CN103435712A - 一种冬虫夏草胞内多糖的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种改进的发酵冬虫夏草胞内多糖的提取方法，通过菌粉水提醇沉得到粗多糖；将粗多糖脱脂、脱蛋白、透析，进行柱色谱提纯得到精制多糖。该精制多糖不仅提取效率高，纯度好，而且具有相当好的抗氧化效果，其效果远远优于目前采用现有技术进行提取的冬虫夏草多糖。

Description

一种冬虫夏草胞内多糖的提取方法

技术领域

本发明涉及中药活性成分提取领域，具体涉及一种冬虫夏草胞内多糖的提取方法。

背景技术

冬虫夏草是鳞翅目蝙蝠蛾属的虫草蝙蝠蛾(Hepialus armoricamus Oberthur)幼虫感染中国被毛孢真菌后，在体内大量繁殖后形成的虫菌复合体，即中国被毛孢菌以蝙蝠蛾幼虫为营养源不断在其体内繁殖，直至僵死成为僵虫，最后长出子座形成天然冬虫夏草。从天然冬虫夏草的形成过程来看，中国被毛孢在蝙蝠蛾幼虫体内繁殖过程中不断通过幼虫摄取营养物质，即营养补给呈动态形式。

它是我国传统名贵中药，具有止咳、化痰、降低血清胆固醇、调节和增强免疫力、抗肿瘤等多种药理作用。近年来，国内外对冬虫夏草需求剧增。但由于冬虫夏草有其严格的寄生性和特殊的生长地理环境，产量相当有限，药源比较紧缺。

因此，如何对冬虫夏草中的活性成分进行最高效的提取，是研究的热点之一。多糖是冬虫夏草中含量最大的生理活性物质，具有很强的降血糖，抗肿瘤，延缓衰老，保护肝脏的功能。大量医学实验研究表明，虫草多糖对单核巨噬细胞系统和体液免疫功能有增强作用。能增强巨噬细胞的吞噬能力，调节内分泌，提高人体免疫力。

现今的提取虫草多糖技术主要有超声波法，超临界二氧化碳萃取法，水提醇沉法，稀醇提取法四种。水提醇沉法是应用水浸提冬虫夏草，使虫草多糖溶于水中，再经脱蛋白，用乙醇沉淀虫草多糖，收集沉淀干燥即得虫草多糖产品。水提醇沉法因设备和操作简单，现在仍被大家所接受。但是其仍然存在不少缺陷，例如提取率不能令人满意、多糖纯度不足、分布不好、活性不高等。

本发明通过研究，试图提供一种改进的冬虫夏草胞内多糖的提取方法，以获得提取效率高、活性好的多糖提取方法。

发明内容

本发明冬虫夏草胞内多糖的提取方法大致分为以下步骤：

冬虫夏草胞内多糖的提取方法

1、菌粉水提醇沉得到粗多糖；

2、将粗多糖脱脂、脱蛋白、透析，进行柱色谱提纯；

3、得到精制多糖。

一、菌粉多糖的提取方法的优化：

提取出的粗多糖溶液浓缩后用4倍体积的95％的乙醇于4℃条件下沉淀24h，8000rpm／min冷冻离心10min，用无水乙醇、丙酮、乙醚分别洗涤两次，50℃烘干。

在初步对提取各实验参数进行筛选后，采用正交设计法，对多糖的提取温度、时间、料液比、提取次数进行了实验，结果如下：(多糖提取率(％)=(菌粉水提醇沉后的质量／菌粉质量)*100％)(表1、图1)

表1因素水平表

表2多糖提取率为实验结果的直观分析表

表3提取温度与提取时间的交互作用表

表4提取温度与料液比的交互作用表

表5提取温度与提取次数的交互作用表

a取0.10，得到的方差分析表如下：

表6

因素	偏差平方和	自由度	F比	F临界值	显著性
						提取温度	9.249	2	3.672	3.110	出
提取时间	0.177	2	0.070	3.110
						料液比	0.125	2	0.050	3.110
提取次数	0.523	2	0.208	3.110
						误差	10.07	8

