CN1872871A - 一种制备裸子植物花粉管全蛋白双向电泳样品的方法 - Google Patents
一种制备裸子植物花粉管全蛋白双向电泳样品的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1872871A CN1872871A CN 200610089309 CN200610089309A CN1872871A CN 1872871 A CN1872871 A CN 1872871A CN 200610089309 CN200610089309 CN 200610089309 CN 200610089309 A CN200610089309 A CN 200610089309A CN 1872871 A CN1872871 A CN 1872871A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gymnosperm
- whole protein
- pollen tube
- lysis buffer
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 57
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 57
- 241000218631 Coniferophyta Species 0.000 title claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 238000004720 dielectrophoresis Methods 0.000 title claims description 16
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 42
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 claims abstract description 18
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims abstract description 18
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 claims description 23
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 22
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 15
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 14
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 13
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 12
- 241001236247 Pinus bungeana Species 0.000 claims description 10
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 4
- 241000196115 Cycadopsida Species 0.000 claims description 3
- 235000011201 Ginkgo Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000008100 Ginkgo biloba Nutrition 0.000 claims description 2
- 244000194101 Ginkgo biloba Species 0.000 claims description 2
- 241001236255 Pinus albicaulis Species 0.000 claims description 2
- 241000018650 Pinus massoniana Species 0.000 claims description 2
- 235000011610 Pinus tabuliformis Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000000247 postprecipitation Methods 0.000 claims description 2
- 244000050510 Cunninghamia lanceolata Species 0.000 claims 1
- 240000000163 Cycas revoluta Species 0.000 claims 1
- 235000008601 Cycas revoluta Nutrition 0.000 claims 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 abstract description 15
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 abstract 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 abstract 3
