CN106543265A - 一种从窝瓜中提取糖蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于天然有机化学领域，涉及来源于窝瓜中的糖蛋白的提取。本发明具有以下优点：1、本发明提供了一种从窝瓜中提取糖蛋白及其制备方法，该方法具有得率大，纯度高，能最大限度保持其活性等优点；2、本发明对原料进行了脱脂处理，有效地提高了糖蛋白的提取率；3、本发明采用超声辅助提取技术，加速了目标成分进入溶剂，促进提取的进行。具有节约能源、提取效率高，适应性广，成本低等优点；4、本发明采用盐析处理，提高了糖蛋白的纯度。由于窝瓜糖蛋白具有较好的降血糖作用，本发明将对降血糖相关产品的开发具有极大的推动作用。

Description

一种从窝瓜中提取糖蛋白的方法
技术领域
本发明涉及糖蛋白的提取，尤其涉及的是一种从窝瓜中提取糖蛋白的方法。
背景技术
窝瓜是葫芦科南瓜属植物。因产地不同叫法各异，原产于北美洲，中国吉林、黑龙江、山东、河北、湖北、四川、云南、贵州、浙江、福建等地分布较为广泛。果实成熟时米黄色或黄褐色而有斑纹，果肉黄色或橙黄色、粘质。窝瓜味甘适口，是夏秋季节人们餐桌常见的瓜菜之一。同时，由于窝瓜营养丰富，是一种低脂、低钠、高膳食纤维、高维生素E、高β-胡萝卜素、高钾、高钙的食品，含有人体所需的多种元素和17种氨基酸，是心血管病、糖尿病患者和老年人理想的健康食品，因而国内外对其相关产品的开发也逐渐增多，主要包括饮料类、酱类、糕点、罐头类以及果脯和瓜干类等不同食品。
糖蛋白是一类由糖类同多肽或蛋白质以共价键连接而成的结合蛋白，植物糖蛋白多数具有增强免疫力、抑制肿瘤、降血糖、降血脂、抗氧化、防衰老等功效。研究发现窝瓜多糖可能是以糖蛋白的形式存在，并含有多种氨基酸，可刺激胰岛素分泌，产生降糖效果。本世纪末我国将进入老年型国家的行列，所以研究开发老年人常见病和多发病用药将具有显著的社会效益和经济效益，因而对于从窝瓜中提取糖蛋白的方法研究，开发降血糖、降血脂的相关产品将具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种从窝瓜中提取糖蛋白的方法，该方法提取的糖蛋白的得率和纯度较佳。
一种从窝瓜中提取糖蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)取新鲜窝瓜，洗净后加入1.2～2倍体积无水乙醚40℃回流2小时，过滤，残渣挥干溶剂；
(2)每克窝瓜中按照一定比例加入低浓度NaCl溶液；
(3)调整上述溶液的pH，在40～80℃条件下超声辅助浸提10～60分钟；
(4)浸提液4000r/min离心10min取上清液；
(5)上清液蒸馏水透析48h，减压浓缩，调整滤液的pH值为4.2，置4℃透析12h；
(6)透析袋内液体4000r/min离心3min取沉淀；
(7)沉淀物反复用乙醇洗涤，45℃干燥，得灰白色粉末，即为糖蛋白；
(8)将所得糖蛋白溶于蒸馏水中，配制成一定浓度的水溶液，进行盐析，提高糖蛋白的纯度；
所述步骤(2)中，每克窝瓜中按照12～20∶1的比例加入0.05～0.2mol/L的NaCl溶液，糖蛋白的得率和纯度随着NaCl溶液的摩尔浓度增加而增加，当NaCl溶液为0.1mol/L时，再增加NaCl溶液的浓度，糖蛋白的得率和纯度增加不明显，当NaCl溶液的摩尔浓度超过0.2mol/L时，糖蛋白的纯度略有下降。
所述步骤(3)中，调整溶液的pH至8～9，pH值升高，糖蛋白的得率和纯度都增加，然而，当pH＞8.5时，糖蛋白的得率和纯度随着pH的升高而下降。
所述步骤(5)中，通过改变溶液的pH值，破坏水化层，降低稳定性，使其聚集而沉淀，溶解度降到最低，实验证明窝瓜糖蛋白的等电点为pH＝4.2。
所述步骤(7)中，无水乙醇的终浓度的体积百分比为50～90％。同时，可将提取物加入蒸馏水配制成一定浓度的溶液，加入茚三酮试剂，加热，有紫色化合物生成，证明为蛋白质。