由方差分析表和效应曲线图可知，提取温度对多糖的提取率有显著性影响，其次是提取次数，提取时间和料液比对多糖的提取率没有太大影响。由直观分析表可知提取温度100℃时多糖提取率最高，根据直观分析表和提取温度与提取时间、料液比、提取次数的交互作用表，选取提取时间为90min，料液比为1：10，提取次数为3次。所以正交试验确定的多糖的提取工艺为：提取温度100℃，提取时间为90min，料液比为1：10，提取次数为3次。

二、菌粉中多糖浓度的测定：

采用苯酚硫酸法测多糖含量。

标准曲线测定(图2)：

烘干至恒重的葡萄糖，原液浓度100mg／100ml，取10ml，稀释到100ml，得0.1mg／ml的标准液，分别取标准液0ml,0.2ml,0.4ml,0.6ml,0.8ml,1.0ml,1.2ml加去离子水定容到2ml，加5％(g／ml)的苯酚溶液1ml，加浓硫酸5ml，室温下反应10分钟，30℃水浴中反应20分钟，拿出，放到室温，用721型分光光度计在490nm下测吸光度。

提取工艺为：菌粉质量2g，提取温度100℃，提取时间为90min，料液比为1：10，提取次数为3次，三个平行试验。将多糖提取液定容到100ml，取50μl，按照标准曲线的做法测定样品中多糖的浓度，结果如下：

表7

所以，菌粉中多糖含量为8.239％

三、粗多糖中除蛋白方法的比较。

(1)、Sevage法：配制质量浓度为1％的粗多糖溶液，按体积比4：1，加入样品及氯仿正丁醇混合溶液(其中氯仿和正丁醇体积比为5：1)，振摇30min，离心取上清液，重复以上操作5次。

(2)、三氯乙酸法(TCA法)：配制质量浓度为1％的粗多糖溶液，加入I％TCA，振摇20min后静置30min，然后离心除去沉淀，取上清液重复以上操作2次。

(3)、氯化钙法：配制质量浓度为1％的粗多糖溶液，调节pH值为8-9，加热至85℃，加氯化钙使其浓度为5％(w／v)，搅拌，冷却，离心。

(4)、盐酸法：配制质量浓度为1％的粗多糖溶液，向溶液中逐滴加入2mol／L的盐酸溶液，调节pH值为3，4℃下放置12h，离心。

分别使用Sevage法，三氯乙酸法，氯化钙法及盐酸法对提的粗多糖进行脱蛋白处理。处理前后分别测定样品中多糖及蛋白质含量，计算不同方法除蛋白后的多糖保留率和蛋白清楚率。分别采用苯酚硫酸法和考马斯亮蓝法检测多糖和蛋白质含量。

考马斯亮蓝法标准曲线的测定：将考马斯亮蓝G250100mg溶于50mL95％乙醇，加入100mL85％H₃PO₄，用去离子水定容至1000mL，滤纸过滤，即得考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，常温下可放置一个月。精确称取10mg牛血清白蛋白，溶于去离子水中，定容到100mL，即得100μg／mL的牛血清标准蛋白溶液。取6支具塞试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL100ug／mL的牛血清标准蛋白溶液，再分别加入去离子水补足到1mL，最后均加入5mL考马斯亮蓝试剂。摇匀放置5分钟后，以第一号试管为空白对照，在595nm处比色(比色应在1h内完成)。作蛋白质含量(m)一吸光度(A)标准曲线。

