、400ml无水乙醇、加水至1000ml固定2h或过夜；
步骤c:然后取2g硫代硫酸钠，112.72g三水合乙酸钠，300ml无水乙醇，加水至1000ml敏化胶条30min；然后再用600ml超纯水漂洗三遍，每次5～10min；
步骤d：然后将2.5g硝酸银溶于1000ml水，避光条件下对胶条染色30min；然后用600ml超纯水漂洗二遍，每次1～5min；
步骤e：然后用25g无水碳酸钠，0.4ml甲醛，加水至1000ml，显色共2次；第一次待溶液变黄后倒掉，第二次显色到蛋白质点显现到理想的程度和清晰度为止；
步骤f：最后将凝胶条放入由14.6gNa2EDTA溶于1000ml体积的水制成的终止液中终止10min以上或过夜，即可。
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