CN105601761A - 一种茶枯多糖提取工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种茶枯多糖提取工艺，包括粉碎茶枯、超声波处理、水浴、离心分离、无水乙醇沉淀、离心收集并清洗沉淀、溶解、调节pH值、酶解、TCA溶液沉淀蛋白质、过滤收集上清液、干燥等步骤。本发明工艺由于在采用TCA沉淀蛋白质之前，采用生物酶法对茶枯多糖粗提液进行了预处理，最大化地使多糖和所连接的蛋白质分离开了，所以后续采用TCA沉淀蛋白质的过程中，能最大化地减少茶枯多糖的损耗，提高得率。实验证明，运用本发明工艺提取茶枯多糖，与传统工艺相比，在不降低茶枯多糖纯度的前提下，大大提高了茶枯多糖的得率。本发明具有重要的市场推广前景。

Description

一种茶枯多糖提取工艺
【技术领域】
本发明涉及医药保健领域，具体地涉及一种茶枯多糖提取工艺。
【背景技术】
近年来，多糖在抗衰老、降血脂等方面的应用上有很大的发展。茶籽压榨后副产物即茶枯中含有丰富的生物活性物质，茶枯多糖即是其中之一。茶枯多糖具有很好的自由基清除能力和抗氧化能力，倍受研究人员和消费者的青睐；茶枯多糖的调节血糖、抗血栓、调节免疫等功能也越来越受到重视，对茶枯多糖提取工艺的研究也越来越全面、深入。
在现有的水提法提取茶枯多糖工艺中，由于提取过程中不可避免的会有蛋白质残留其中，且蛋白质杂质的存在会影响茶枯多糖的抗氧化性，为了提取到更纯的茶枯多糖，工艺中设置去蛋白工序，采用向茶枯多糖粗提液中添加三氯乙酸(TCA)溶液促使蛋白质变性沉降而达到去除蛋白质杂质的目的，即可得到较纯的多糖。但是由于茶枯多糖大多以糖蛋白的形式存在，采用添加TCA处理变性沉淀蛋白质杂质的同时，茶枯多糖会也会随着蛋白质一起被沉降下来，造成茶枯多糖的大量损失。
【发明内容】
本发明的目的在于克服现有茶枯多糖提取工艺中会损失大量多糖的技术缺陷，提供一种降低多糖损耗的茶枯多糖提取工艺。
为实现上述目的，本发明提供的茶枯多糖提取工艺，其特征在于包括如下步骤：
1)、将茶枯置于60℃烘箱内干燥8-10小时后粉碎，过60目筛；
2)、取茶枯粉末，加入20倍质量的蒸馏水，将混浊液置于40000Hz超声波中处理20min后，放置于70℃水浴中2小时，不时振摇；
3)、将水浴后的混浊液4000g/min离心分离10min，取上清液加入3倍体积无水乙醇置于4℃静置2小时,4000g/min离心10min，收集并清洗沉淀；
4)、将清洗后的沉淀加入与步骤2)相同量的蒸馏水重新溶解，即为茶枯多糖粗提液，调节pH值，然后向溶液加入一定酶活的蛋白酶，设定温度和时间进行酶解处理；
5)、向酶解处理后的溶液中加入3倍体积的质量百分比浓度为6％的三氯乙酸溶液，20℃静置24h进行蛋白质沉淀、过滤，收集上清液，即为茶枯多糖提取液；
6)、干燥，即得到茶枯多糖。
优选地，步骤4)中所述的pH值为9.0，所述的蛋白酶为蛋白酶A，酶活为250U/mg，加入酶后酶的质量与体系的体积比为0.009g:100mL，反应时间50min，反应温度为37℃。
运用本发明工艺提取茶枯多糖，由于在采用TCA沉淀蛋白质之前，采用生物酶法对茶枯多糖粗提液进行了预处理，最大化地使多糖和所连接的蛋白质分离开了，所以后续采用TCA沉淀蛋白质的过程中，也就最大化地减少了茶枯多糖的损耗，提高了得率。
【附图说明】
图1为酶添加量对茶枯多糖得率及损耗率的影响图；
图2为酶解时间对茶枯多糖得率及损耗率的影响图；
图3为酶的作用温度对茶枯多糖得率及损耗率的影响图；
图4为酶的作用pH值对茶枯多糖得率及损耗率的影响图。
【具体实施方式】