样品蛋白含量测定：取样品溶液1.0mL于比色皿中，按标准曲线方法测定在波长595nm处的吸光度，每次取双样对照，并以标准曲线计算样品中蛋白质的量。

考马斯亮蓝法测蛋白的标准曲线见图3：

苯酚硫酸法测定不同除蛋白方法除蛋白前后的多糖浓度，计算多糖保留率。

多糖保留率(％)=(除蛋白后粗多糖溶液中的多糖浓度／未除蛋白时粗多糖溶液中的多糖浓度)*100％

未除蛋白的1％粗多糖溶液中多糖浓度测定结果如下：

表8

除蛋白后1％粗多糖溶液中的多糖浓度测定结果如下：

表9

多糖保留率：

表10

Sevage法三氯乙酸法氯化钙法	盐酸法
		91.2584％83.1119％89.2075％	81.1545％

考马斯亮蓝法测1％粗多糖溶液中除蛋白前后的蛋白质浓度，计算蛋白清除率。

蛋白清除率(％)=(除蛋白前后粗多糖溶液中的蛋白质浓度差／未除蛋白的粗多糖溶液中的蛋白质浓度)*100％

未除蛋白的1％粗多糖溶液中蛋白质浓度测定结果如下：

表11

除蛋白后1％粗多糖溶液中的蛋白浓度测定结果如下：

表12

蛋白清除率：

表13

Sevage法三氯乙酸法	氯化钙法盐酸法
		48.6342％46.3659％	46.5122％55.2195％

不同方法纯化多糖的结果：

表14

方法	蛋白清除率(％)	多糖保留率(％)
			Sevage法	48.63	91.26
三氯乙酸法	46.37	83.11
			氯化钙法	46.51	89.21
盐酸法	55.22	81.15

通过对4中脱蛋白方法进行比较，sevage法蛋白质清除率最高，且多糖保留率最高，但在实际生产中因氯仿毒性较大，对人体伤害较大，不宜采用。氯化钙法成本低廉，操作简单，脱蛋白效果及多糖保留率尚可，适宜实际生产。三氯乙酸法脱蛋白效果不好，且多糖保留率较低。盐酸法脱蛋白效果最好，但多糖保留率较低，且存在多糖水解的缺点，因而不宜采用。

提取工艺为：菌粉称量，提取温度100℃，提取时间为90min，料液比为1：10，提取次数为3次，三个平行试验。

将多糖提取液定容到100ml，取50μl，按照标准曲线的做法测定样品中多糖的浓度，结果如下：

表15

所以，用这种方法处理的菌粉中多糖含量为8.239％

经过对提取、脱蛋白和硅胶柱色谱条件的选择，本发明最终确定的冬虫夏草胞内多糖的提取方法如下：

1)、菌粉水提醇沉得到粗多糖：取冬虫夏草菌粉，进行水提取，提取温度100℃，提取时间为90min，料液比为1：10(g／mL)，提取次数为3次；提取出的粗多糖溶液浓缩后用4-8倍体积的95％的乙醇于4℃条件下沉淀12-24h，8000-10000rpm／min冷冻离心5-10min，用无水乙醇、丙酮、乙醚分别洗涤两次，50℃烘干；

2)、将粗多糖脱脂、脱蛋白：将烘干得到的粗多糖加入料液比为1∶8-12(g／mL)无水乙醇，室温脱脂8-12小时后，减压蒸馏至无醇味，加水配制成质量浓度为1％的粗多糖溶液，调节pH值为8-9，加热至85℃，加氯化钙使其浓度为5％(w／v)，搅拌，冷却，离心，取上清液浓缩；

3)、将粗多糖透析：将步骤2)得到的脱脂、脱蛋白的粗多糖产品加入料液比为1：8(g／mL)的蒸馏水溶解，用截留分子量为8000的半透膜进行透析；

4)、将透析后的粗多糖溶液冷冻干燥，采用硅胶柱色谱，以20％-50％乙醇水溶液进行梯度洗脱，先以20％乙醇水溶液洗脱2个柱体积；再以30％乙醇水溶液洗脱5个柱体积；最后以50％乙醇水溶液洗脱3个柱体积，收集第3-10个柱体积的洗脱液，浓缩干燥后得到本发明制备的冬虫夏草多糖。

