BR112015002522B1

BR112015002522B1 - Composição farmacêutica para estimulação da angiogênese

Info

Publication number: BR112015002522B1
Application number: BR112015002522-6A
Authority: BR
Inventors: Sergej L'vovich Kiselev; Roman Vadimovich Deev; Ivan Ivanovich Vorob'ev; Nadezhda Aleksandrovna Orlova; Artur Aleksandrovich Isaev
Original assignee: "Nextgen" Company Limited
Priority date: 2012-08-31
Filing date: 2013-08-02
Publication date: 2022-04-05
Also published as: RU2542385C2; PL2890777T3; CA2881799A1; HUE032520T2; US20150335711A1; EP2890777B1; CN105308173A; EP2890777A1; WO2014035289A1; ZA201500909B; ES2621675T3; MX360980B; CA2881799C; EP2890777A4; BR112015002522A2; WO2014035289A9; CN105308173B; SI2890777T1; RU2012137126A; MX2015002658A

Abstract

CEPA DO MICRO-ORGANISMO ESHERICHIA COLI PRODUTORA DE pDNA pCMV-VEGF165, MÉTODO DE ARMAZENAMENTO DE pDNA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA A ESTIMULAÇÃO DA ANGIOGÊNESE E MÉTODO DE APLICAÇÃO. A presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica para a indução do crescimento no tecido do vaso sanguíneo, que contém um plasmídeo de DNA purificado que codifica um fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e excipientes farmaceuticamente aceitáveis que incluem um crioprotetor como um veículo e/ou um estabilizador do pH para estabilizar o pH na faixa de 7,0 a 9,0, em quantidades eficazes. Também é fornecido um método de armazenamento do plasmídeo de DNA que codifica VEGF, compreendendo misturar o plasmídeo de DNA purificado com uma solução de pelo menos um crioprotetor que possua propriedades de um veículo e/ou um estabilizador do pH na faixa de 7,0 a 9,0. A solução é liofilizada e armazenada de +2 a +8ºC. pCMV-VEG1F65 de DNA superenrolado que pode ser usado é produzido pelo cultivo da cepa de Escherichia coli TOP10/pCMV-VE1G6F5 . A composição farmacêutica é administrada a um ser humano em quantidades suficientes para fornecer um efeito terapêutico necessário. A composição farmacêutica fornecida de plasmídeo de DNA pCMVVEG1F65 não altera significativamente (...).

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO

[001] Um objetivo da invenção se refere à biotecnologia, isto é a uma cepa produtora de DNA plasmidial, uma composição farmacêutica relevante que é capaz de induzir o desenvolvimento de vasos sanguíneos (vascularização) no sítio de injeção e sua aplicação no complexo de terapia da isquemia aterosclerótica do membro inferior, assim como no tratamento de lesões e úlceras de várias origens e um método para o armazenamento do DNA plasmidial purificado.

DISCUSSÃO DOS ANTECEDENTES

[002] A terapia de gene com DNA plasmidial nu para o tratamento de doenças ou vacinação contra patógenos ou antígenos de células tumorais possibilita o desenvolvimento de formas de dosagem finalizadas de DNA terapêutico que podem ser armazenadas, transportadas e usadas pelos especialistas sob condições favoráveis e, em particular em temperaturas positivas ou elevadas. A estabilidade física e química do DNA plasmidial armazenado é significativamente definida pela composição de excipientes, sua concentração e/ou conteúdo na forma de dosagem finalizada e/ou condições de armazenamento (Schleef M., Schmidt T., Animal-free production of ccc- supercoiled plasmids for research and clinical applications, J. Gene Med., 6 Suppl 1:S45— 53 (2004)). O processo principal que afeta uma forma farmaceuticamente ativa do DNA plasmidial armazenado é a degradação de uma cadeia de DNA que leva à formação de um DNA plasmidial circular relaxado e, subsequentemente, de uma forma linear com duas cadeias. É sabido que quando uma solução congelada de DNA plasmidial é armazenada em uma temperatura abaixo de menos 80°C, a degradação da forma de DNA superenrolado é praticamente imperceptível (Walther W., Stein U., Voss C, Schmidt T., Schleef M., Schlag P. M., Stability analysis for long-term storage of naked DNA: impact on nonviral in vivo gene transfer, Anal Biochem., 318(2):230-5 (2003)). Tal método de armazenamento de DNA não pode ser amplamente usado na prática clínica já que na maioria dos casos, instituições de saúde e farmácias não possuem o equipamento de refrigeração necessário. É bastante difícil transportar formas de dosagem finalizadas e manter tal temperatura baixa do produto. A seleção das composições apropriadas e concentrações de excipientes podem resultar em uma solução de DNA plasmidial que é estável por 12 meses se armazenada a 4°C ou durante três anos se armazenada a 20°C (Przybylowski M., Bartido S., Borquez-Ojeda O., Sadelain M., Riviere I., Production of clinical-grade plasmid DNA for human Phase I clinical trials and large animal clinical studies, Vaccine, 25(27):5013-24 (2007)).

