CN107176968A - 一种从富硒大豆中富集高硒蛋白组分的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从富硒大豆中富集高硒蛋白组分的方法，包括如下步骤：1、富硒大豆的脱脂；2、去除脱脂豆粉中的非蛋白组分；3、提取11S大豆球蛋白；4、去除11S大豆球蛋白和7S大豆球蛋白以外的蛋白质组分；5、提取7S大豆球蛋白。该方法简单易操作，且可有效地富集高硒蛋白组分，适合于工业化生产。

Description

一种从富硒大豆中富集高硒蛋白组分的方法
技术领域
本发明涉及大豆蛋白提取技术领域，具体涉及一种从富硒大豆中富集高硒蛋白组分的方法。
背景技术
1998年，中国正式实施“国家大豆行动计划”，积极推动大豆产业的发展。大豆营养丰富，特别是蛋白质中氨基酸组成经FAO/WHO氨基酸评分与动物蛋白相当，按沉降系数可将大豆蛋白分为2S、7S、11S、15S，其在大豆蛋白中所占比例分别为8％、35％、52％、5％，即7S、11S两种蛋白占比之和接近90％。目前，大豆已成为世界各国的重要食品和发展畜牧业的重要蛋白质资源。因此，对大豆进行合理科学的开发利用具有重要意义。富硒大豆是指大豆中硒含量高于0.02-0.3mg/kg的大豆。1973年，世界卫生组织(WHO)和国际营养组织确认硒是人和动物体内必需的微量元素之一。大量研究表明很多种疾病都与硒缺乏密切相关，现已确认与硒缺乏相关的疾病达40余种，其中甚至包括癌症、SARS和艾滋病。后续又有诸多文献报道硒具有提高机体抵御氧化损伤能力、提高机体免疫力、预防肿瘤及降低癌症发病率等功效。然而，硒资源的分布却严重地不平衡。在中国的1094个县市中，土壤硒含量达到国际公布正常临界值(0.1mg/kg)的县只有1/3。其中含量小于或等于0.02mg/kg的占29％，为严重缺硒地区。将大豆蛋白这一重要蛋白资源与硒结合，在增加了大豆产业附加值，同时也有助于解决硒资源分布不平衡的问题。
已有文献报道大豆中蛋白的分离方法，例如Thanh采用Tris-HCl缓冲液提取大豆中的11S和7S蛋白；Wolf、Roberts and Briggs、Eldridge and Wolf、Koshiyama也先后尝试不同方法提取大豆蛋白，但他们均未对富硒大豆蛋白提取进行研究，并且关于大豆蛋白中硒提取率的研究尚未有人报道。
发明内容
为了解决上述现有技术存在的问题，本发明提供了一种从富硒大豆中富集高硒蛋白组分的方法，该方法简单易操作，且可有效地富集高硒蛋白组分，适合于工业化生产。
实现本发明上述目的所采用的技术方案为：
一种从富硒大豆中富集高硒蛋白组分的方法，包括如下步骤：
1、富硒大豆的脱脂：
将干燥的富硒大豆籽粒粉碎，得到富硒大豆粉，按照液料比为1g:20-30ml的比例，将石油醚加入富硒大豆粉中，室温下密封搅拌浸提脱脂2-4h，脱脂结束后静置，待沉淀完全后，分离，将所得的沉淀干燥去除石油醚，得到脱脂豆粉；
2、去除脱脂豆粉中的非蛋白组分：
按照料液比为1g:25-35ml的比例，将脱脂豆粉加入0.01-0.05mol/L磷酸氢二钠溶液中，室温下搅拌浸提45-90min，浸提结束后，离心分离，取上清液A，即为大豆蛋白溶液；
3、提取11S大豆球蛋白：
向大豆蛋白溶液中加入NaCl，使NaCl的终浓度为45-55mmol/L，用0.5-1.5mol/L的盐酸溶液调节pH至6-6.5后，离心分离，得沉淀A和上清液B，沉淀A即为11S大豆球蛋白；
4、去除11S大豆球蛋白和7S大豆球蛋白以外的蛋白质组分：
将步骤3所得的上清液B用0.5-1.5momol/L的盐酸溶液调节pH至5-5.5后，离心分离，得沉淀B和上清液C，沉淀B即为11S大豆球蛋白和7S大豆球蛋白以外的蛋白质组分；
5、提取7S大豆球蛋白：
将步骤4所得的上清液C用0.5-1.5momol/L的盐酸溶液调节pH至4.5-5后，离心分离，得沉淀C，沉淀C即为7S大豆球蛋白。
进一步，将步骤1分离所得的上清液回收石油醚进行循环利用。
进一步，离心分离时离心转速3000-3500r/min，离心时间为10min。
进一步，步骤3中，加入NaCl，使NaCl的终浓度为50mmol/L。
进一步，盐酸溶液的浓度为1mol/L。
进一步，步骤3中，用盐酸溶液调节pH至6.4。
进一步，步骤4中，将步骤3所得的上清液B用盐酸溶液调节pH至5.25.
