CN105779539A - 一种猴头菇蛋白肽-硒螯合物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种猴头菇蛋白肽‑硒螯合物的制备方法，利用碱溶酸沉法或硫酸铵沉降法提取猴头菇中的蛋白质；采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶或复合蛋白酶对猴头菇蛋白进行限制性酶解后，灭酶，制备猴头菇蛋白酶解液；利用无机物亚硒酸钠中的硒与猴头菇蛋白肽螯合获得猴头菇蛋白肽‑硒螯合物。本发明显著提高了猴头菇蛋白的提取率，提取率达80.55%~85.75%；本发明制备的矿质元素‑肽螯合物具有独特的螯合体制和转运机制，易被吸收、安全无毒、价格低、可同时补充氨基酸和矿质离子，制备的猴头菇蛋白肽‑硒螯合物中硒含量为2561~3818μg/g，为开发有机硒营养补充剂与功能性食品提供理论依据和技术支持。

Description

一种猴头菇蛋白肽-硒螯合物的制备方法
技术领域
本发明涉及一种猴头菇蛋白肽-硒螯合物的制备方法，属于食品生物技术领域。
背景技术
硒（Se）是人体必需的一种重要矿质元素，具有重要的生理功能，已有的大量研究表明很多种疾病都与硒营养状况密切相关。人体主要是通过饮食获得硒，人工补硒的方法是口服含硒制剂。一般补硒的方法是用无机硒化合物（亚硒酸钠和硒酸钠）制成口服制剂。但是，无机硒强化剂吸收和利用的效果不理想，生物有效性低，而且具有较强的毒副作用，最低致死量相对较小，中毒量与需要量之间范围小，存在较大的安全隐患，因而被严格限制其使用。研究显示，无机硒经生物转化后的有机硒化合物毒性低，吸收率更高，生物利用率和生物活性也更高，在激发免疫反应上比无机硒显著。
猴头菇，又叫猴头菌，因外形酷似猴头而得名。猴头菇的营养成分很高，干品中每百克含蛋白质26.3克，含有氨基酸多达17种，其中人体所需的占8种，氨基酸种类丰富，比例合理，且含有一些其他食品所少见的稀有氨基酸，因而猴头菇蛋白水解产生的多肽与普通动植物蛋白相比具有更丰富的生物活性。
利用生物技术对猴头菇进行蛋白质资源的深加工，进行生物活性肽的筛选和提取分离，然后利用无机硒进行螯合，制备多肽-硒螯合物，将无机硒转变成有机硒。这种猴头菇生物活性多肽-硒螯合物能显著提高硒元素的吸收率和利用率，而且还具有抗氧化、抗菌、免疫调节、降血脂和降血糖等活性，有很高的开发价值和应用前景，同时能提高猴头菇的附加值，为食药用菌资源的利用开辟了新的途径，具有广阔的市场前景。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷，提供一种猴头菇蛋白肽-硒螯合物的制备方法，采用碱溶酸沉法或硫酸铵沉降法提取猴头菇中的蛋白提取率高，提取率达80.55%~85.75%，制备的猴头菇蛋白肽-硒螯合物中硒含量为2561~3818μg/g，为开发有机硒营养补充剂与功能性食品提供理论依据和技术支持。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的猴头菇蛋白肽-硒螯合物的制备方法，包括如下步骤：
（1）猴头菇蛋白提取：利用碱溶酸沉法或硫酸铵沉降法提取猴头菇中的蛋白质；
（2）酶解：采用蛋白酶对步骤（1）得到的猴头菇蛋白进行有限酶解，灭酶，制备猴头菇蛋白多肽复合物溶液；
（3）多肽-硒螯合物制备：采用固体高温混合法或者液体螯合法使无机物亚硒酸钠中的硒与猴头菇蛋白肽进行螯合，制备猴头菇蛋白肽-硒螯合物；
（4）将步骤（3）得到的猴头菇蛋白肽-硒螯合物进行冷冻干燥。