现结合实施例详细说明本发明的技术方案。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实验材料：茶枯，实验前60℃烘干后粉碎，过60目筛备用。
实验试剂：蛋白酶A、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶、无水乙醇、浓硫酸、苯酚、TCA、考马氏亮蓝G-250(称取考马氏亮蓝G-25050mg，加体积百分比浓度为95％乙醇25ml溶解，加体积百分比浓度为85％磷酸50ml，H2O定容到500ml，过滤去除少量未溶解物，4℃保存备用)。
仪器设备：粉碎磨、标准检验筛(规格90目)、电热恒温干燥箱、电子天平、超声波清洗器、数显恒温水浴锅、pH计、紫外线可见分光光度计、电热套、台式高速冷冻离心机。
茶枯多糖含量的测定：采用蒽酮-硫酸法测定多糖含量。
茶枯多糖得率＝蒽酮-硫酸法计算出的茶枯多糖质量(g)/原料茶枯质量(g)×100％
茶枯多糖损耗率＝(加酶液处理前茶枯多糖得率-加酶液处理后茶枯多糖得率)/加酶液处理前茶枯多糖得率×100％
茶枯多糖纯度＝蒽酮-硫酸法计算出的茶枯多糖质量(g)/干燥后得到的茶枯多糖产品质量(g)×100％
实施例1对于是否加酶的显著性分析
制备茶枯多糖粗提液，实验组样品先加木瓜蛋白酶处理后再加入TCA溶液沉淀蛋白质，对照组样品没有加木瓜蛋白酶而直接加入TCA溶液沉淀蛋白质，以两组样品处理前后溶液内茶枯多糖含量变化来计算茶枯多糖损失率，结果见表1。对所得数据进行差异显著性分析，可知加酶组和不加酶组在多糖损失率的降低上是有极显著(P＜0.01)差异的。由此可初步判断，实验假设成立，加木瓜蛋白酶后可以显著降低多糖损失率，有效减少多糖损失。
表1不同处理方法(不加酶/加酶)多糖损失率
实施例2酶的筛选
表2不同生物酶实验所得多糖损失率比较
将四种处理茶枯多糖粗提液的酶酶活均调整至25U/mL液体，由表2可知蛋白酶A处理后多糖损失率最小，链霉蛋白酶处理后多糖损失率较大，且链霉蛋白酶价格较高，综合考虑到作用效果和经济效益，最终选择使用蛋白酶A。
实施例3单因素实验
应用控制变量法并结合相关资料中蛋白酶A的最适作用条件设定实验梯度进行单因素实验。
1、酶的用量
实验选用蛋白酶A，酶活为250U/mg，取0.1g酶定容到100mL使用。
每组均取茶枯多糖粗提液20mL，分别添加酶量为0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL、4.0mL，实验结果见图1。
分析数据可知：酶用量不同对减少多糖损失效果差异极显著(P＜0.01)，并且在2.0mL、2.5mL、3.0mL时对降低多糖损失率效果相对较好，对这三个点(2.0mL、2.5mL、3.0mL)进行差异显著性分析，得到P＞0.05,无显著性差异。从节约成本和获得好的实验效果等方面综合考虑，酶用量选择2.0mL为宜。
2、酶的作用时间
分别设置酶在茶枯多糖粗提液中的作用时间为5min、25min、45min、65min、85min，酶解结束后迅速添加三氯乙酸(TCA)终止酶解反应。测定上清液中多糖含量，结果见图2。
分析数据可知：酶的作用时间不同，各组样品间多糖损失率差异极显著(P＜0.05)。作用45min时，茶枯多糖得率达到13.84％，损失率较小为18.99％，随后作用时间增加而多糖损失率略微降低，因此，确定酶作用时间为45min。
3、酶的作用温度
由相关文献资料可知，蛋白酶A的最适作用温度在37℃左右，因此以37℃为中心向两边放点设置梯度进行实验。分别设置酶的作用温度为17℃、27℃、37℃、47℃、57℃，酶解后结果见图3。