进一步，步骤5中，将步骤4所得的上清液C用盐酸溶液调节pH至4.8。
与现有技术相比，本发明的优点与有益效果在于：
将富硒大豆进行脱脂处理后，进行以下两个处理：①在普通大豆蛋白提取方法的基础上，通过加入NaCl，利用盐溶作用，使7S大豆球蛋白增溶，减少对11S大豆球蛋白的干扰，从而使11S大豆球蛋白得到有效富集；②通过调整pH至5.25，以除去11S大豆球蛋白和7S大豆球蛋白以外的蛋白质组分(这部分蛋白是以2S大豆球蛋白和15S大豆球蛋白为主的混合物)，从而使后续的7S大豆球蛋白富集效率得到提升。试验表明，此种方法得到的11S、7S大豆球蛋白单位质量硒含量分别是脱脂豆粉的3.16倍和2.47倍。
附图说明
图1为不同硒含量的富硒大豆中提取得到的11S、7S大豆球蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图谱。
1泳道为富硒大豆蛋白；2-5泳道分别为1#、2#、3#、4#富硒大豆蛋白中提取得到的11S大豆球蛋白组分；6-9泳道分别为1#、2#、3#、4#富硒大豆蛋白中提取得到的7S大豆球蛋白组分
图2：不同硒含量的富硒大豆提取得到的大豆蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图谱。
1泳道为普通大豆蛋白；2-5泳道分别为1#、2#、3#、4#富硒大豆中提取所得大豆蛋白。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
1、富硒大豆的脱脂：
将干燥的1#富硒大豆(硒含量为3.25±0.09mg/kg)籽粒用粉碎机磨碎至80目，得到富硒大豆粉，称取50g富硒大豆粉，加入1500ml石油醚中，保鲜膜封口后，置于磁力搅拌器上，室温下(25℃)搅拌浸提脱脂2h，脱脂结束后静置，待沉淀完全后，分离，将所得的上清液回收石油醚用于循环利用，将所得的沉淀在通风橱中铺开以挥干石油醚，24h后收集，得到脱脂豆粉，标记为1#脱脂豆粉；
2、去除脱脂豆粉中的非蛋白组分：
称取30g脱脂豆粉，加入1000mL 0.02mol/L的磷酸氢二钠溶液(pH约为8.5)中，室温搅拌浸提45min，浸提结束后，以3000r/min的转速离心10min，取上清液A，即为大豆蛋白溶液，标记1#大豆蛋白溶液；
3、提取11S大豆球蛋白：
向大豆蛋白溶液中加入NaCl，使NaCl的终浓度为50mmol/L，用1mol/L的盐酸溶液调节pH至6.4后，以3000r/min的转速离心10min，分离得沉淀A和上清液B，沉淀A即为11S大豆球蛋白，标记为1#11S大豆球蛋白，冻干备用；
4、去除11S大豆球蛋白和7S大豆球蛋白以外的蛋白质组分：
将步骤3所得的上清液B用1mol/L的盐酸溶液调节pH至5.25后，以3000r/min的转速离心10min，分离得沉淀B和上清液C，沉淀B即为11S大豆球蛋白和7S大豆球蛋白以外的蛋白质组分；
5、提取7S大豆球蛋白：
将步骤4所得的上清液C用1mol/L的盐酸溶液调节pH至4.8后，以3500r/min的转速离心10min，分离得沉淀C，沉淀C即为7S大豆球蛋白，标记为1#7S大豆球蛋白，冻干备用。
实施例2-4
实施例2-4的操作同实施例1，唯一不同的是原料富硒大豆不同，分别为2#富硒大豆、3#富硒大豆和4#富硒大豆，2#富硒大豆、3#富硒大豆和4#富硒大豆的硒含量分别为4.98±0.08mg/kg、7.34±0.04mg/kg、9.87±0.12mg/kg。
一、富硒大豆蛋白组分中蛋白含量测定和纯度检测
1、采用凯氏定氮法(GB/T5009.5-2003)测定各蛋白组分的蛋白含量：
经检测，四种不同硒含量的富硒大豆脱脂得到的脱脂豆粉中蛋白平均含量为43.63±0.1％，提取出的11S和7S大豆球蛋白组分的蛋白平均含量分别为94.03±0.18％和93.73±0.26％，蛋白纯度得到了有效提高。
2、采用SDS-PAGE法检测11S和7S大豆球蛋白纯度及普通大豆和富硒大豆中其蛋白成分的变化。
检测方法具体如下：