步骤（1）中，碱溶酸沉法的具体操作如下：将猴头菇超微粉碎，将粉碎后的猴头菇与蒸馏水以w/v 为1:20-80的比例混合，利用1.0%-5.0wt% NaOH调节pH至9.0-11.0，超声提取20-60min，超声功率为100-200W，随后水浴提取60-90min，温度50-100℃，提取后用纱布过滤，滤液为碱提的猴头菇蛋白溶液，用盐酸调节碱提的猴头菇蛋白溶液pH至2.0-4.0进行蛋白沉淀，离心得沉淀蛋白，水洗至中性再次离心，将沉淀冷冻干燥即得猴头菇蛋白；硫酸铵沉降法的具体操作如下：将猴头菇超微粉碎，将粉碎后的猴头菇与蒸馏水以w/v为1:20-60的比例混合，逐步加入固体硫酸铵使硫酸铵的饱和度达40-60wt%，离心得猴头菇蛋白沉淀，利用透析法脱盐后冷冻干燥得猴头菇蛋白；所述离心沉淀蛋白的离心条件为4000-5000r/min，离心5-10min。
步骤（2）中，将步骤（1）得到的猴头菇蛋白溶解在水中使蛋白质量浓度达1.0-5.0wt%，将pH调节到7.0-10.0，温度保持在40-60℃，加入1.0-5.0wt%蛋白酶，水解30-120min，灭酶，得到猴头菇蛋白多肽复合物溶液；所述蛋白酶采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶和复合蛋白酶中的一种。
步骤（3）中，固体高温混合法的具体操作如下：将步骤（2）得到的猴头菇蛋白多肽复合物溶液冷冻干燥制成猴头菇蛋白多肽复合物冻干粉，然后将亚硒酸钠粉末和猴头菇蛋白多肽复合物冻干粉按照亚硒酸钠粉末：猴头菇蛋白多肽复合物冻干粉=1:6-5:6的质量比混合，300-500℃加热制备猴头菇蛋白肽-硒螯合物；液体螯合法的具体操作如下：将步骤（2）得到的猴头菇蛋白多肽复合物溶液按亚硒酸钠溶液：猴头菇蛋白多肽复合物溶液=1:6-5:6的体积比加入0.5-1mol/L亚硒酸钠溶液，搅拌均匀，调节pH6.0-9.0，在20-80℃条件下持续反应0.5-2.0h，反应后冷却，离心分离去除杂质，加入3-5倍体积75-95wt%的乙醇，沉淀静置12h，离心去除上清液，获得猴头菇蛋白肽-硒螯合物。
本发明的有益效果在于：
碱溶酸沉法或硫酸铵沉降法提取猴头菇中的蛋白提取率高，提取率达80.55%~85.75%；通过控制猴头菇蛋白酶解时间，得到具有高硒螯合活性的生物活性肽；通过与无机物亚硒酸钠中的硒进行螯合，制备有机的生物活性肽-硒螯合物具有独特的螯合体制和转运机制，易被吸收、安全无毒、价格低、可同时补充氨基酸和硒离子，制备的猴头菇蛋白肽-硒螯合物中硒含量为2561~3818μg/g。本发明为猴头菇的应用提供了一条新思路，为开发有机硒营养补充剂与功能性食品提供理论依据和技术支持。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅仅限于这些实施例。
实施例1
第一步：将猴头菇超微粉碎，将粉碎后的猴头菇与蒸馏水以w/v 为1:50的比例混合，利用2.0wt% NaOH调节pH至10.0，超声功率150W，超声提取20min，水浴提取60min，温度60℃，提取后用纱布过滤，滤液为碱提的猴头菇蛋白溶液，用盐酸调节碱提的猴头菇蛋白溶液pH至3.0进行蛋白沉淀，4000r/min离心10min得沉淀蛋白，水洗至中性再次离心，将沉淀冷冻干燥即得猴头菇蛋白，其提取率达80.55%；
第二步：将猴头菇蛋白溶解在水中使蛋白质量浓度达5.0wt%，用NaOH溶液将猴头菇蛋白溶液pH调节到7.0，温度保持在50℃，加入3.0wt%碱性蛋白酶，水解30min，灭酶，得到猴头菇蛋白多肽复合物溶液；
