CN107219288B - 一种采用蛋白质比对鉴定栝楼籽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种采用蛋白质比对鉴定栝楼籽的方法，步骤是：A、栝楼籽蛋白质提取：称取栝楼籽，倒入预冷研钵，在液氮中研磨成粉末；B、将粉末转入到离心管中，加入蛋白提取液；C、加入等体积的Tris‑饱和酚，冰浴，振荡，混匀；D、样品放入低温离心机，离心，取酚相，酚相收集到离心管中；E、向酚相中加入乙酸铵甲醇溶液，混匀，离心，弃上清，沉淀用乙酸铵甲醇溶液洗涤，获得蛋白质干粉；F、栝楼籽蛋白质电泳：得到的样本蛋白质干粉，加入等量的裂解液进行裂解后，采用Bradford法测定每个样本的蛋白质含量，进行考马斯亮蓝染色，并脱色，采集图像，对比蛋白胶特征条带，进行栝楼籽鉴定，该方法易行，操作简便，节省检测时间。

Description

一种采用蛋白质比对鉴定栝楼籽的方法
技术领域
本发明属于农业生物技术工程领域，更具体涉及一种采用蛋白质条带比对进行栝楼籽品种鉴定的方法，适用于栝楼籽品种鉴定。
背景技术
栝楼籽又名栝楼仁，为葫芦科植物栝楼(Trichosanthes kirilowii Maxim.)或双边栝楼(Trichosan thes rosthornii Harms)的干燥成熟种籽。秋季采摘成熟果实，剖开，取出种籽，洗净，晒干。
栝楼籽具润肺化痰，滑肠通便之功效，用于燥咳痰粘，肠燥便秘。现在药理研究表明，它具有扩张冠状动脉，增加冠脉流量，保护缺血心肌，抗炎，抗肿瘤和泻下、抗血栓与动脉硬化、调节血糖等功效，具有较强的抗血小板凝集作用。栝楼籽的主要有效成分包括油脂和有机酸类、甾醇类和萜类、氨基酸和蛋白质以及微量元素和矿物质，可见栝楼籽具有较高的营养价值。近年休闲食品栝楼籽在大中城市得到普通认可，可作为常用大宗中药材和可口的炒食，每公斤售价达到60－80元，位于浏阳生物医药园的食品企业盐津铺籽加工栝楼籽，且销路很好，是天然的绿色休闲保健食品，产品在市场供不应求。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种采用蛋白质比对鉴定栝楼籽的方法，通过采用蛋白质条带比对，操作简便，省时省力的鉴定，该方法易行，操作简便，节省检测时间。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
一种采用蛋白质比对鉴定栝楼籽的方法，其步骤是：
A、栝楼籽蛋白质提取：称取0.5g栝楼籽样本(去种皮)，倒入预冷研钵，在液氮中研磨成粉末(至少一百目，附：液氮研磨的鲜样是无法过筛的)，以研磨到奶粉状为宜。
B、将粉末转入到离心管中，加入2－4倍体积蛋白提取液，所述的蛋白质提取液为500mMTris，50MmEDTA,700mM蔗糖，100mMKCl,PH8.0，振荡28－32min，混匀。
C、加入等体积的Tris-饱和酚，冰浴，振荡28－32min，使之充分混匀。
D、样品(样品就是包括栝楼籽粉末以及蛋白质提取液，以及Tris-饱和酚溶液的离心管)放入低温离心机(eppendorf Centrifuge 5424R)4℃，12000rpm离心28－32min，取酚相(上层液)。余下的沉淀和液体再加入Tris-饱和酚，重复本步骤1－2次，酚相收集到同一离心管中。
E、向酚相中加入2－4倍体积的0.1M乙酸铵甲醇溶液，充分混匀，立即可见白色絮状沉淀，并在-20℃沉淀过夜后样品放入低温离心机(eppendorf Centrifuge 5424R)4℃，12000rpm离心28－32min，弃上清。沉淀用0.1M乙酸铵甲醇溶液洗涤4℃，12000rpm离心14－16min，弃上清，重复本步骤1－2次。沉淀用预冷丙酮洗涤4℃，12000rpm离心14－16min，弃上清，重复本步骤1－2次，将样品离心管敞口，室温(20－25℃，以下相同)下放置约28－32min，使丙酮挥发。最终得到的沉淀冷冻干燥后置-80℃下保存备用，获得蛋白质干粉。
