ES2621675T3 - Una composición farmacéutica que comprende PCMV-VEGF165 para la estimulación de angiogénesis - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende: una preparación del ADN del plásmido purificado pCMV-VEGF165 que codifica un factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) bajo el control de elementos genéticos funcionales que proporcionan expresión génica en células humanas, 3-30 mM de fosfato sódico y de 200 a 400 mM de glucosa para proporcionar una solución isotónica, y en la que la concentración del ADN del plásmido purificado es de 0,1 to 10 mg/ml, y el pH de la composición es de 7,4 a 9,0.

Description

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Ejemplos

Ejemplo 1. Preparación de una solución del ADN del plásmido purificado pCMV-VEGF165.

Preparación de inóculos

Se recuperó un vial de inóculos conservados de la cepa productora TOP10/ pCMV-VEGF165 del banco de trabajo y se cultivó el inóculo en 50 ml de medio líquido.

Biosíntesis de ADNp

Se preparó un fermentador con un matraz de 10 litros, se esterilizó el matraz con un medio, se fijaron asépticamente líneas de entrega y retirada, se calibró un equipo de medición de parámetros de conexión, se inoculó el fermentador y se cultivó durante 8 horas hasta que se consiguió una concentración constante de oxígeno disuelto (fase de crecimiento de cultivo estacionario), con una velocidad fija de la mezcladora de 1000 rev/min, tras lo cual se detuvo la ventilación y se enfrió el matraz. Se transfirió una muestra de una suspensión de cultivo para el análisis de la densidad de cultivo.

Producción de biomasa

Se separó la biomasa, es decir, el sedimento de células, desde el líquido de cultivo en una centrífuga intermitente de alta velocidad de suelo con un rotor de ángulo fijo. Se transfirió el sobrenadante del líquido de cultivo a u autoclave para desinfección y neutralización. Se guardó la biomasa obtenida en bolsas para centrífuga a una baja temperatura en un refrigerador. Se transfirió una muestra de la biomasa para analizar el contenido y la integridad de la sustancia diana.

Suspensión de la biomasa, lisis y neutralización

Se transfirió la biomasa descongelada a un recipiente de lisis y se suspendió con un agitador de hélice en una solución en suspensión. Se llevó a cabo la lisis celular con una solución de hidróxido sódico y dodecil sulfato de sodio con mezclado con el agitador de hélice durante 5 minutos. Al mismo tiempo que se mezclaba, se añadió una solución de acetato potásico para neutralización y la formación simultánea del precipitado de residuos celulares, ADN genómico unido a histonas y proteínas. Se formó el precipitado como resultado de la transformación de dodecil sulfato de sodio en una sal potásica insoluble y la coagulación de micelos. Al mismo tiempo, la neutralización de la solución tuvo como resultado la renaturalización del ADN del plásmido.

Preparación de lisina aclarada

Se transfirió la suspensión obtenida a bolsas para centrifugación y se separó el precipitado en una centrífuga intermitente de alta velocidad de suelo con un rotor de ángulo fijo. Se transfirió el sobrenadante del líquido de cultivo a un autoclave para desinfección y neutralización. Se recogió la solución aclarada del ADN del plásmido que también contenía compuestos relacionados – la forma lineal y relajada del ADN del plásmido, así como impurezas extrañas, tales como ADN genómico residual; ARN, proteínas y endotoxinas detectadas por LAL en el vaso de alimentación de un equipo de ultrafiltración.

Ultrafiltración

Se concentró la solución del ADN del plásmido por ultrafiltración en el flujo tangencial con cartuchos de fibra hueca con el valor umbral límite de 500 kDa. Como parte de la ultrafiltración, tuvo lugar también una eliminación adicional 9 veces de las moléculas con un tamaño inferior a 3 kDa, p.ej., eliminación de proteínas, ARN de transporte, endotoxina LAL y fragmentos cortos de ADN genómico. Se concentró la solución con un factor de concentración de

9. Se recogió la solución de plásmido concentrada en un vial de cristal, se lavó la unidad de filtración con una solución para filtración en gel y se combinó con la solución concentrada del ADN del plásmido.

Filtración en gel

Se llevó a cabo un primer proceso de purificación cromatográfica a fondo por filtración en gel sobre un material absorbente de dextrina de poro grueso Flujo Rápido de Sepharose 6 “Ge Life Sciences”. Se utilizó una solución que tenía una alta concentración de sal que contenía 2,1 M de sulfato de amonio y 10 mM de EDTA-Na que permitió separar las moléculas según su tamaño y retuvo las impurezas de ARN y LAL endotoxina con el absorbente como consecuencia de la interacción hidrófoba no específica. Se recogieron la solución con impurezas y las soluciones de lavado en un vaso y se eliminaron en su momento. Se recogió la solución de ADN del plásmido purificado que contenía 2,1 M de sulfato de amonio en un recipiente de vidrio.