第三步：将猴头菇蛋白多肽复合物溶液按亚硒酸钠溶液：猴头菇蛋白多肽复合物溶液=1:6的体积比加入0.5mol/L亚硒酸钠溶液，搅拌均匀，调节pH8.0，在50℃条件下持续反应1.0h，反应后冷却，离心分离去除杂质，加入4倍体积95wt%的乙醇，沉淀静置12h，离心去除上清液，将沉淀冷冻干燥获得猴头菇蛋白肽-硒螯合物。
采用3, 3'-二氨基联苯胺比色法测定硒含量。称取猴头菇蛋白肽-硒螯合物0.1g左右，放入100mL烧杯中，加入5mL消化液，在电炉上消化至样液呈无色透明为止。冷却后，用大约10mL的蒸馏水洗涤烧瓶中残留的消化样液，合并到烧杯中，上述消化液，用40％NaOH和5%NaOH溶液调节pH7.0左右，最后将溶液定溶到50mL，待测。测定标准曲线：取6支125mL的分液漏斗，一支准确加入上述溶液0.5mL， 另5支分别加入2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL的硒标准溶液5μg/ml ，各加蒸馏水至40mL，用1mol HCl溶液调节至pH2.5左右，加入0.2M的EDTA-2Na溶液2mL，然后加入0.5%的3, 3’-二氨基联苯胺溶液（DBA) 2mL，置于60℃水浴50min (光线暗淡的环境下）下震荡。取出，用5％的NaOH溶液调节pH7.5左右，准确加入10mL甲苯，振摇2-3min，静置2-3min分层，然后将甲苯层于420nm处测定溶液的吸光度(甲苯作空白)。样品中硒含量的测定：准确吸取消化处理好的样品0.5mL，置于分液漏斗中，按照标准曲线进行操作。根据样品测得的吸光度，计算硒含量。
计算公式：
硒含量/（μg/g）=pV/mN
式中：p为从标准曲线中查得的相当于硒的标准质量浓度／(μg／mL)；V为甲苯萃取所得的样品体积／mL；m为样品的质量/g，N为用于测定的样品体积占总定容后样品的体积分数。
测定制备的猴头菇蛋白肽-硒螯合物中硒含量为2561μg/g。
实施例2
第一步：将猴头菇超微粉碎，将粉碎后的猴头菇与蒸馏水以w/v 为1:50的比例混合，利用3.0wt% NaOH调节pH至11.0，超声提取20min，水浴提取90min，温度100℃，提取后用纱布过滤，滤液为碱提的猴头菇蛋白溶液，用盐酸调节碱提的猴头菇蛋白溶液pH至3.0进行蛋白沉淀，离心得沉淀蛋白，水洗至中性再次离心，将沉淀冷冻干燥即得猴头菇蛋白，其提取率达85.75%；
第二步：将猴头菇蛋白溶解在水中使蛋白质量浓度达1.0wt%，调节pH至8.0，温度保持在40℃，加入1.0wt%中性蛋白酶，水解50min，灭酶，得到猴头菇蛋白多肽复合物溶液；
第三步：将猴头菇蛋白多肽复合物溶液按亚硒酸钠溶液：猴头菇蛋白多肽复合物溶液=2:3的体积比加入0.8mol/L亚硒酸钠溶液，搅拌均匀，调节pH9.0，在60℃条件下持续反应2.0h，反应后冷却，离心分离去除杂质，加入5倍体积95wt%的乙醇，沉淀静置12h，离心去除上清液，获得猴头菇蛋白肽-硒螯合物。
采用3, 3'-二氨基联苯胺比色法测定硒含量。
称取猴头菇蛋白肽-硒螯合物0.1g左右，放入100mL烧杯中，加入5mL消化液，在电炉上消化至样液呈无色透明为止。冷却后，用大约10mL的蒸馏水洗涤烧瓶中残留的消化样液，合并到烧杯中，上述消化液，用40％NaOH和5%NaOH溶液调节pH7．0左右，最后将溶液定溶到50mL，待测。测定标准曲线：取6支125mL的分液漏斗，一支准确加入上述溶液0.5mL，另5支分别加入2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL的硒标准溶液5μg/mL ，各加蒸馏水至40mL，用1mol HCl溶液调节至pH2.5左右，加入0. 