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 abstract 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002390 adhesive tape Substances 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZCCIPPOKBCJFDN-UHFFFAOYSA-N calcium nitrate Chemical compound [Ca+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O ZCCIPPOKBCJFDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 2
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 2
- 241000218922 Magnoliophyta Species 0.000 description 2
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 208000026487 Triploidy Diseases 0.000 description 2
- YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O [4-[[4-(4-ethoxyanilino)phenyl]-[4-[ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]amino]-2-methylphenyl]methylidene]-3-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]-ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]azanium Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C(=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=2C(=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=C1 YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 2
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000351396 Picea asperata Species 0.000 description 1
- 241000218641 Pinaceae Species 0.000 description 1
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 description 1
- 240000007263 Pinus koraiensis Species 0.000 description 1
- 235000011615 Pinus koraiensis Nutrition 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M cyanate Chemical compound [O-]C#N XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 210000002220 organoid Anatomy 0.000 description 1
- KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N propane-1-sulfonic acid Chemical compound CCCS(O)(=O)=O KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006432 protein unfolding Effects 0.000 description 1
- 238000000575 proteomic method Methods 0.000 description 1
- 238000005464 sample preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种制备裸子植物花粉管全蛋白双向电泳样品的方法。该方法包括以下步骤：1)将裸子植物花粉管粉末悬浮于三氯乙酸溶液中，于－20～－4℃下放置；离心后收集沉淀，将该沉淀重悬于丙酮中，－20℃放置2－16小时，离心后收集沉淀，再用80％丙酮溶液洗涤，除去丙酮后得到裸子植物花粉管全蛋白粗提物；2)将步骤1)得到的裸子植物花粉管全蛋白粗提物溶解于裂解缓冲液后，离心取上清得到裸子植物花粉管全蛋白双向电泳样品液。本发明的分离制备裸子植物花粉管全蛋白用于双向电泳的方法快速、简单易行，可获得较高质量而且重复性较好的双向电泳图谱，便于后续的生物质谱分析鉴定蛋白，具有较大的实际应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备裸子植物花粉管全蛋白的方法，特别涉及一种制备裸子植物花粉管全蛋白双向电泳样品的方法。
背景技术