所述步骤(8)中，将所得糖蛋白溶于蒸馏水中，配制成5～9g/100mL的溶液，过滤，滤液中缓慢加入固体硫酸铵至其浓度为35％，并不断搅拌，4℃透析过夜，离心得组分I，透析脱盐，45℃干燥，上清液再加硫酸铵至其浓度为65％，得组分II，分别用凯氏定氮法检测两个组分的蛋白质含量，用苯酚硫酸法检测多糖含量；
所述步骤(1)～(8)中，温度不能超过60℃，当温度低于60℃时，随着温度的升高，糖蛋白的得率和纯度迅速增加，若超过60℃，糖蛋白的得率和纯度随着温度的升高而降低。所述糖蛋白抑制氧自由基的活性会快速降低，而乙醇和水混合时会产生热效应，因此，本发明中使用4～10℃预冷的无水乙醇洗涤糖蛋白，可以保证糖蛋白的最大活性。
具体实施方式
实施例1
取新鲜窝瓜1kg，洗净后加入1.2～2倍体积无水乙醚40℃回流2小时，过滤，残渣挥干溶剂。每克窝瓜中按照12∶1的比例加入0.05mol/L NaCl溶液。调整上述溶液的pH为8.0，在40～80℃条件下超声辅助浸提10分钟。浸提液4000r/min离心10分钟取上清液。上清液蒸馏水透析48小时，减压浓缩，调整滤液的pH值为4.2，置4℃透析12小时。透析袋内液体4000r/min离心3分钟取沉淀。沉淀物反复用乙醇洗涤，无水乙醇的终浓度的体积百分比为50～90％，45℃干燥，得灰白色粉末，即为糖蛋白。提取物加入蒸馏水配制成一定浓度的溶液，加入茚三酮试剂，加热，有紫色化合物生成，证明为蛋白质。将所得糖蛋白溶于蒸馏水中，配制成5～9g/100mL的溶液，过滤，滤液中缓慢加入固体硫酸铵至其浓度为35％，并不断搅拌，4℃透析过夜，离心得组分I，透析脱盐，45℃干燥，上清液再加硫酸铵至其浓度为65％，得组分II。结果表明：组分I含蛋白质90％以上，基本不含糖，组分II含蛋白质14.08％，含糖67.24％，同时测定组分II的得率为4.38％，纯度为81.32％。
实施例2
取新鲜窝瓜1kg，洗净后加入1.2～2倍体积无水乙醚40℃回流2小时，过滤，残渣挥干溶剂。每克窝瓜中按照16∶1的比例加入0.1mol/LNaCl溶液。调整上述溶液的pH为8.5，在40～80℃条件下超声辅助浸提30分钟。浸提液4000r/min离心10分钟取上清液。上清液蒸馏水透析48小时，减压浓缩，调整滤液的pH值为4.2，置4℃透析12小时。透析袋内液体4000r/min离心3分钟取沉淀。沉淀物反复用乙醇洗涤，无水乙醇的终浓度的体积百分比为50～90％，45℃干燥，得灰白色粉末，即为糖蛋白。提取物加入蒸馏水配制成一定浓度的溶液，加入茚三酮试剂，加热，有紫色化合物生成，证明为蛋白质。将所得糖蛋白溶于蒸馏水中，配制成5～9g/100mL的溶液，过滤，滤液中缓慢加入固体硫酸铵至其浓度为35％，并不断搅拌，4℃透析过夜，离心得组分I，透析脱盐，45℃干燥，上清液再加硫酸铵至其浓度为65％，得组分II。结果表明：组分I含蛋白质90％以上，基本不含糖，组分II含蛋白质13.95％，含糖77.85％，同时测定组分II的得率为6.52％，纯度为91.80％。
实施例3
取新鲜窝瓜1kg，洗净后加入1.2～2倍体积无水乙醚40℃回流2小时，过滤，残渣挥干溶剂。每克窝瓜中按照20∶1的比例加入0.2mol/L NaCl溶液。调整上述溶液的pH为9.0，在40～80℃条件下超声辅助浸提60分钟。浸提液4000r/min离心10分钟取上清液。上清液蒸馏水透析48小时，减压浓缩，调整滤液的pH值为4.2，置4℃透析12小时。透析袋内液体4000r/min离心3分钟取沉淀。沉淀物反复用乙醇洗涤，无水乙醇的终浓度的体积百分比为50～90％，45℃干燥，得灰白色粉末，即为糖蛋白。提取物加入蒸馏水配制成一定浓度的溶液，加入茚三酮试剂，加热，有紫色化合物生成，证明为蛋白质。将所得糖蛋白溶于蒸馏水中，配制成5～9g/100mL的溶液，过滤，滤液中缓慢加入固体硫酸铵至其浓度为35％，并不断搅拌，4℃透析过夜，离心得组分I，透析脱盐，45℃干燥，上清液再加硫酸铵至其浓度为65％，得组分II。结果表明：组分I含蛋白质90％以上，基本不含糖，组分II含蛋白质12.38％，含糖75.31％，同时测定组分II的得率为4.58％，纯度为87.69％。