F、栝楼籽蛋白质电泳：将得到的样本蛋白质干粉，加入等量的裂解液(8M尿素，2M硫脲，4％CHAPS，65mMDTT，2％Bio-lyte)进行裂解后，采用Bradford法(Bradford M M.Arapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities ofprotein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Analyticalbiochemistry,1976,72(1-2):248-254.)测定每个样本的蛋白质含量，按照等量的蛋白量在预制好的蛋白质电泳胶上上样，80V电泳至电泳条带进入分离胶，120V至显色液跑出分离胶。并进行考马斯亮蓝染色，并脱色，采集图像，通过比较分析蛋白胶图像进行栝楼籽鉴定。
G、栝楼籽鉴定：通过对比栝楼籽的特有蛋白质带：45kD－66kD之间的蛋白条带，30kD－45kD之间的蛋白条带，以及20kD－30kD之间的两个蛋白条带为栝楼籽特点蛋白质条带，以此来鉴定栝楼籽。
本发明主要对已收集的不同品系的栝楼籽进行蛋白质的比较分析，通过栝楼蛋白质电泳图谱，以此来鉴定栝楼籽。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
对于栝楼籽鉴定这一个领域还没有相关的文献报导，本发明为栝楼籽的鉴定提供了可行的方法。本发明的优点如下：实验操作简单，不需要通过精密仪器进行深入检测，仅需要通过比较蛋白质条带，并找到栝楼籽特征条带，就能鉴定栝楼籽，既节省了实验成本，又节省了鉴定时间。
附图说明
图1为一种不同品种的栝楼籽蛋白质电泳图。
图2为一种不同来源的栝楼籽蛋白质电泳图。
从图1，图2可以看到，在45kD－66kD之间的蛋白条带，30kD－45kD之间的蛋白条带，以及20kD－30kD之间的两个蛋白条带，均有栝楼籽特点蛋白质条带。
上述附图为蛋白胶通过考马斯亮蓝染色后均为蓝紫色。
具体实施方式
为了能更加清楚的说明本发明的方法，下面对本发明的实验方法做以详细的说明。
实施例1：
一种采用蛋白质比对鉴定栝楼籽的方法，其步骤是：
(1)蛋白质提取：0.5g栝楼籽(去皮)，液氮研磨至细粉；
(2)加入蛋白质提取液，所述的蛋白质提取液为500mMTris，50MmEDTA,700mM蔗糖，100mMKCl,PH8.0；
(3)加入等体积的Tris-饱和酚，冰浴，振荡30min，使之充分混匀。
(4)样品放入低温离心机(eppendorf Centrifuge 5424R)4℃，12000rpm离心30min，取酚相(上层液)。余下的沉淀和液体再加入Tris-饱和酚，重复本步骤2次，酚相收集到同一离心管中。
(5)向酚相中加入34倍体积的0.1M乙酸铵甲醇溶液，充分混匀，立即可见白色絮状沉淀，并在-20℃沉淀过夜后样品放入低温离心机(eppendorf Centrifuge 5424R)4℃，12000rpm离心30min，弃上清。沉淀用0.1M乙酸铵甲醇溶液洗涤4℃，12000rpm离心15min，弃上清，重复本步骤2次。沉淀用预冷丙酮洗涤4℃，12000rpm离心15min，弃上清，重复本步骤2次，将样品离心管敞口，室温下放置约30min，使丙酮挥发。最终得到的蛋白质沉淀冷冻干燥后置-80℃下保存备用，获得蛋白质干粉。
(6)蛋白胶准备：参照分籽克隆手册制备SDS-PAGE电泳胶，15％[含有15％丙烯酰胺:甲叉双丙烯酰胺(29.1:0.9,M:M)电泳溶液]的分离胶及6％[含有6％丙烯酰胺:甲叉双丙烯酰胺(29.1:0.9,M:M)电泳溶液]的浓缩胶，备用。
(7)蛋白质含量测定：采用Bradford法测定每个样本的蛋白质含量，统一每个样本的上样量。
(8)蛋白质电泳：将不同品种的栝楼籽蛋白质样品上样，80V电泳至电泳条带进入分离胶，120V至显色液跑出分离胶。并进行考马斯亮蓝染色，并脱色，采集图像，通过比较分析蛋白胶蛋白条带进行栝楼籽鉴定。
由此可见：不同品种的栝楼籽，都有以下特有蛋白质条带：45kD－66kD之间的蛋白条带，30kD－45kD之间的蛋白条带，以及20kD－30kD之间的两个蛋白条带为栝楼籽特征蛋白质条带。