该冬虫夏草多糖不仅提取效率高，纯度好，而且出人意料的是，其具有相当好的抗氧化效果，其效果远远优于目前采用现有技术进行提取的冬虫夏草多糖。

附图说明

图1多糖提取效应曲线图

图2苯酚硫酸法测多糖含量标准曲线

图3考马斯亮蓝法测蛋白标准曲线

具体实施方式

实施例1

1)、菌粉水提醇沉得到粗多糖：取冬虫夏草菌粉100g，进行水提取，提取温度100℃，提取时间为90min，料液比为1：10(g／mL)，提取次数为3次；提取出的粗多糖溶液浓缩后用4倍体积的95％的乙醇于4℃条件下沉淀24h，8000rpm／min冷冻离心10min，用无水乙醇、丙酮、乙醚分别洗涤两次，50℃烘干；

2)、将粗多糖脱脂、脱蛋白：将烘干得到的粗多糖加入料液比为1：8(g／mL)无水乙醇，室温脱脂8小时后，减压蒸馏至无醇味，加水配制成质量浓度为1％的粗多糖溶液，调节pH值为8-9，加热至85℃，加氯化钙使其浓度为5％(w／v)，搅拌，冷却，离心，取上清液浓缩；

3)、将粗多糖透析：将步骤2)得到的脱脂、脱蛋白的粗多糖产品加入料液比为1：8(g／mL)的蒸馏水溶解，用截留分子量为8000的半透膜进行透析；

4)、将透析后的粗多糖溶液冷冻干燥，采用硅胶柱色谱，以20％-50％乙醇水溶液进行梯度洗脱，先以20％乙醇水溶液洗脱2个柱体积；再以30％乙醇水溶液洗脱5个柱体积；最后以50％乙醇水溶液洗脱3个柱体积，收集第3-10个柱体积的洗脱液，浓缩干燥。

采用CN2008101162192实施例1公开的紫外吸收广谱和Sephadex G-100凝胶层析鉴定多糖纯度，结果表明，该虫草多糖为均一多糖。

用硫酸-蒽醌法(张惟杰主编，复合多糖生化研究技术，上海科学技术出版社，1987)测定该虫草多糖含糖量达到99.34％。

实施例2

1)、菌粉水提醇沉得到粗多糖：取冬虫夏草菌粉，进行水提取，提取温度100℃，提取时间为90min，料液比为1：10(g／mL)，提取次数为3次；提取出的粗多糖溶液浓缩后用6倍体积的95％的乙醇于4℃条件下沉淀20h，10000rpm／min冷冻离心5min，用无水乙醇、丙酮、乙醚分别洗涤两次，50℃烘干；

2)、将粗多糖脱脂、脱蛋白：将烘干得到的粗多糖加入料液比为1：12(g／mL)无水乙醇，室温脱脂12小时后，减压蒸馏至无醇味，加水配制成质量浓度为1％的粗多糖溶液，调节pH值为8-9，加热至85℃，加氯化钙使其浓度为5％(w／v)，搅拌，冷却，离心，取上清液浓缩；

3)、将粗多糖透析：将步骤2)得到的脱脂、脱蛋白的粗多糖产品加入料液比为1：8(g／mL)的蒸馏水溶解，用截留分子量为8000的半透膜进行透析；

4)、将透析后的粗多糖溶液冷冻干燥，采用硅胶柱色谱，以20％-50％乙醇水溶液进行梯度洗脱，先以20％乙醇水溶液洗脱2个柱体积；再以30％乙醇水溶液洗脱5个柱体积；最后以50％乙醇水溶液洗脱3个柱体积，收集第3-10个柱体积的洗脱液，浓缩干燥。