Cromatografía de afinidad

Se llevó a cabo un segundo proceso de purificación cromatográfica a fondo por cromatografía tiofílica (pseudo-afin) sobre un material absorbente PlasmidSelect Xtra "GE Lifesciences”. Para lavar la columna, se utilizó una solución que contenía 2,0 M de sulfato de amonio y se aplicó la solución semi-purificada a una columna con una

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temperatura de transición al vidrio (Tg) de la glucosa y más de 10 grados C por debajo de la Tg de todos los azúcares. La temperatura de producto tras la liofilización no deberá ser inferior a 15 ºC. Se midió la temperatura de los productos con termopares congelados en los viales con simuladores de producto que contenían todos los excipientes, excepto ADN. Tras el secado final, se presurizaron los viales en una atmósfera de aire seco estéril con compresión de batería. Se cerraron los viales sin cargar con tapones de aluminio.

Para comparar la estabilidad del producto al almacenarlo a una temperatura elevada, se utilizó una solución de fosfato sódico que tenía un pH de 7,8 que se obtuvo mezclando soluciones de fosfato disódico y monosódico en una relación molar de 91,5:8,5. Se almacenaron los viales cerrados liofilizados a +37°C en un termostato seco, retirándose un grupo de viales una vez al mes, se disolvió el liofilizado y se midió una proporción del ADN del plásmido relajado por cromatografía de intercambio iónico analítico. En la Tabla 2, se presentan los resultados de la medida.

Tabla 2. Proporción de ADN del plásmido relajado almacenado a una temperatura elevada

Tiempo de retención, meses

Crioprotector

0 1 2 3

Glucosa

2,2% 2,8% 5,3% 10,0%

Sacárido

2,1% 6,2% 8,4% 10,4%

Maltosa

2,3% 7,0% 8,8% 14,6%

Lactosa

2,2% 9,0% 9,6% 18,5%

Se estableció que la glucosa utilizada como crioprotector proporcionó la velocidad de degradación más baja para el ADN del plásmido superenrollado en una relación de masas del sacárido con respecto al ADN de 1:50 y un pH = 7,8.

En lo que se refiere a la composición farmacéutica que contenía glucosa, se investigó la relación entre la estabilidad del ADN del plásmido superenrollado y el pH de la solución y la concentración de fosfato sódico (pH 7,8). Se estableció que la estabilidad del ADN del plásmido superenrollado no había cambiado significativamente para varias concentraciones de fosfato sódico desde 5 a 20 mM (no se muestran los datos). Para diversos pH de la solución, se demostró (véase Tabla 3) que no se produjeron cambios significativos en la estabilidad para el intervalo de pH comprendido entre 7,8 y 9,0, pero la estabilidad del ADN del plásmido superenrollado descendió para un pH 7,2.

Tabla 3. Proporción de ADN del plásmido relajado almacenado a una temperatura elevada para varios niveles de pH

pH

0 meses 1 mes 2 meses 3 meses

7,2

2,2% 4,09% 7,63% 15,17%

7,8

2,2% 2,80% 5,30% 10,00%

8,4

2,3% 2,76% 3,34% 10,69%

9

2,1% 2,51% 2,97% 8,39%

Por tanto, de acuerdo con los datos de almacenamiento acelerado, se puede seleccionar una composición farmacéutica cuando el pH de la composición es de 7,8 a 9,0 y la concentración de fosfato sódico es de 5 a 20 mM. En lo que se refiere a la concentración de los grupos fosfato ionizados en el ADN, con una concentración de ADN de 1 mg/ml, es aproximadamente 3 mM, y la concentración de sales tampón debería exceder significativamente la concentración total de grupos ionizados en el principio activo; la concentración óptima de fosfato sódico se seleccionó en 10 mM. El pH óptimo de la solución fue 7,8, ya que dicho valor es el más próximo al pH fisiológico (7,2-7,4). Sin embargo, se debería tener en cuenta que el pH tendría que estar lo más cercano posible a 7,2 y que cuanto más alto es el nivel de pH, mayor es la estabilidad del plásmido (hasta 9,0). Probablemente, el ADN del plásmido conserva su estabilidad a una temperatura de almacenamiento comprendida entre +2 y +8°C y a un pH de 7,0 a 9,0, que es suficiente para genoterapia.

