CN110846364A - 一种无患子蛋白肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种无患子蛋白肽及其制备方法。制备方法包括无患子的前处理步骤、蛋白质提取步骤、酶解步骤和添加白玉兰提取物步骤，通过对工艺的简化和对酶的优选使得本发明的方法更适合工业化。本发明采用酶法提取天然无患子中的无患子蛋白肽，工艺简单，酶解效果更好，制得的无患子蛋白肽不含任何化学成分与激素，对人体无任何毒副作用，且加入白玉兰提取物进行调配，赋予其特有的白玉兰香味，纯天然提取物加上沁人心脾的花香，更能让人接受和喜欢。另一方面，提高了对植物原料的开发利用率和蛋白质资源的附加值，经济环保，促进了我国农副产品加工业的持续健康发展。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白肽领域，具体涉及一种无患子蛋白肽及其制备方法。
背景技术
无患子，别称木患子(本草纲目)，油患子(四川)，洗手果，落叶大乔木，高可达20余米，树皮灰褐色或黑褐色。到目前为止，对无患子的研究主要集中在将其果壳加工成生物燃料活性炭，提取果仁中的油做生物柴油，以及提取果皮中的皂苷加工成各种洗涤剂。其实，无患子具有很强的药用价值，其果皮、种子、果仁、根、皮、叶都可以用作医药原料，现代药理学研究证明，无患子还具有抗菌、抗肿瘤、抗压、抗病毒、心肝保护、免疫调节等药理作用。同时，无患子含天然表面活性物质，该表面活性物质中含有萜类甾体皂甙、氨基酸、蛋白质、维生素、油酸、油脂等多种对人体有益的物质。
蛋白质是食品的重要组成成分，是构成机体细胞的大分子物质，蛋白质经酶解后得到小分子蛋白肽，也表明，肽是构成人体所有细胞的基本材料，是我们身体里必须的一种营养物质，涉及到人体激素、神经、生殖及细胞的更新、代谢、生长、修复等各个领域，小分子肽对人体有诸多好处，调节体内各个系统器官和细胞的生理功能，可以直接修复我们的细胞。没有肽就没有生命，百病本源其实是“细胞生了病”，而肽，却能治百病。
目前市场上的肽产品主要有动物源肽产品和植物源肽产品，在众多的植物性原料中，还没有对无患子蛋白肽进行开发和提取，对无患子的研究主要集中在精油和皂苷的提取，而且其它大多数蛋白肽都带有苦味和腥味，十分不利于产品化。同时，在肽的提取与制备方面，现有的技术存在酶解过程中酶解效果不好，或是酶解工艺复杂，成本较高，不利于工业化生产等问题存在。
发明内容
本发明根据上述背景与现状，目的在于提供一种无患子蛋白肽的制备方法及其制得的无患子蛋白肽，以最大限度提升无患子的附加价值，同时本发明的方法工艺简单，经济环保，具有独特香味，其制备方法包括以下步骤：
S1：将无患子果实干燥，去核，粉碎为粉末状；
S2：将无患子粉加入至水中，搅拌，过滤，向滤液中加入碱调节pH至9，进行蛋白质的提取，得到提取液；
S3：将提取液离心，得到上清液，向上清液中加入酸调节pH至4.5，进行沉降，得到沉降液；
S4：将沉降液离心，得到沉淀，向沉淀中加入水和碱调节pH至中性，然后离心并用水将离心后的沉淀清洗至中性，得到无患子蛋白；
S5：向无患子蛋白中加入水和酶液进行酶解，得到混合液；
S6：将混合液灭酶，离心，得到上清液；
S7：将S6得到的上清液与白玉兰提取物混合，得到无患子蛋白肽。
优选地，S2中，无患子粉和水的料液比为1g：9mL。
优选地，S2中，提取的方法为气浴提取或超声提取。
优选地，提取的方法为气浴提取时，提取温度为50～55℃，转速为100～120rpm，提取时间为90～120min；提取的方法为超声提取时，提取温度为50～55℃，提取时间为45～60min。
优选地，S2和S4中所述的碱为NaOH溶液，S3中所述的酸为HCl溶液。
优选地，S2、S4和S6中所述离心的转速均为4500～6000r/min，离心时间均为30min。
优选地，S5中，所述酶液为果胶酶、纤维素酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶中的至少一种。
优选地，S5中，在50～55℃的水浴条件下进行酶解，酶解时间为2～4h。酶解时需将溶液的pH调至最佳水解条件，其中，果胶酶水解pH为4.5，纤维素酶水解pH为6，胰蛋白酶水解pH为8，木瓜蛋白酶水解pH为7，碱性蛋白酶水解pH为9～10。
优选地，S6中，灭酶的具体过程为：将混合液水浴加热至100℃，然后继续水浴加热20～30min。
有益效果：本发明采用酶法提取天然无患子中的无患子蛋白肽，工艺简单，酶解效果更好，制得的无患子蛋白肽不含任何化学成分与激素，对人体无任何毒副作用，且加入白玉兰提取物进行调配，赋予其特有的白玉兰香味，纯天然提取物加上沁人心脾的花香，更能让人接受和喜欢。另一方面，提高了对植物原料的开发利用率和蛋白质资源的附加值，经济环保，促进了我国农副产品加工业的持续健康发展。