[003] O método mais prevalente para o desenvolvimento de formas de dosagem mais estáveis é a liofilização. Como regra, as formas de dosagem liofilizadas são estáveis a 4°C por vários anos e, em alguns casos, um produto pode ser armazenado em temperatura ambiente por vários meses ou até dois anos. A liofilização também possibilita uma alteração na concentração de uma substancia ativa, em que frascos podem ser preenchidos com uma pequena quantidade de uma solução concentrada e o volume pode ser aumentado até o nível necessário para a dissolução do produto. A liofilização de soluções hipotônicas e a dissolução subsequente do liofilizado com uma solução salina ou uma solução com osmolalidade normal podem ser usadas (Anchordoquy T. J., Armstrong T., Molina M. C, Low molecular weight dextrans stabilize nonviral vectors during lyophilization at low osmolalities: concentrating suspensions by rehydration to reduced volumes, J Pharm Sci., 94(6):1226-36 (2005)).

[004] Geralmente, a liofilização de soluções de DNA plasmidial aumenta a estabilidade do produto para o armazenamento posterior, mas os procedimentos de congelamento e sublimação a vácuo podem prejudicar significativamente a estrutura superenrolada do DNA plasmidial (Anchordoquy T. J., Armstrong T. K., Molina M. C, Allison S. D., Zhang Y., Patel M. M., et al., Physical stabilization of plasmid DNA- based therapeutics during freezing and drying, In: Costantino HR, Pikal M.J., editors. Lyophilisation of biopharmaceuticals, AAPS press; pp. 605-41 (2004)). Em particular, a liofilização do DNA a partir de uma solução aquosa congelada que não contém excipientes causa a eliminação de moléculas de água coordenadas, isto é, um envelope hidratado de uma molécula de DNA que resulta na perda da integridade estrutural da molécula de DNA (Poxon S. W., Hughes J. A., The effect of lyophilization on plasmid DNA activity, Pharm Dev Technol., 5(1): 1 15-22 (2005)). As consequências da conformação prejudicada de uma molécula de DNA que inclui a degradação de ligações complementares entre bases de nitrogênio e a degradação parcial do empilhamento resultam em eventos indesejáveis, isto é, uma diminuição da atividade biológica do DNA plasmidial em até 25% de sua atividade original (Anchordoquy T. J., Armstrong T. K., Molina M. C, Low molecular weight dextrans stabilize nonviral vectors during lyophilization at low osmolalities: concentrating suspensions by rehydration to reduced volumes, J Pharm Sci., 94(6): 1226-36 (2005)).