实施例2：
一种采用蛋白质比对鉴定栝楼籽的方法，其步骤是：
(1)蛋白质提取：0.5g栝楼籽(去皮)，液氮研磨至细粉，加入蛋白质提取液，所述的蛋白质提取液为500mMTris，50MmEDTA,700mM蔗糖，100mMKCl,PH8.0，加入等体积的Tris-饱和酚，冰浴，振荡30min，使之充分混匀。样品放入低温离心机(eppendorf Centrifuge5424R)4℃，12000rpm离心30min，取酚相(上层液)。余下的沉淀和液体再加入Tris-饱和酚，重复本步骤2次，酚相收集到同一离心管中。向酚相中加入3倍体积的0.1M乙酸铵甲醇溶液，充分混匀，立即可见白色絮状沉淀，并在-20℃沉淀过夜后样品放入低温离心机4℃，12000rpm离心30min，弃上清。沉淀用0.1M乙酸铵甲醇溶液洗涤4℃，12000rpm离心15min，弃上清，重复2次。沉淀用预冷丙酮洗涤4℃，12000rpm离心15min，弃上清，重复2次，将样品离心管敞口，室温下放置约30min，使丙酮挥发。最终得到的蛋白质沉淀冷冻干燥后置-80℃下保存备用，获得蛋白质干粉。
(2)蛋白胶准备：参照分籽克隆手册制备SDS-PAGE电泳胶，15％[含有15％丙烯酰胺:甲叉双丙烯酰胺(29.1:0.9,M:M)电泳溶液]的分离胶及6％[含有6％丙烯酰胺:甲叉双丙烯酰胺(29.1:0.9,M:M)电泳溶液]的浓缩胶，备用。
(3)蛋白质含量测定：采用Bradford法测定每个样本的蛋白质含量，统一每个样本的上样量。
(4)蛋白质电泳：将不同来源的栝楼籽蛋白质样品上样，80V电泳至电泳条带进入分离胶，120V至显色液跑出分离胶。并进行考马斯亮蓝染色，并脱色，采集图像，通过比较分析蛋白胶蛋白条带进行栝楼籽鉴定。
由此可见：不同来源的栝楼籽，都有以下特有蛋白质条带：45kD－66kD之间的蛋白条带，30kD－45kD之间的蛋白条带，以及20kD－30kD之间的两个蛋白条带为栝楼籽特征蛋白质条带。

Claims (1)

1.一种采用蛋白质比对鉴定栝楼籽的方法，其特征在于，其步骤是：
栝楼籽蛋白质提取：称取0.5g 栝楼籽样本，倒入预冷研钵，在液氮中研磨成粉末，以研磨到奶粉状；
将粉末转入到离心管中，加入2－4倍体积蛋白质提取液，所述的蛋白质提取液为500mMTris，50MmEDTA, 700mM蔗糖，100mMKCl,PH8.0，振荡28－32min，混匀；
加入等体积的Tris-饱和酚，冰浴，振荡28－32min，混匀；
样品放入低温离心机，离心温度为4℃，转速为12000rpm，离心28－32min，取酚相，余下的沉淀和液体再加入Tris-饱和酚，重复本步骤1－2次，酚相收集到同一离心管中；
向酚相中加入2－4倍体积的0.1M乙酸铵甲醇溶液，混匀，见白色絮状沉淀，并在-20℃沉淀过夜后样品放入低温离心机，离心温度为4℃，转速为12000rpm，离心28－32min，弃上清，沉淀用0.1M乙酸铵甲醇溶液洗涤，离心温度为4℃，转速为12000rpm，离心14－16min，弃上清，重复本步骤1－2次，沉淀用预冷丙酮洗涤，离心温度为4℃，转速为12000rpm，离心14－16min，弃上清，重复本步骤1－2次，将样品离心管敞口，室温下放置28－32min，得到的沉淀冷冻干燥后置-80℃下保存备用，获得蛋白质干粉；
栝楼籽蛋白质电泳：将得到的蛋白质干粉，加入等量的裂解液进行裂解后，采用Bradford法测定每个样本的蛋白质含量，按照等量的蛋白量在预制好的蛋白质电泳胶上上样，80V电泳至电泳条带进入分离胶，120V至显色液跑出分离胶，进行考马斯亮蓝染色，并脱色，采集图像，通过比较分析蛋白胶进行栝楼籽鉴定；
栝楼籽鉴定：通过对比栝楼籽的蛋白质带：45kD－66 kD之间的蛋白条带，30 kD－45kD之间的蛋白条带，以及20 kD－30 kD之间的两个蛋白条带为栝楼籽蛋白质条带，鉴定栝楼籽。
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