附图说明
图1为不同酶作用下的无患子蛋白肽的凝胶染色图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地理解本发明的目的、方案和效果。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1：白玉兰提取物的制备
(1)摘取新鲜的白玉兰花瓣，称取10g进行研磨，加入100mL的超纯水充分摇匀后用漏斗过滤去除杂质，再用浓度为0.1mol/L的NaoH调节溶液pH至9(碱融条件)，气浴提取温度为50℃，转速为100rpm，提取时间为90min；
(2)提取结束后，在低速离心机中4500r/min离心30min，取上清液；
(3)将离心后的上清液用0.1mol/L的盐酸进行沉降，将溶液pH调节至4.5(蛋白质酸沉点)，沉降2h；
(4)将沉降后混合液4500r/min离心30min，弃去上清液。加水稀释后分别加入5％的木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶，在其最佳水解条件下于50℃～55℃水浴锅中酶解2h；
(5)酶解完成，将水浴锅加热到100℃，继续水浴加热20min灭酶，待其冷却至室温。将冷却后的酶解蛋白溶液4500r/min离心30min，取上清液备用。
实施例2：一种无患子蛋白肽的制备
S1：摘取无患子鲜果作为原材料(来源于贵州省的无患子种植基地)，将其干燥(干燥条件为100℃烘箱，干燥24h)，将干燥完全的无患子去核，置于万能粉碎机中进行粉碎，用100目筛进行过筛，筛下物为无患子粉末；
S2：称取80g无患子粉加入到720mL水中，不断搅拌与摇晃，使其充分混匀；用滤纸进行过滤，去除杂质；并配置浓度为0.1mol/L的NaoH调节滤液pH至9，进行超声提取，得到提取液；提取温度为50℃，提取时间为45min；
S3：将提取液放置在低速离心机中4500r/min离心30min，取上清液；向上清液中加入0.1mol/L的盐酸，将上清液的pH调节至4.5(蛋白质酸沉点)，沉降2h，得到沉降液；
S4：将沉降液在4500r/min的转速下离心30min，弃去上清液，在沉淀中加入少量超纯水，用0.1mol/L NaoH调节pH至中性，4500r/min离心30min，收集沉降，反复水洗至中性，得到无患子蛋白；
S5：将S4制得的无患子蛋白制备成1％的无患子蛋白溶液(即取0.5mL的无患子蛋白加入至49.5mL的超纯水中)，分别称取果胶酶和纤维素酶配制为1％浓度的酶液，将酶液与无患子蛋白溶液混合，并调节溶液pH到其最佳水解条件(果胶酶水解pH为4.5，纤维素酶水解pH为6)，于50℃～55℃水浴锅中酶解2h，得到混合液；
S6：将混合液加入至水浴锅中加热到100℃，继续水浴加热20min灭酶，待其冷却至室温后，4500r/min离心30min，得到上清液；
S7：将S6得到的上清液与白玉兰提取物(实施例1制得)混合，得到无患子蛋白肽。
实施例3：无患子蛋白肽的蛋白浓度检测
将实施例2中S6得到的上清液作为测试样，进行蛋白浓度的检测，具体过程如下：
(1)制备双缩脲试剂：称取0.75g CuSO4和3g酒石酸钾钠溶于250mL水中，配制150mL10％的NaOH溶液，定容到500mL；
(2)称取50mg BSA(牛血清白蛋白)于5mL水中制备10mg/mL的BSA。分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1mL于离心管中，不足1mL的补足到1mL，加4mL双缩脲试剂，剧烈震荡后放置30min，于570nm处比色，吸光度为横坐标，BSA浓度为纵坐标；
(3)取测试样200μL于10mL离心管中，加入0.5M的NaOH 800μL，再加入4mL双缩脲试剂，将无患子蛋白吸光度带入标准曲线求出浓度；通过计算，无患子蛋白浓度为0.775mg/mL。
实施例4：分子印迹实验
(1)试剂准备
缓冲液：将配套MOPS缓冲液粉末溶解在1L超纯水中制成1×电泳缓冲液，磁力搅拌器混合均匀；
染色液：在100mL的容量瓶中加入40mL(40％)的乙醇，10mL(10％)的乙酸及0.1g(0.1％)考马斯亮蓝R-250，加超纯水定容到100mL；
脱色液：在500mL的容量瓶中加入50mL(10％)乙醇，37.5mL(7.5％)乙酸，加超纯水定容到500mL。