[005] É sabido que a perda de moléculas de água coordenadas eliminadas pela sublimação pode ser compensada pela adição de substancias hidrofílicas não voláteis tais como açúcares e polióis à solução liofilizada (Maitani Y., Aso Y., Yamada A., Yoshioka S,. Effect of sugars on storage stability of lyophilized liposome/DNA complexes with high transfection efficiency, Int J Pharm., 356(l-2):69-75 (2008)). Uma grande parte de métodos conhecidos no campo da estabilização do DNA pela liofilização usa lipossomas secos por congelamento que contêm DNA (Patente U.S. 7.323.297) e, portanto, a aplicabilidade de soluções conhecidas para uma solução que contém o DNA plasmidial nu é questionável. No estudo de Quaak S., Haanen J., Beijnen J., and Nuijen B., Naked Plasmid DNA Formulation: Effect of Different Disaccharides on Stability after Lyophilisation, AAPS PharmSciTech, Vol. 1 1, No. 1 (March 2010)), o efeito de vários polissacarídeos sobre a liofilização do DNA plasmidial foi examinado e foi estabelecido que a sucrose que é usada com o DNA na proporção em massa de 20:1 forneceu a forma de dosagem mais estável para o armazenamento. O estudo não considerou o efeito do pH e uma solução salina sobre a estabilidade do DNA plasmidial, não estudou as composições de soluções isotônicas de DNA em concentrações abaixo de 5 mg/ml e não estudou monossacarídeos que são potencialmente utilizáveis para a obtenção de preparações de macromoléculas liofilizadas estáveis.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] Um objetivo da presente invenção se refere a uma cepa produtora de DNA plasmidial e uma composição farmacêutica fisiologicamente factível que fornece estabilidade a uma forma de dosagem finalizada do DNA plasmidial por um tempo prolongado e pode ser usada para a terapia de gene.

[007] Uma cepa produtora de DNA plasmidial de Escherichia coli, é a cepa TOP10/pCMV-VEGF165 que compreende um plasmídeo pCMV-VEGF165 e produz DNA superenrolado do plasmídeo pCMV- VEGF165 quando cultivado em um meio, em que a cepa tenha sido depositada no Russian Collection of Agricultural Microorganisms no AllRussia Research Institute for Agricultural Microbiology RCAM ARRIAM RAAS sob o Número de Acesso 517.

[008] Uma composição farmacêutica que compreende uma preparação de DNA plasmidial purificado que codifica um fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) sob o controle de elementos genéticos funcionais que fornecem a expressão de gene em células humanas e uma quantidade eficaz de pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável para fornecer uma solução isotônica, em que o pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável é pelo menos um crioprotetor que é um veículo, um estabilizador do pH ou uma combinação desses, em que a concentração do DNA plasmidial purificado está entre 0,1 a 10 mg/ml e um pH da composição está entre 7,0 a 9,0. A composição pode ser usada para a indução do crescimento de tecido de vaso sanguíneo.

[009] Outro objetivo da invenção é um método para o armazenamento de um DNA plasmidial purificado que codifica um fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), que compreende adicionar uma solução de pelo menos um crioprotetor ao DNA plasmidial purificado, obtendo dessa maneira uma solução isotônica, subsequentemente liofilizando a solução isotônica e armazenando liofilizado em uma temperatura entre +2°C a +8°C, em que a concentração do DNA plasmidial purificado antes da liofilização é de 0,1 a 10 mg/ml e o pH da solução isotônica está entre 7,0 a 9,0.

[0010] A composição farmacêutica pode ser usada para a preparação de uma solução para injeções pretendidas para administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, subcutânea e intradérmica. Ela pode ser usada para a administração cutânea como um gel para implante sobre um veículo reabsorvível ou não reabsorvível.

[0011] A composição farmacêutica é pretendida para a preparação de uma solução ex tempore ou, de outra maneira, para administração intramuscular ou qualquer outra administração endógena a um indivíduo (paciente, pessoa ferida, animal) para induzir o desenvolvimento no tecido do vaso sanguíneo.

[0012] Uma das indicações terapêuticas da composição farmacêutica são condições isquêmicas de várias etiologias que incluem uma doença arterial coronariana, doenças arteriais obliterativas crônicas do membro inferior; situações que necessitam de processos de reparação de tecido para correção, por exemplo lesões importantes, persistentes (úlceras), incluindo queimaduras, lesões localizadas incluindo fraturas e defeitos ósseos.