2M的EDTA-2Na溶液2mL，然后加入0.5%的3.3’-二氨基联苯胺溶液（DBA） 2mL，置于60℃水浴50min (光线暗淡的环境下）下震荡。取出，用5％的NaOH溶液调节pH7.5左右，准确加入10mL甲苯，振摇3-4min，静置3-4min分层，然后将甲苯层于420nm处测定溶液的吸光度(甲苯作空白)。样品中硒含量的测定：准确吸取消化处理好的样品0.5mL，置于分液漏斗中，按照标准曲线进行操作。根据样品测得的吸光度，计算硒含量。
计算公式：
硒含量/（μg/g）=pV/mN
式中：p为从标准曲线中查得的相当于硒的标准质量浓度／(μg／mL)；V为甲苯萃取所得的样品体积／mL；m为样品的质量/g，N为用于测定的样品体积占总定容后样品的体积分数。
测定制备的猴头菇蛋白肽-硒螯合物中硒含量为3818μg/g。
实施例3
第一步：将猴头菇超微粉碎，将粉碎后的猴头菇与蒸馏水以w/v为1:60的比例混合，逐步加入固体硫酸铵使硫酸铵的饱和度达60wt%，5000r/min，离心5min得猴头菇蛋白沉淀，利用透析法脱盐后冷冻干燥得猴头菇蛋白，其提取率达81.15%；
第二步：将猴头菇蛋白溶解在水中使蛋白质量浓度达5.0wt%，调节pH至8.0，温度保持在40℃，加入5.0wt%复合蛋白酶，水解50min，灭酶，得到猴头菇蛋白多肽复合物溶液；
第三步：将得到的猴头菇蛋白多肽复合物溶液冷冻干燥制成猴头菇蛋白多肽复合物冻干粉，然后将亚硒酸钠粉末和猴头菇蛋白多肽复合物冻干粉按照亚硒酸钠粉末：猴头菇蛋白多肽复合物冻干粉=5:6的质量比混合，500℃加热制备猴头菇蛋白肽-硒螯合物。
采用3, 3'-二氨基联苯胺比色法测定硒含量。
称取猴头菇蛋白肽-硒螯合物0.1g左右，放入100mL烧杯中，加入5mL消化液，在电炉上消化至样液呈无色透明为止。冷却后，用大约10ml的蒸馏水洗涤烧瓶中残留的消化样液，合并到烧杯中，上述消化液，用40％NaOH和5%NaOH溶液调节pH7．0左右，最后将溶液定溶到50mL，待测。测定标准曲线：取6支125mL的分液漏斗，一支准确加入上述溶液0.5mL，另5支分别加入2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml的硒标准溶液5μg/ml ，各加蒸馏水至40mL，用1mol HCl溶液调节至pH2.5左右，加入0. 2M的EDTA-2Na溶液2mL，然后加入0.5%的3.3’-二氨基联苯胺溶液（DBA）2mL，置于60℃水浴50min(光线暗淡的环境下）下震荡。取出，用5％的NaOH溶液调节pH7.5左右，准确加入10mL甲苯，振摇3-4min，静置3-4min分层，然后将甲苯层于420nm处测定溶液的吸光度(甲苯作空白)。样品中硒含量的测定：准确吸取消化处理好的样品0.5mL，置于分液漏斗中，按照标准曲线进行操作。根据样品测得的吸光度，计算硒含量。
计算公式：
硒含量/（μg/g）=pV/mN
式中：p为从标准曲线中查得的相当于硒的标准质量浓度／(μg／mL)；V为甲苯萃取所得的样品体积／mL；m为样品的质量/g，N为用于测定的样品体积占总定容后样品的体积分数。
测定制备的猴头菇蛋白肽-硒螯合物中硒含量为3567μg/g。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (7)