2.1、配制试剂：
称取18.17g Tris(三羟甲基氨基甲烷)、0.4g SDS(十二烷基磺酸钠)溶于水，用1mol/L HCl溶液调pH至8.8，定容至100ml，为分离胶缓冲液；
称取6.06g Tris、0.4g SDS溶于水，用1mol/L HCl溶液调pH至6.8，定容至100ml，得浓缩胶缓冲液；
称取30g Acr(丙烯酰胺)和0.8g Bis(甲叉双丙烯酰胺)，用蒸馏水溶解后定容至100ml，得Acr/Bis贮备液；
取4ml双蒸水、1.0ml 0.5mol/L Tris-HCl(pH6.8)缓冲液、0.8ml甘油、1.6ml10wt％SDS溶液、0.4ml巯基乙醇和0.2ml 0.1wt％溴酚蓝溶液，总体积8ml，混匀，作为样品缓冲液，于4℃保存；
称取3.03g Tris、14.14g Gly(甘氨酸)、1.0g SDS溶于水，用HCl溶液调pH至8.3，定容至1000ml，得电极缓冲液；
称取1g考马斯亮蓝R-250溶于250ml甲醇及100ml冰醋酸中，溶解后定容至1000ml，得染色液；
10wt％过硫酸铵溶液用时现配，采用10％(v/v)醋酸溶液脱色。
2.2、检测过程：
将实施例1-4提取得到的1#11S大豆球蛋白、2#11S大豆球蛋白、3#11S大豆球蛋白和4#11S大豆球蛋白溶于样品缓冲液中，配置1mg/ml的1#11S大豆球蛋白样品液、2#11S大豆球蛋白样品液、3#11S大豆球蛋白样品液、4#11S大豆球蛋白样品液。
将实施例1-4提取得到的1#7S大豆球蛋白、2#7S大豆球蛋白、3#7S大豆球蛋白和4#7S大豆球蛋白溶于样品缓冲液中，配置1mg/ml的1#7S大豆球蛋白样品液、2#7S大豆球蛋白样品液、3#7S大豆球蛋白样品液、4#7S大豆球蛋白样品液。
取4ml分离胶缓冲液、6.7ml Acr/Bis贮备液、5.3ml H2O、0.8ml10wt％过硫酸铵溶液和0.008ml TEMED(四甲基乙二胺)，混匀，制得浓度为12.5％的分离胶，迅速沿长玻璃板将分离胶加入两块玻璃板之间，过程中不能出现气泡，加到距短玻璃板上边缘3cm处，立即覆盖2-3mm水层，待分离胶与水之间形成清晰界面，即为聚合完毕。
取1.25ml浓缩胶缓冲液、0.75mlAcr/Bis贮备液、3ml H2O、0.015ml 10wt％过硫酸铵溶液和0.005ml TEMED，混匀，制得浓缩胶，吸去分离胶上面的水分，将配置好的浓缩胶注入分离胶之上，立即插入点样槽模板，待浓缩胶聚合好之后拔出模板，用微量注射器分别吸取5μl标准蛋白样品液、25μl 1#11S大豆球蛋白样品液、25μl 2#11S大豆球蛋白样品液、25μl 3#11S大豆球蛋白样品液、25μl 4#11S大豆球蛋白样品液、25μl 1#7S大豆球蛋白样品液、25μl 2#7S大豆球蛋白样品液、25μl 3#7S大豆球蛋白样品液、25μl 4#7S大豆球蛋白样品液、25μl 1#大豆蛋白溶液、25μl 2#大豆蛋白溶液、25μl 3#大豆蛋白溶液和25μl 4#大豆蛋白溶液，从左至右依次点样。
加样完毕后，向两槽注入上述配制好的电极缓冲液，接通电源，调节电流至15mA，当样品缓冲液中的指示剂溴酚蓝进入分离胶后，加大电流至30mA，电压恒定在80-100V之间，约2h后，指示剂到达距前沿1-2cm时终止电泳。
取出凝胶后在水中浸泡10min，然后浸入染色液中染色，约45min后将凝胶移入脱色液中脱色，每隔0.5h换一次脱色液，待蓝色基本脱掉再继续放在脱色液中浸泡至蛋白条带清晰为止，采用Bandscan软件分析蛋白条带。
2.3、检测结果：
结果如图1和图2所示，从图1可以看出，四种不同硒含量的富硒大豆提取的11S大豆球蛋白的亚基分子量均在35KDa以下，7S大豆球蛋白的亚基分子量在50KDa以上。经Bandscan软件分析，四种不同硒含量的富硒大豆提取的11S大豆球蛋白、7S大豆球蛋白的平均纯度分别为89.14％、91.20％，由此可见，本发明方法分离得到的11S大豆球蛋白和7S大豆球蛋白的纯度很高。