分析数据可知：酶的作用温度不同对减少多糖损失效果差异极显著(P＜0.01)，在37℃是，茶枯多糖得率为13.98％，损耗率为18.22％。实验结果与大多数资料中蛋白酶A的最适作用温度37℃左右一致，综合考虑后选择37℃作为酶的作用温度。
4、酶的作用pH值
查阅相关资料可知蛋白酶A的最适作用pH为7.8～8.5，故酶解前分别调整茶枯多糖提取液的pH值6、7、8、9、10、11，实验结果见图4。
分析数据可知：酶的作用pH值不同对减少多糖损失效果差异极显著(P＝0.00089＜0.01)，pH值为8时，茶枯多糖得率为14.34％，损耗率为16.09％。综合考虑后选择pH8为酶作用溶液的pH。
图4给出的作用pH值是指加酶前调节原液pH分别为6、7、8、9、10、11，由于蛋白酶A本身偏碱性(本实验测得其pH为7.86)，加酶后混合液pH会有所改变，pH变化如表3所示。
表3加酶后溶液pH变化
故单因素分析得到的较适pH8是指调节茶枯多糖粗提液到pH为8,而实际反应液pH应为7.57。
实施例4正交实验
在单因素实验的基础上，采用L9(34)正交试验设计，选茶枯多糖粗提液的pH、蛋白酶A作用的温度、蛋白酶A作用的时间3项作为考察因素，进行3因素4水平试验，选用单因素中所得茶多糖提取过程中生物酶法去蛋白工艺较佳工艺参数作为第二水平，向两边放点，如表4所示。
表4正交试验因素水平表
在单因素实验结果的基础上，采用L9(34)正交试验对茶枯多糖提取过程中生物酶法去蛋白工艺参数进行优化，正交实验设计及实验结果如表5所示。
表5L9(34)正交实验设计及实验结果
对数据进行方差分析，如表6所示。
表6正交方差分析表
由表6极差分析可以看出,提取液的pH是影响多糖得率的最重要因素,其次为酶作用的时间(min)，酶作用的温度(℃)。由正交实验结果,可以得出茶枯多糖提取过程中生物酶法去蛋白最佳条件为A3B2C3,多糖损失率最低。由表6方差分析F检验结果表明，三个因素对茶枯多糖得率的影响都不显著。究其原因可能是本例试验误差大且误差自由度小(仅为2)，使检验的灵敏度低，从而掩盖了考察因素的显著性。由于各因素对增重影响都不显著，不必再进行各因素水平间的多重比较。此时，可直观地从表5中选择平均数大的水平A3、B2、C3组合成最优水平组合A3B2C3即原料pH为9、温度为37℃、酶处理时间为50min为宜，茶枯多糖得率为14.771％，损失率仅为13.569％。
实施例5本发明工艺和传统工艺提取茶枯多糖的效果比较之一
A、本发明工艺
将茶枯20克置于60℃烘箱内干燥8小时后粉碎，过60目筛；取茶枯粉末，加入400mL的蒸馏水，将混浊液置于40000Hz超声波中处理20min后，放置于70℃水浴中2小时，不时振摇；将水浴后的混浊液4000g/min离心分离10min，取上清液加入1200mL无水乙醇置于4℃静置2小时,4000g/min离心10min，收集并清洗沉淀；将清洗后的沉淀加入400mL蒸馏水重新溶解，即为茶枯多糖粗提液，调节pH值至9.0，然后向溶液加入酶活为250U/mg的蛋白酶A0.036g，37℃反应50min；向酶解处理后的溶液中加入1200mL质量百分比浓度为6％的三氯乙酸溶液20℃静置24h，进行蛋白质沉淀、过滤，收集上清液，即为茶枯多糖提取液；干燥，得到茶枯多糖3.492g，纯度为81.74％，得率为14.27％(3.492g*81.74％/20g)。
B、传统工艺