样品：采用实施例2相同的方法制备五组无患子蛋白肽，第一组采用木瓜蛋白酶和纤维素酶混合而成的酶液进行酶解；第二组采用胰蛋白酶作为酶液进行酶解；第三组采用纤维素酶和果胶酶混合而成的酶液进行酶解；第四组采用木瓜蛋白酶作为酶液进行酶解；第五组采用碱性蛋白酶作为酶液进行酶解；取五个组制备步骤中的S6中得到的上清液作为样品。
(2)电泳
去掉预制胶板的塑封和梳子，放入凝胶电泳装置中，将配制好的缓冲液加入电泳槽，使槽内外缓冲液持平，并覆盖上样孔5～7mm，用枪头吸去上样孔周围的气泡；取样品50μL，1×loading buffer 20μL及30μL的超纯水于2mL的离心管中，100℃金属浴10min；
上样时每个孔取10μL样液，其中取2μL buffer与8μL Marker溶液充分混合成与样品等体积的溶液，并用枪头垂直加入到每一个上样孔。
在电流70～100mA，电压140V的条件下跑完上层浓缩胶后，调整电流为50mA左右，直至目的蛋白泳动至距胶下缘1cm处结束电泳。电泳结束后，用撬具轻轻撬开胶板，取出凝胶进行染色。
(3)凝胶染色
将取出的凝胶放入装有100mL染色液的染色容器中，放于摇床上轻摇1h后倒掉染色液，用超纯水清洗3遍。向清洗后的凝胶中加入100mL脱色液，继续放于摇床上轻摇1h，倒去脱色液，超纯水洗3次后更换新鲜脱色液，重复两次此操作。然后更换新鲜脱色液，在摇床上脱色过夜，直至次日凌晨背景清晰，取出凝胶。将凝胶附着在干净透明的塑胶壳上扫描胶条，整理并标记蛋白分子，结果如图1所示(M表示预染蛋白，A表示采用木瓜蛋白酶和纤维素酶混合而成的酶液的第一组样品，B表示采用胰蛋白酶作为酶液的第二组样品，C表示采用纤维素酶和果胶酶混合而成的酶液的第三组样品，D表示采用木瓜蛋白酶作为酶液的第四组样品，E表示采用碱性蛋白酶作为酶液的第五组样品)。
由图1可知，木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶对于无患子蛋白的水解效果较好，分子量均可达25KD以下，而其他组合相对条件较优的其分子量也是在35KD以下，反应条件均为50℃～55℃水浴酶解2h，100℃水浴加热灭酶20min。
Claims (10)
1.一种无患子蛋白肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将无患子果实干燥，去核，粉碎为粉末状；
S2：将无患子粉加入至水中，搅拌，过滤，向滤液中加入碱调节pH至9，进行蛋白质的提取，得到提取液；
S3：将提取液离心，得到上清液，向上清液中加入酸调节pH至4.5，进行沉降，得到沉降液；
S4：将沉降液离心，得到沉淀，向沉淀中加入水和碱调节pH至中性，然后离心并用水将离心后的沉淀清洗至中性，得到无患子蛋白；
S5：向无患子蛋白中加入水和酶液进行酶解，得到混合液；
S6：将混合液灭酶，离心，得到上清液；
S7：将S6得到的上清液与白玉兰提取物混合，得到无患子蛋白肽。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S2中，无患子粉和水的料液比为1g：9mL。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S2中，提取的方法为气浴提取或超声提取。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，提取的方法为气浴提取时，提取温度为50～55℃，转速为100～120rpm，提取时间为90～120min；提取的方法为超声提取时，提取温度为50～55℃，提取时间为45～60min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S2和S4中所述的碱为NaOH溶液，S3中所述的酸为HCl溶液。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S2、S4和S6中所述离心的转速均为4500～6000r/min，离心时间均为30min。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S5中，所述酶液为果胶酶、纤维素酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S5中，在50～55℃的水浴条件下进行酶解，酶解时间为2～4h。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S6中，灭酶的具体过程为：将混合液水浴加热至100℃，然后继续水浴加热20～30min。
10.一种无患子蛋白肽，其特征在于，由权利要求1至9任一项所述的制备方法制得。
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