从图2可以看出，普通大豆和不同硒含量的富硒大豆的蛋白条带基本一样，由此可见，普通大豆和富硒大豆中其蛋白成分基本一致。
二、富硒大豆及其蛋白中硒含量测定
测定方法：
分别称量0.5000g 1#脱脂豆粉、2#脱脂豆粉、3#脱脂豆粉、4#脱脂豆粉、1#11S大豆球蛋白、2#11S大豆球蛋白、3#11S大豆球蛋白、4#11S大豆球蛋白、1#7S大豆球蛋白、2#7S大豆球蛋白、3#7S大豆球蛋白和4#7S大豆球蛋白于锥形瓶中，向各锥形瓶中分别加入10mL混合酸(V硝酸:V高氯酸＝9:1，硝酸浓度为65-68wt％，高氯酸浓度为70-72wt％)，冷消化12h后放置在电热板上，在180下℃加热消化，直至出现白烟，且消化液呈透明无色或微黄色，待消化液冷却后，加入4mL 6mol/L HCl溶液，再加水定容至50mL，将所得的溶液取5mL移入试管中，加入2.5mL l0wt％铁氰化钾(K3[Fe(CN)6])溶液和5mL 6mol/L HCl溶液，混合均匀，用原子荧光光谱仪仪器进行检测。
原子荧光光谱仪仪器参数及操作条件如下：原子化温度800℃，分析线196.0nm，灯电流8mA，流速为1.2L/min，光谱通带0.4nm，载气为高纯氮气。
测定结果：
测定结果如表1所示：
表1不同硒含量富硒大豆提取的11S和7S大豆球蛋白组分的硒含量(mg/kg)
从表1可以看出，对于不同硒含量的富硒大豆，与脱脂豆粉相比，提取出的11S和7S大豆球蛋白组分中硒含量均得到了有效提高。

Claims (8)

1.一种从富硒大豆中富集高硒蛋白组分的方法，其特征在于包括如下步骤：
1.1、富硒大豆的脱脂：
将干燥的富硒大豆籽粒粉碎，得到富硒大豆粉，按照液料比为1g:20-30ml的比例，将石油醚加入富硒大豆粉中，室温下密封搅拌浸提脱脂2-4h，脱脂结束后静置，待沉淀完全后，分离，将所得的沉淀干燥去除石油醚，得到脱脂豆粉；
1.2、去除脱脂豆粉中的非蛋白组分：
按照料液比为1g:25-35ml的比例，将脱脂豆粉加入0.01-0.05mol/L磷酸氢二钠溶液中，室温下搅拌浸提45-90min，浸提结束后，离心分离，取上清液A，即为大豆蛋白溶液；
1.3、提取11S大豆球蛋白：
向大豆蛋白溶液中加入NaCl，使NaCl的终浓度为45-55mmol/L，用0.5-1.5mol/L的盐酸溶液调节pH至6-6.5后，离心分离，得沉淀A和上清液B，沉淀A即为11S大豆球蛋白；
1.4、去除11S大豆球蛋白和7S大豆球蛋白以外的蛋白质组分：
将步骤1.3所得的上清液B用0.5-1.5momol/L的盐酸溶液调节pH至5-5.5后，离心分离，得沉淀B和上清液C，沉淀B即为11S大豆球蛋白和7S大豆球蛋白以外的蛋白质组分；
1.5、提取7S大豆球蛋白：
将步骤1.4所得的上清液C用0.5-1.5momol/L的盐酸溶液调节pH至4.5-5后，离心分离，得沉淀C，沉淀C即为7S大豆球蛋白。
2.根据权利要求1所述的从富硒大豆中富集高硒蛋白组分的方法，其特征在于：将步骤1.1分离所得的上清液回收石油醚进行循环利用。
3.根据权利要求1所述的从富硒大豆中富集高硒蛋白组分的方法，其特征在于：离心分离时离心转速3000-3500r/min，离心时间为10min。
4.根据权利要求1所述的从富硒大豆中富集高硒蛋白组分的方法，其特征在于：步骤1.3中，加入NaCl，使NaCl的终浓度为50mmol/L。
5.根据权利要求1所述的从富硒大豆中富集高硒蛋白组分的方法，其特征在于：盐酸溶液的浓度为1mol/L。
6.根据权利要求1所述的从富硒大豆中富集高硒蛋白组分的方法，其特征在于：步骤1.3中，用盐酸溶液调节pH至6.4。
7.根据权利要求1所述的从富硒大豆中富集高硒蛋白组分的方法，其特征在于：步骤1.4中，将步骤1.3所得的上清液B用盐酸溶液调节pH至5.25。
8.根据权利要求1所述的从富硒大豆中富集高硒蛋白组分的方法，其特征在于：步骤1.5中，将步骤1.4所得的上清液C用盐酸溶液调节pH至4.8。
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