1.一种猴头菇蛋白肽-硒螯合物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）猴头菇蛋白提取：利用碱溶酸沉法或用硫酸铵沉降法提取猴头菇蛋白；所述碱溶酸沉法的具体操作如下：首先将猴头菇超微粉碎，将粉碎后的猴头菇与蒸馏水混合，利用NaOH或KOH溶液调节pH至9.0-11.0，超声提取后进行水浴提取，提取后过滤，滤液为碱提的猴头菇蛋白溶液，用盐酸调节碱提的猴头菇蛋白溶液pH至2.0-4.0进行蛋白沉淀，离心得沉淀蛋白，水洗至中性再次离心，将沉淀冷冻干燥即得猴头菇蛋白；所述硫酸铵沉降法的具体操作如下：首先将猴头菇超微粉碎，将粉碎后的猴头菇与蒸馏水混合，逐步加入固体硫酸铵使硫酸铵的饱和度达40-60wt%，离心得猴头菇蛋白沉淀，利用透析法脱盐后冷冻干燥得猴头菇蛋白；
（2）酶解：将步骤（1）得到的猴头菇蛋白溶解在水中使蛋白质量浓度达1.0-5.0wt%，调节pH至7.0-10.0，温度保持在40-60℃，加入蛋白酶水解30-120min，灭酶，得到猴头菇蛋白多肽复合物溶液；
（3）多肽-硒螯合物制备：利用固体高温混合法或者液体螯合法制备猴头菇蛋白肽-硒螯合物；所述固体高温混合法的具体操作如下：将步骤（2）得到的猴头菇蛋白多肽复合物溶液冷冻干燥制成猴头菇蛋白多肽复合物冻干粉，并加入亚硒酸钠粉末混合，300-500℃加热制备猴头菇蛋白肽-硒螯合物；所述液体螯合法的具体操作如下：往步骤（2）得到的猴头菇蛋白多肽复合物溶液中加入亚硒酸钠溶液，搅拌均匀，调节pH为6.0-9.0，在20-80℃条件下持续反应0.5-2.0h，反应后冷却，离心分离去除杂质，加入3-5倍体积75-95wt%的乙醇，沉淀静置12h，离心去除上清液，获得猴头菇蛋白肽-硒螯合物；
（4）将步骤（3）得到的猴头菇蛋白肽-硒螯合物进行冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述一种猴头菇蛋白肽-硒螯合物的制备方法，其特征在于：步骤（1）碱溶酸沉法操作中猴头菇与蒸馏水以w/v为1:20-80的比例混合；硫酸铵沉降法操作中猴头菇与蒸馏水以w/v为1:20-60的比例混合。
3.根据权利要求1所述一种猴头菇蛋白肽-硒螯合物的制备方法，其特征在于：步骤（1）碱溶酸沉法操作中NaOH和KOH的质量分数为1wt%~5wt%。
4.根据权利要求1所述一种猴头菇蛋白肽-硒螯合物的制备方法，其特征在于：步骤（1）碱溶酸沉法操作中超声提取时间为20-60min，超声功率为100-200W；水浴提取时间为60-90min，温度50-100℃。
5.根据权利要求1所述一种猴头菇蛋白肽-硒螯合物的制备方法，其特征在于：步骤（1）中离心沉淀处理的条件为：离心速率为4000-5000r/min，离心时间为5-10min。
6.根据权利要求1所述一种猴头菇蛋白肽-硒螯合物的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述蛋白酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶和复合蛋白酶中的一种，蛋白酶的质量浓度为1.0-5.0wt%。
7. 根据权利要求1所述一种猴头菇蛋白肽-硒螯合物的制备方法，其特征在于：步骤（3）固体高温混合法操作中亚硒酸钠粉末和猴头菇蛋白多肽复合物冻干粉按照亚硒酸钠粉末：猴头菇蛋白多肽复合物冻干粉=1:6-5:6的质量比混合；液体螯合法操作中亚硒酸钠溶液和猴头菇蛋白多肽复合物溶液按亚硒酸钠溶液：猴头菇蛋白多肽复合物溶液=1:6-5:6的体积比混合，亚硒酸钠溶液浓度为0.5-1mol/L。
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