采用CN2008101162192实施例1公开的紫外吸收广谱和Sephadex G-100凝胶层析鉴定多糖纯度，结果表明，该虫草多糖为均一多糖。

用硫酸-蒽醌法(张惟杰主编，复合多糖生化研究技术，上海科学技术出版社，1987)测定该虫草多糖含糖量达到99.13％。

实施例3

抗氧化功能动物实验：

1、实验药物

本发明药物：为按照实施例1制成的虫草多糖。

对照组药物：为按照CN2008101162192实施例1制备的脱色多糖、MPS1和MPS2。

以上各药物均用蒸馏水配制成相应浓度的溶液，按2％(即每100g体重给予2ml)给动物灌胃。

2、实验动物

昆明种雌性小鼠共80只，其中12月龄以上小鼠70只，体重范围41-54g，8周龄小鼠10只，平均体重21.5±1.2g。

3、主要仪器和试剂

751紫外分光光度计，恒温水浴箱，微量可调加样器，高速离心机和低速离心机，旋涡混匀器。MAD、SOD测定试剂盒，购于南京建成生物工程研究所，4度冰箱保存。所用三氟甲烷、无水乙醇、冰乙酸等均为分析纯试剂。

4、实验方法与结果

将70只12月龄以上小鼠采用随机分组法分为7组，每组10只，分别为老龄鼠对照组、本发明药物低剂量组、中剂量组和高剂量组、脱色多糖组、MPS1组和MPS2组；另10只8周龄小鼠为少龄鼠对照组。本发明药物低剂量组、中剂量组和高剂量组动物分别按人体推荐用量的5倍、10倍和20倍给予本发明药物，即分别为：43.3mg／kg·bw、86.7mg／kg·bw和173.0mg／kg·bw。脱色多糖组、MPS1组和MPS2组分别按173.0mg／kg·bw的剂量给予脱色多糖、MPS1和MPS2。老龄鼠对照组和少龄鼠对照组动物分别灌胃给予等量蒸馏水。对各组小鼠每日灌胃给予受试物，连续40天。试验结束时按南京建成生物工程研究所购买的MDA和SOD试剂盒说明书测定动物肝组织匀浆中的MDA含量和红细胞中的SOD活力。

采用各实验组与对照组均数比较的方差分析对数据进行处理。所用软件为PEMS3.0《中国医学百科全书·医学统计学》统计软件包(第三版)。

实验结果显示：本发明组合物高剂量组小鼠肝组织匀浆的MDA含量显著低于老龄鼠对照组(p＜0.01)，并接近于少龄鼠对照组；红细胞中SOD活力显著高于老龄鼠对照组(p＜0.01)，并略高于少龄鼠对照组。按卫生部《保健食品检验与评价技术规范》2003版的评价标准，本发明药物的抗氧化功能动物实验结果为阳性。此外，脱色多糖组、MPS1组小鼠肝组织匀浆的MDA含量、SOD活力与老龄鼠对照组比较均无显著差异(p＞0.05)，MPS2组表现烧好，但是其小鼠肝组织匀浆的MDA含量、SOD活力与老龄鼠对照组比较仍无显著差异(p＞0.05)。可见，与CN2008101162192实施例1制备的脱色多糖、MPS1和MPS2相比较，使用本发明药物具有明显的抗氧化作用。

基于以上实验，本发明制备的冬虫夏草多糖不仅提取效率高，纯度好，而且具有相当好的抗氧化效果，其效果远远优于目前采用现有技术进行提取的冬虫夏草多糖。

Claims (6)

1.一种冬虫夏草胞内多糖的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：冬虫夏草菌粉水提醇沉得到粗多糖；对粗多糖进行提纯即得。

2.一种冬虫夏草胞内多糖的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)、菌粉水提醇沉得到粗多糖：取冬虫夏草菌粉，进行水提取，提取温度100℃，提取时间为90min，料液比为1：10(g／mL)，提取次数为3次；提取出的粗多糖溶液浓缩后用4-8倍体积的95％的乙醇于4℃条件下沉淀12-24h，8000-10000rpm／min冷冻离心5-10min，用无水乙醇、丙酮、乙醚分别洗涤两次，50℃烘干；

2)、将粗多糖脱脂、脱蛋白：将烘干得到的粗多糖加入料液比为1：8-12(g／mL)无水乙醇，室温脱脂8-12小时后，减压蒸馏至无醇味，加水配制成质量浓度为1％的粗多糖溶液，调节pH值为8-9，加热至85℃，加氯化钙使其浓度为5％(w／v)，搅拌，冷却，离心，取上清液浓缩；