Claims (7)

1.一种从窝瓜中提取糖蛋白的方法，其包括以下步骤：
(1)取新鲜窝瓜，洗净后加入1.2～2倍体积无水乙醚40℃回流2小时，过滤，残渣挥干溶剂；
(2)每克窝瓜中按照一定比例加入低浓度NaCl溶液；
(3)调整上述溶液的pH，在40～80℃条件下超声辅助浸提10～60分钟；
(4)浸提液4000r/min离心10min取上清液；
(5)上清液蒸馏水透析48h，减压浓缩，调整滤液的pH值为4.2，置4℃透析12h；
(6)透析袋内液体4000r/min离心3min取沉淀；
(7)沉淀物反复用乙醇洗涤，45℃干燥，得灰白色粉末，即为糖蛋白；
(8)将所得糖蛋白溶于蒸馏水中，配制成一定浓度的水溶液，进行盐析，提高糖蛋白的纯度。
2.如权利要求1所述的一种从窝瓜中提取糖蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，每克窝瓜中按照12～20∶1的比例加入0.05～0.2mol/L的NaCl溶液，糖蛋白的得率和纯度随着NaCl溶液的摩尔浓度增加而增加，当NaCl溶液为0.1mol/L时，再增加NaCl溶液的浓度糖蛋白的得率和纯度增加不明显，当NaCl溶液的摩尔浓度超过0.2mol/L时，糖蛋白的纯度略有下降。
3.如权利要求1所述的一种从窝瓜中提取糖蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，调整溶液的pH至8～9，pH值升高，糖蛋白的得率和纯度都增加，然而，当pH＞8.5时，糖蛋白的得率和纯度随着pH的升高而下降。
4.如权利要求1所述的一种从窝瓜中提取糖蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，通过改变溶液的pH值，破坏水化层，降低稳定性，使其聚集而沉淀，溶解度降到最低，实验证明窝瓜糖蛋白的等电点为pH＝4.2。
5.如权利要求1所述的一种从窝瓜中提取糖蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(7)中，无水乙醇的终浓度的体积百分比为50～90％。同时，可将提取物加入蒸馏水配制成一定浓度的溶液，加入茚三酮试剂，加热，有紫色化合物生成，证明为蛋白质。
6.如权利要求1所述的一种从窝瓜中提取糖蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(8)中，将所得糖蛋白溶于蒸馏水中，配制成5～9g/100mL的溶液，过滤，滤液中缓慢加入固体硫酸铵至其浓度为35％，并不断搅拌，4℃透析过夜，离心得组分I，透析脱盐，45℃干燥，上清液再加硫酸铵至其浓度为65％，得组分II，分别用凯氏定氮法检测两个组分的蛋白质含量，用苯酚硫酸法检测多糖含量。
7.如权利要求1所述的一种从窝瓜中提取糖蛋白的方法，其特征在于，所述步骤所述步骤(1)～(8)中，温度不能超过60℃，当温度低于60℃时，随着温度的升高，糖蛋白的得率和纯度迅速增加，若超过60℃，糖蛋白的得率和纯度随着温度的升高而降低。所述糖蛋白抑制氧自由基的活性会快速降低，而乙醇和水混合时会产生热效应，因此，本发明中使用4～10℃预冷的无水乙醇洗涤糖蛋白，可以保证糖蛋白的最大活性。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN108299547A (zh) * 2018-03-01 2018-07-20 江南大学 一种从虎奶菇菌核中制备糖蛋白的方法
CN113397032A (zh) * 2021-05-24 2021-09-17 江苏省农业科学院 基于牛蒡糖蛋白的营养素递送体系及其制备方法和应用

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