花粉管作为有花植物受精过程中雄性生殖单位的载体，具有典型的极性生长特征，因而是研究细胞形态建成、囊泡及细胞器运动以及信号转导途径的理想模式体系。蛋白质组分析是研究花粉管中蛋白质对细胞自身变化及环境刺激响应的重要技术手段，有利于深入了解高等植物有性生殖过程以及细胞极性生长机理。
选择合适的样品制备方法是决定蛋白质组研究成败的关键步骤。细胞必须进行有效的破碎，同时还要去除杂质并尽量避免蛋白样品的降解。裸子植物花粉管中富含多糖、脂类、核酸等干扰双向电泳过程的杂质。迄今为止还没有制备裸子植物花粉管全蛋白样品用于双向电泳的有效方法和技术，从而导致与裸子植物相关的蛋白质组研究相对被子植物而言比较滞后。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备较高质量的裸子植物花粉管全蛋白双向电泳样品的方法。
本发明所提供的制备裸子植物花粉管全蛋白双向电泳样品的方法，包括以下步骤：
1)将裸子植物花粉管粉末悬浮于0.1-0.125g/mL三氯乙酸溶液中，于-20--4℃下放置1-2小时；离心后收集沉淀，将该沉淀重悬于含有体积百分含量为0.05-0.07％的巯基乙醇的丙酮溶液中，-20--4℃放置2-16小时，离心后收集沉淀，再用含有体积百分含量为0.05-0.07％的巯基乙醇和体积百分含量为70-80％的丙酮溶液洗涤，除去丙酮后得到裸子植物花粉管全蛋白粗提物；
2)将步骤1)得到的裸子植物花粉管全蛋白粗提物溶解于裂解缓冲液后，离心取上清得到裸子植物花粉管全蛋白双向电泳样品液；所述裂解缓冲液为含有5～7mol/L尿素(urea)，1-2mol/L硫脲(thiorea)，0.01-0.02g/mL CHAPS(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonic acid)，体积百分含量为1-2％、pH为3.5-10的两性电解质、质量百分含量为0.6-1％的二硫苏糖醇(DTT)、25-50μg/mL苯甲基磺酰氟(PMSF)的溶液。
所述裸子植物花粉管粉末可通过在液氮中研磨获得。
所述0.1-0.125g/mL三氯乙酸溶液用含有体积百分含量为0.05-0.07％巯基乙醇的丙酮溶液配制。
所述三氯乙酸溶液中三氯乙酸的浓度优选为0.125g/mL。
所述步骤1)中花粉管粉末悬浮于三氯乙酸溶液中于-20℃下放置2小时。
所述步骤1)中含有体积百分含量为0.05-0.07％巯基乙醇的丙酮溶液重悬沉淀后，于-20℃放置2-16小时。
为了获得更好的提取和分离效果，所述裂解缓冲液优选为含有7mol/L尿素(urea)、2mol/L硫脲(thiorea)、0.02g/ml CHAPS、体积百分含量为2％的两性电解质、质量百分含量为1％的二硫苏糖醇(DTT)、50μg/mL苯甲基磺酰氟(PMSF)的溶液。
所述步骤2)中，全蛋白粗提物与裂解缓冲液的质量体积比可为120mg/400μL-150mg/400μL裂解缓冲液，优选为150mg/400μL裂解缓冲液。
为了使尽可能多的蛋白溶解于裂解缓冲液中，可将加入全蛋白粗提物的裂解缓冲液27-37℃下水浴15-30min，然后在室温下于60-150rpm(旋转半径为25mm)的摇床上振荡1小时，15000-17000g收集上清液，即为裸子植物花粉管全蛋白双向电泳样品液。
所述加入全蛋白粗提物的裂解缓冲液的水浴温度优选为27-29℃，水浴时间优选为30min。
上述方法中的离心条件均为在4℃15000rpm(19117g)离心10min。
所述裸子植物可为白皮松、红松、油松、云杉、冷杉等松杉纲、银杏等银杏纲以及苏铁纲的裸子植物；优选为松杉纲，尤其优选为松科裸子植物，特别优选为白杆或白皮松。
本发明的方法采用三氯乙酸和丙酮有效的去除裸子植物花粉管中的多糖、脂类和核酸等干扰双向电泳的杂质。本发明的方法裂解缓冲液中的尿素可以使蛋白质去折叠暴露疏水核心，而配合使用硫脲会增加蛋白质在固定pH梯度(IPGs)胶条中的溶解性，二硫苏糖醇还原二硫键从而使蛋白质达到完全溶解的状态，载体两性电解质能清除氰酸盐离子、离心时加速核酸沉淀，而PMSF则能够有效的防止样品制备过程中蛋白的降解。
本发明的制备裸子植物花粉管全蛋白样品的方法快速、简单易行，可获得较高质量的重复性较好的双向电泳图谱，便于后续的生物质谱分析鉴定蛋白，具有较大的实际应用价值。
附图说明
图1为白杆花粉管全蛋白样品双向电泳图谱
图2为白皮松花粉管全蛋白样品双向电泳图谱
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的浓度，如无特别说明，均为体积百分比(V/V)。
实施例1、制备白杆花粉管全蛋白双向电泳样品液并进行双向电泳分析
1)过滤收集用液体培养基(0.0001g/mL硼酸，0.0003g/mL硝酸钙，0.12g/mL蔗糖)培养白杆花粉粒22小时得到的花粉管，液氮快速研磨成粉末；
2)将步骤1)得到的粉末悬浮于含有0.125g/ml三氯乙酸和0.07％的巯基乙醇的丙酮溶液中，于-20℃下放置2小时；
3)4℃15000rpm(19117g)离心10min，弃除上清液，将沉淀重悬于三倍体积的-20℃预冷过的含0.07％的巯基乙醇的丙酮溶液中，-20℃放置16小时；
4)4℃15000rpm(19117g)离心10min，弃除上清液，将沉淀重悬于含0.07％的巯基乙醇和80％丙酮的溶液中，-20℃放置1h；
5)离心弃除上清液，得到沉淀，再重复步骤4)1-2次。待丙酮挥发完后，得到全蛋白粗提物干粉，用裂解缓冲液按照400μL/150mg干粉的量溶解全蛋白粗提物干粉，29℃水浴半小时后，室温于60-150rpm(旋转半径为25mm)的摇床上振荡1小时，使全蛋白粗提物干粉充分溶解，之后17000g室温离心取上清，即为白杆花粉管全蛋白双向电泳样品液；裂解缓冲液是含有7mol/L尿素(urea)、2mol/L硫脲(thiorea)、0.02g/ml CHAPS、2％两性电解质(ampholine pH3.5-10)、质量百分比为1％的二硫苏糖醇(DTT)和50μg/mL苯甲基磺酰氟(PMSF)的溶液。