3)、将粗多糖透析：将步骤2)得到的脱脂、脱蛋白的粗多糖产品加入料液比为1：8(g／mL)的蒸馏水溶解，用截留分子量为8000的半透膜进行透析；

4)、将透析后的粗多糖溶液冷冻干燥，采用硅胶柱色谱，以20％-50％乙醇水溶液进行梯度洗脱，先以20％乙醇水溶液洗脱2个柱体积；再以30％乙醇水溶液洗脱5个柱体积；最后以50％乙醇水溶液洗脱3个柱体积，收集第3-10个柱体积的洗脱液，浓缩干燥后得到本发明制备的冬虫夏草多糖。

3.如权利要求2所述的冬虫夏草胞内多糖的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)、菌粉水提醇沉得到粗多糖：取冬虫夏草菌粉100g，进行水提取，提取温度100℃，提取时间为90min，料液比为1：10(g／mL)，提取次数为3次；提取出的粗多糖溶液浓缩后用4倍体积的95％的乙醇于4℃条件下沉淀24h，8000rpm／min冷冻离心10min，用无水乙醇、丙酮、乙醚分别洗涤两次，50℃烘干；

2)、将粗多糖脱脂、脱蛋白：将烘干得到的粗多糖加入料液比为1：8(g／mL)无水乙醇，室温脱脂8小时后，减压蒸馏至无醇味，加水配制成质量浓度为1％的粗多糖溶液，调节pH值为8-9，加热至85℃，加氯化钙使其浓度为5％(w／v)，搅拌，冷却，离心，取上清液浓缩；

3)、将粗多糖透析：将步骤2)得到的脱脂、脱蛋白的粗多糖产品加入料液比为1：8(g／mL)的蒸馏水溶解，用截留分子量为8000的半透膜进行透析；

4)、将透析后的粗多糖溶液冷冻干燥，采用硅胶柱色谱，以20％-50％乙醇水溶液进行梯度洗脱，先以20％乙醇水溶液洗脱2个柱体积；再以30％乙醇水溶液洗脱5个柱体积；最后以50％乙醇水溶液洗脱3个柱体积，收集第3-10个柱体积的洗脱液，浓缩干燥。

4.如权利要求2所述的冬虫夏草胞内多糖的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)、菌粉水提醇沉得到粗多糖：取冬虫夏草菌粉，进行水提取，提取温度100℃，提取时间为90min，料液比为1：10(g／mL)，提取次数为3次；提取出的粗多糖溶液浓缩后用6倍体积的95％的乙醇于4℃条件下沉淀20h，10000rpm／min冷冻离心5min，用无水乙醇、丙酮、乙醚分别洗涤两次，50℃烘干；

2)、将粗多糖脱脂、脱蛋白：将烘干得到的粗多糖加入料液比为1：12(g／mL)无水乙醇，室温脱脂12小时后，减压蒸馏至无醇味，加水配制成质量浓度为1％的粗多糖溶液，调节pH值为8-9，加热至85℃，加氯化钙使其浓度为5％(w／v)，搅拌，冷却，离心，取上清液浓缩；

3)、将粗多糖透析：将步骤2)得到的脱脂、脱蛋白的粗多糖产品加入料液比为1：8(g／mL)的蒸馏水溶解，用截留分子量为8000的半透膜进行透析；

4)、将透析后的粗多糖溶液冷冻干燥，采用硅胶柱色谱，以20％-50％乙醇水溶液进行梯度洗脱，先以20％乙醇水溶液洗脱2个柱体积；再以30％乙醇水溶液洗脱5个柱体积；最后以50％乙醇水溶液洗脱3个柱体积，收集第3-10个柱体积的洗脱液，浓缩干燥。

5.如权利要求2所述的冬虫夏草胞内多糖的提取方法，其特征在于：所述的多糖含糖量为99％以上。

6.如权利要求1-5任一项所述的制备方法制备的冬虫夏草胞内多糖在制备治疗抗氧化的药物中的应用。

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