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Ejemplo 3. Formulación de una solución del ADN del plásmido purificado y producción de la forma de dosificación acabada

Se obtuvo el ADN del plásmido, tal como se muestra en el Ejemplo 1, antes de finalizada la etapa de cromatografía de intercambio aniónico. Se llevaron a cabo las siguientes etapas, tal como se describe a continuación.

Ultrafiltración y diafiltración

Se concentró una solución del ADN del plásmido purificado por ultrafiltración en un equipo con un módulo de fibra hueca con un valor umbral límite de la membrana de 300 kDa. Cuando se alcanzó la concentración de 0,15%, se conectó el equipo en modo diafiltración y se llevó a cabo un cambio total del tampón por una solución de fosfato sódico que tenía una concentración de 10 mM y un pH 7,8 con un contenido de 4,4% (300 mM) de glucosa en agua para inyección. Se recogió el filtrado en un recipiente y se eliminó en su momento. Se vertió la solución formulada concentrada en un recipiente de vidrio, se midió la concentración del ADN del plásmido superenrollado y se llevó la solución a la concentración final de ADN de 0,1%.

Filtración estéril

Se transfirió la solución del principio activo final a un área limpia de clase A y se llevó a cabo la filtración estéril con un filtro de membrana de disco en recipientes de 250 ml estériles despirogenizados para soluciones de infusión según la norma GOST 19808-86. Se seleccionaron las muestras destinadas al departamento de control de calidad, se cerraron los recipientes con sellos de goma, a continuación, se cerraron con tapones de aluminio y se congelaron en una zona de cuarentena en un almacén.

Se descongeló la solución formulada de una solución del ADN del plásmido y se transfirió a un área limpia clase A. Se abrieron los recipientes y se llevó a cabo la filtración estéril con filtros de membrana de disco para recipientes de 250 ml estériles despirogenizados para soluciones de infusión con arreglo a la norma GOST 19808-86. Se vertió la solución en condiciones estériles en viales de insulina de 5 ml estériles con arreglo a la norma GOST 19808-86. Se cerraron los viales con sellos de goma con arreglo a TU 38.006.269-90 y se transfirieron para la liofilización.

Se colocaron los viales sobre las rejillas del liofilizador, se congelaron a -45 ºC y se realizó el secado al vacío en 3 etapas. Se colocaron sellos, se retiraron los viales y se cerraron con tapones de aluminio con arreglo a la norma GOST P 51314-99.

Ejemplo 4. Verificación de la estabilidad de la forma de dosificación acabada e pCMV-VEGF165

Se almacenaron viales con el liofilizado estéril del ADN del plásmido pCMV-VEGF165 en un refrigerador farmacéutico a +4 ºC durante 2,5 años y se llevó a cabo el análisis de la proporción de impurezas relacionadas por cromatografía de intercambio aniónico una vez cada 6 meses. En la Tabla 4 se presentan los resultados del análisis.

Tabla 4. Estabilidad de la forma de dosificación acabada guardada a una temperatura de +4 ºC

Patrón

Salida 6 meses 12 meses 18 meses 24 meses 30 meses

Menos de un 5% de ADN del plásmido lineal y relajado inferior según HPLC de intercambio iónico

3,0% 3,0% 3,3% 3,7% 4,1% 4,0%

Por lo tanto, la forma de dosificación del ADN del plásmido pCMV-VEGF165 fue estable por lo menos durante dos años.

Ejemplo 5. Verificación de la eficacia de la composición farmacéutica

Se confirmó la eficacia del tratamiento con una composición farmacéutica que contenían excipientes además de la construcción de plásmido en pacientes con isquemia crónica de las extremidades inferiores, es decir, los resultados del tratamiento con la composición farmacéutica que contenía los excipientes fueron inesperadamente superiores a los del tratamiento con una composición que incluía únicamente el plásmido (monoterapia). Se determinó la mayor eficacia de tratamiento en un estudio en el que participaron 75 pacientes con isquemia crónica de las extremidades inferiores (estadio 2a-3 de acuerdo con A.V. Pokrovsky-Fontaine (A.V. Pokrovsky, 2004; Inter-Society Consensus for the Management of Peripheral Arterial Disease (TASC II). Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg., oxygen pressure, anklebrachial index ADN a linear blood flow rate in the posterior tibial artery).

Distancia de caminata. Al cabo de 3 meses de tratamiento, la distancia de caminata de los pacientes del grupo clínico era 236.49 ± 193.49 m (distancia promedio), y a los 6 meses -284.73 ± 242.02 m (distancia promedio) (de 20 a 1500 m de todas las distancias obtenidas). El aumento de la distancia media que pudo caminar un paciente sin

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Claims (1)

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