6)通过上述过程提取的蛋白质，用Bradford法紫外分光光度计测定蛋白浓度，结果表明上述得到的白杆花粉管全蛋白双向电泳样品液中蛋白浓度为4-6μg/μL。按照如下方法进行双向电泳：利用EttanTM IPGphor IITM Isoelectric FocusingSystem(通用电气医疗集团，USA)在20℃进行第一向等电聚焦电泳。电泳条件为：500V电泳1h，随后1000V电泳1h，最后8000V电泳8.3h，总伏时数达到64000V×h。然后将聚焦后的固定pH梯度胶条在10mL平衡缓冲液1(50mmol/LTris-Cl缓冲液，pH8.8；6mol/L urea；30％甘油，0.02g/mL SDS，0.01g/mL二硫苏糖醇)中平衡15min，然后在10mL平衡缓冲液2(50mmol/L Tris-Cl缓冲液，pH8.8；6mol/L urea；30％甘油，0.02g/mL SDS，0.25g/mL碘乙酰胺)中平衡30min。将平衡后的胶条转移到第二向凝胶上。第二向电泳利用Ettan DALTsixsystem(通用电气医疗集团，USA)在12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行(平均每块凝胶25mA恒流电泳，溴芬兰指示剂跑出凝胶时电泳结束)。凝胶用考马斯亮蓝R-250染色后，乙醇/醋酸系统脱色。结果如图1所示，结果表明该裸子植物花粉管蛋白样品分离效果较好，没有发生明显的蛋白降解。图1中MW为蛋白质分子量标准，单位是kD。
实施例2、分离制备裸子植物白皮松花粉管全蛋白样品并进行双向电泳分析
1)过滤收集用液体培养基(0.0001/mL硼酸，0.0003g/mL硝酸钙，0.12g/mL蔗糖)培养白皮松花粉粒22小时得到的花粉管，液氮快速研磨成粉末；
2)将步骤1)得到的粉末悬浮于含有0.1g/ml三氯乙酸和0.05％的巯基乙醇的丙酮溶液中，于-10℃下放置1小时；
3)4℃15000rpm(19117g)离心10min，弃除上清液，将沉淀重悬于三倍体积的-20℃预冷过的含0.05％的巯基乙醇的丙酮溶液中，-10℃放置12小时；
4)4℃15000rpm(19117g)离心10min，弃除上清液，将沉淀重悬于含0.07％的巯基乙醇和75％丙酮的溶液中，-20℃放置1h；
5)离心弃除上清液，得到沉淀，再重复步骤4)1-2次。待丙酮挥发完后，得到全蛋白粗提物干粉，用裂解缓冲液按照400μL/150mg干粉的量溶解全蛋白粗提物干粉，29℃水浴半小时后，室温于60-150rpm(旋转半径为25mm)的摇床上振荡1小时，使全蛋白粗提物干粉充分溶解，之后17000g室温离心取上清，即为白皮松花粉管全蛋白双向电泳样品液；裂解缓冲液是含有5mol/L尿素(urea)、1mol/L硫脲(thiorea)、0.01g/ml CHAPS、1％两性电解质(ampholine pH3.5-10)、质量百分比为0.6％的二硫苏糖醇(DTT)和25μg/mL苯甲基磺酰氟(PMSF)的溶液。
6)通过上述过程提取的蛋白质，用Bradford法紫外分光光度计测定蛋白浓度，结果表明上述得到的白皮松花粉管全蛋白双向电泳样品液中蛋白浓度为4-6μg/μL。按照如下方法进行双向电泳：利用EttanTM IPGphor IITM IsoelectricFocusing System(通用电气医疗集团，USA)在20℃进行第一向等电聚焦电泳。电泳条件为：500V电泳1h，随后1000V电泳1h，最后8000V电泳8.3h，总伏时数达到64000V×h。然后将聚焦后的固定pH梯度胶条在10mL平衡缓冲液1(50mmol/L Tris-Cl缓冲液，pH8.8；6mol/L urea；30％甘油，0.02g/mL SDS，0.01g/mL二硫苏糖醇)中平衡15min，然后在10mL平衡缓冲液2(50mmol/L Tris-Cl缓冲液，pH 8.8；6mol/L urea；30％甘油，0.02g/mL SDS，0.25g/mL碘乙酰胺)中平衡30min。将平衡后的胶条转移到第二向凝胶上。第二向电泳利用Ettan DALTsixsystem(通用电气医疗集团，USA)在12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行(平均每块凝胶25mA恒流电泳，溴芬兰指示剂跑出凝胶时电泳结束)。凝胶用考马斯亮蓝R-250染色后，乙醇/醋酸系统脱色。结果如图2所示，结果表明该白皮松花粉管蛋白样品的双向电泳样品分离效果较好，没有发生明显的蛋白降解。图2中MW为蛋白质分子量标准，单位是kD。
Claims (10)
1、一种制备裸子植物花粉管全蛋白双向电泳样品的方法，包括以下步骤：
1)将裸子植物花粉管粉末悬浮于0.1-0.125g/mL三氯乙酸溶液中，于-20--4℃下放置1-2小时；离心后收集沉淀，将该沉淀重悬于含有体积百分含量为0.05-0.07％的巯基乙醇的丙酮溶液中，-20--4℃放置2-16小时，离心后收集沉淀，再用含有体积百分含量为0.05-0.07％的巯基乙醇和体积百分含量为70-80％的丙酮的溶液洗涤，除去丙酮后得到裸子植物花粉管全蛋白粗提物；
2)将步骤1)得到的裸子植物花粉管全蛋白粗提物溶解于裂解缓冲液后，离心取上清得到裸子植物花粉管全蛋白双向电泳样品液；所述裂解缓冲液为含有5-7mol/L尿素，1-2mol/L硫脲，0.01-0.02g/mL CHAPS，体积百分含量为1-2％、pH为3.5-10的两性电解质、质量百分含量为0.6-1％的二硫苏糖醇、25-50μg/mL苯甲基磺酰氟的溶液。