将茶枯20克置于60℃烘箱内干燥8小时后粉碎，过60目筛；取茶枯粉末，加入400mL的蒸馏水，将混浊液置于40000Hz超声波中处理20min后，放置于70℃水浴中2小时，不时振摇；将水浴后的混浊液4000g/min离心分离10min，取上清液加入1200mL无水乙醇置于4℃静置2小时,4000g/min离心10min，收集并清洗沉淀；将清洗后的沉淀加入400mL蒸馏水重新溶解后，向其中加入1200mL质量百分比浓度为6％的三氯乙酸溶液进行蛋白质沉淀，20℃静置24h、过滤，收集上清液，即为茶枯多糖提取液；干燥，得到茶枯多糖2.418g，纯度为80.42％,得率为9.72％(2.418g*80.42％/20g)。
实施例6本发明工艺和传统工艺提取茶枯多糖的效果比较之二
A、本发明工艺
将茶枯60克置于60℃烘箱内干燥10小时后粉碎，过60目筛；取茶枯粉末，加入1200mL的蒸馏水，将混浊液置于40000Hz超声波中处理20min后，放置于70℃水浴中2小时，不时振摇；将水浴后的混浊液4000g/min离心分离10min，取上清液加入3600mL无水乙醇置于4℃静置2小时,4000g/min离心10min，收集并清洗沉淀；将清洗后的沉淀加入1200mL蒸馏水重新溶解，即为茶枯多糖粗提液，调节pH值至9.0，然后向溶液加入酶活为250U/mg的蛋白酶A0.036g，37℃反应50min；向酶解处理后的溶液中加入3600mL质量百分比浓度为6％的三氯乙酸溶液20℃静置24h，进行蛋白质沉淀、过滤，收集上清液，即为茶枯多糖提取液；干燥，得到茶枯多糖10.392g，纯度为79.23％,得率为13.72％(10.392g*79.23％/60g)。
B、传统工艺
将茶枯60克置于60℃烘箱内干燥10小时后粉碎，过60目筛；取茶枯粉末，加入1200mL的蒸馏水，将混浊液置于40000Hz超声波中处理20min后，放置于70℃水浴中2小时，不时振摇；将水浴后的混浊液4000g/min离心分离10min，取上清液加入3600mL无水乙醇置于4℃静置2小时,4000g/min离心10min，收集并清洗沉淀；将清洗后的沉淀加入400mL蒸馏水重新溶解后，向其中加入3600mL质量百分比浓度为6％的三氯乙酸溶液进行蛋白质沉淀，20℃静置24h、过滤，收集上清液，即为茶枯多糖提取液；干燥，得到茶枯多糖7.152g，纯度为79.18％,得率为9.44％(7.152g*79.18％/60g)。
运用本发明工艺提取茶枯多糖，与传统工艺相比，在不降低茶枯多糖纯度的前提下，大大提高了茶枯多糖的得率。

Claims (2)

1.一种茶枯多糖提取工艺，其特征在于包括如下步骤：
1)、将茶枯置于60℃烘箱内干燥8-10小时后粉碎，过60目筛；
2)、取茶枯粉末，加入20倍质量的蒸馏水，将混浊液置于40000Hz超声波中处理20min后，放置于70℃水浴中2小时，不时振摇；
3)、将水浴后的混浊液4000g/min离心分离10min，取上清液加入3倍体积无水乙醇置于4℃静置2小时,4000g/min离心10min，收集并清洗沉淀；
4)、将清洗后的沉淀加入与步骤2)相同量的蒸馏水重新溶解，即为茶枯多糖粗提液，调节pH值，然后向溶液加入一定酶活的蛋白酶，设定温度和时间进行酶解处理；
5)、向酶解处理后的溶液中加入3倍体积的质量百分比浓度为6％的三氯乙酸溶液，20℃静置24h进行蛋白质沉淀、过滤，收集上清液，即为茶枯多糖提取液；
6)、干燥，即得到茶枯多糖。
2.根据权利要求1所述的一种茶枯多糖提取工艺，其特征在于：步骤4)中所述的pH值为9.0，所述的蛋白酶为蛋白酶A，酶活为250U/mg，加入酶后酶的质量与体系的体积比为0.009g:100mL，反应时间50min，反应温度为37℃。
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