2、根据权利要求1所述的制备裸子植物花粉管全蛋白样品的方法，其特征在于：所述0.1-0.125g/mL三氯乙酸溶液用含有体积百分含量为0.05-0.07％巯基乙醇的丙酮溶液配制。
3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述三氯乙酸溶液中三氯乙酸的浓度为0.125g/mL。
4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述裂解缓冲液为含有7mol/L尿素、2mol/L硫脲、0.02g/mL CHAPS、体积百分含量为2％的两性电解质、质量百分含量为1％的二硫苏糖醇、50μg/mL苯甲基磺酰氟的溶液。
5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中花粉管粉末悬浮于三氯乙酸溶液中于-20℃下放置2小时；所述步骤1)中含有体积百分含量为0.05-0.07％巯基乙醇的丙酮溶液重悬沉淀后，于-20℃放置2-16小时。
6、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，全蛋白粗提物与裂解缓冲液的质量体积比为100mg/400μl-150mg/400μl裂解缓冲液，优选为150mg/400μl裂解缓冲液。
7、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述全蛋白粗提物溶解于裂解缓冲液的步骤是将加入全蛋白粗提物的裂解缓冲液27-37℃下水浴15-30min，然后在室温下于旋转半径为25mm、60-150rpm的摇床上振荡1小时，15000-17000g收集上清液，即得到裸子植物花粉管全蛋白双向电泳样品液。
8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述加入全蛋白粗提物的裂解缓冲液的水浴温度为27-29℃，水浴时间为30min。
9、根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于：所述裸子植物为松杉纲、银杏纲或苏铁纲的裸子植物；所述松杉纲裸子植物为白杆、青杆、白皮松或油松；所述银杏纲裸子植物为银杏；所述苏铁纲裸子植物为苏铁。
10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述裸子植物为白杆或白皮松。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2006100893098A CN100436476C (zh) | 2006-06-16 | 2006-06-16 | 一种制备裸子植物花粉管全蛋白双向电泳样品的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2006100893098A CN100436476C (zh) | 2006-06-16 | 2006-06-16 | 一种制备裸子植物花粉管全蛋白双向电泳样品的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1872871A true CN1872871A (zh) | 2006-12-06 |
| CN100436476C CN100436476C (zh) | 2008-11-26 |
Family
ID=37483488
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB2006100893098A Expired - Fee Related CN100436476C (zh) | 2006-06-16 | 2006-06-16 | 一种制备裸子植物花粉管全蛋白双向电泳样品的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN100436476C (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101865796A (zh) * | 2010-06-09 | 2010-10-20 | 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 | 一种蛋白标样的制备方法及蛋白裂解液 |
| CN102241730A (zh) * | 2011-05-18 | 2011-11-16 | 淮阴师范学院 | 香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法 |
| CN103265613A (zh) * | 2013-03-19 | 2013-08-28 | 中国农业科学院果树研究所 | 一种提取苹果属植物树皮组织全蛋白的方法 |
| CN103900881A (zh) * | 2014-04-01 | 2014-07-02 | 淮阴师范学院 | 适合双向电泳的马尾松针叶蛋白质提取方法 |
| CN106810598A (zh) * | 2017-03-27 | 2017-06-09 | 许昌学院 | 一种淮阴苜蓿蛋白的提取方法 |
-
2006
- 2006-06-16 CN CNB2006100893098A patent/CN100436476C/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101865796A (zh) * | 2010-06-09 | 2010-10-20 | 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 | 一种蛋白标样的制备方法及蛋白裂解液 |
| CN102241730A (zh) * | 2011-05-18 | 2011-11-16 | 淮阴师范学院 | 香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法 |
| CN102241730B (zh) * | 2011-05-18 | 2013-06-05 | 淮阴师范学院 | 香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法 |
| CN103265613A (zh) * | 2013-03-19 | 2013-08-28 | 中国农业科学院果树研究所 | 一种提取苹果属植物树皮组织全蛋白的方法 |
| CN103265613B (zh) * | 2013-03-19 | 2016-05-25 | 中国农业科学院果树研究所 | 一种提取苹果属植物树皮组织全蛋白的方法 |
| CN103900881A (zh) * | 2014-04-01 | 2014-07-02 | 淮阴师范学院 | 适合双向电泳的马尾松针叶蛋白质提取方法 |
| CN106810598A (zh) * | 2017-03-27 | 2017-06-09 | 许昌学院 | 一种淮阴苜蓿蛋白的提取方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN100436476C (zh) | 2008-11-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1872871A (zh) | 一种制备裸子植物花粉管全蛋白双向电泳样品的方法 | |
| WO2014145075A9 (en) | Methods and devices for high throughpout purification | |
| DE3644651A1 (de) | Aktives traegermaterial fuer die chromatographie | |
| AU596938B2 (en) | High resolution electrophoretic gel and method for separating serum proteins | |
| JP5926484B2 (ja) | グリコサミノグリカンの新規な分析方法 | |
| CN106478810A (zh) | 一种同时分离纯化试剂级的藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白的方法 | |
| CA2471026A1 (en) | Method of electrophoresing protein | |
| CN104697831B (zh) | 生物膜蛋白质的提取方法和电泳样品的制备方法 | |
| EP2682458B1 (en) | Cell sheet having hyaluronic acid production ability and method for preparing the same | |
| WO2019103548A2 (ko) | 반건식 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 세포밖 소포체의 분리 방법 | |
| CN1793340A (zh) | 一种分离细胞的方法及专用细胞分离液 | |
| CN101575370A (zh) | 一种富集血清中低丰度蛋白的方法 | |
| CN104984739B (zh) | 一种明胶亲和层析介质的制备方法及其应用 | |
| CN114736855B (zh) | 一种干细胞外泌体高纯度提取方法 | |
| CN101010334A (zh) | 分级装置 | |
| CN102359901A (zh) | 一种适合双向电泳的克氏原螯虾卵巢组织总蛋白样品制备方法 | |
| CN114990103B (zh) | 改良高盐-低pH法提取灯盏细辛叶绿体基因组DNA的方法 | |
| CN109439654A (zh) | 一种免前处理自动化提取大体积全血dna的方法 | |
| CN1333294A (zh) | 一种新的提取纯化羊胎素工艺和检测其生物活性的方法 | |
| CN103278370A (zh) | 一种适合于双向电泳的大小鼠睾丸组织样品全蛋白提取和分离的方法 | |
| JP7426026B2 (ja) | 試料前処理方法及び分析方法 | |
| JP4273998B2 (ja) | プロテオーム解析用試料の調製方法 | |
| CN113373025A (zh) | 一种适于捕获稀有细胞的涂层组合物、装置及方法 | |
| BR102020004927A2 (pt) | Adsorvente monolítico macroporoso polimérico funcionalizado com anilina, seu processo de obtenção e aplicação. | |
| CN104478999A (zh) | 一种适于蛋白质组学的牛支原体外膜蛋白提取方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20081126 |