[0013] Outro objetivo da invenção é um método para aplicação da composição farmacêutica que compreende aplicar uma quantidade eficaz da composição farmacêutica para fornecer um efeito terapêutico que depende de uma forma nosológica e de indicação médica, a um indivíduo humano.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0014] Uma apreciação mais completa das modalidades e várias das suas vantagens em anexo serão prontamente obtidas como as mesmas se tornam melhor compreendidas pela referência a seguinte descrição detalhada, quando considerada em conjunto com as figuras em anexo, em que:

[0015] A Figura 1 mostra um mapa de expressão do plasmídeo pCMV-VEGF165 (extensão é de 4859 pares de bases). As seguintes abreviações são usadas: "região promotora/intensificadora precoce de CMV" - uma região promotora/intensificadora de genes precoces de citomegalovírus; uma região intensificadora; "promotor de CMV" - uma região promotora de citomegalovírus; "TATA-box" - um elemento TATA; "inicio da transcrição" - um ponto do ínicio da transcrição; "Kozak" - sequência de Kozak; "códon de partida" - o primeiro códon da fase de leitura aberta de VEGF165; "VEGF165" - o polipeptídeo da fase de leitura aberta (ORF) do fator 165 de crescimento endotelial vascular; "códon de parada"; "SV40 pA term" - um sinal de poliadenilação e um vírus terminador SV40; "iniciador no sentido direto de CMV" - a região de anelamento do iniciador no sentido direto de CMV padronizado; "iniciador20 no sentido direto de M13" - a região de anelamento do iniciador20 no sentido direto de M13 padronizado; "iniciador no sentido direto pUc de M13" - região de anelamento do iniciador padronizado pUc de M13 no sentido direto; "pBR322 ori" - região de origem do plasmídeo de replicação pBR322; "origem f1" - região de origem da replicação do bacteriófago f1; "promotor AmpR" - promotor procariótico do gene bla; "NTPII (neomicina fosfotransferase; KanR") - sequência que codifica aminoglicosídeo-3’-fosfotransferase que fornece resistência bacteriana à canamicina. As setas mostram as direções da transcrição do gene, os números do primeiro e do último fragmento de nucleotídeo são fornecidos entre parênteses. Os sítios de reconhecimento para endonucleases de restrição são fornecidos em itálico, nucleotídeos nos pontos de corte são dados entre parênteses.

[0016] Figura 2 mostra um angiograma de um paciente com 74 anos de idade com isquemia crônica do membro inferior. Diagnóstico: aterosclerose, doença oclusiva fêmur-poplítea bilateral, estágio IIb-III (dor em repouso). Valores na admissão: índice tornozelo-braquial - 0,48 (direito), 0,32 (esquerdo); pressão de oxigênio transcutânea parcial - 61 mmHg. O paciente fazia terapia física como parte do tratamento complexo padronizado (dextrans, anti-agregantes). Valores em 90 dias: distância percorrida - 130 m; índice tornozelo-braquial - 0,5 (direito), 0,57 (esquerdo); pressão de oxigênio transcutanea parcial - 78 mmHg. A, B- angiogramas antes do tratamento: terço superior e médio da coxa (A); tornozelo (B); C, D- angiogramas com 90 dias depois da administração de Neovasculgen como parte do complexo de terapia; terço superior e médio da coxa (C); tornozelo (D). Vasos sanguíneos satisfatoriamente preenchidos com sangue são mostrados com setas que incluem vasos colaterais em evolução.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0017] Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências aqui mencionadas estão incorporadas pela referência em sua totalidade. Adicionalmente, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não são pretendidos ser limitantes, a menos que especificado de outra maneira. O DNA plasmidial que codifica um fator de crescimento endotelial vascular pode ser obtido pela ligação da fase de leitura aberta (ORF) do cDNA de VEGR humano com um vetor de plasmídeo que fornece a expressão dos genes codificados em células humanas, assim como a replicação do plasmídeo em células de Escherichia coli. Exemplos de vetores podem ser os plasmídeos pcDNA, pCMV-Script e pBK-CMV (uma fonte - banco de dados eletrônico em Hypertext Transfer Protocol://addgene.org/vector- database/). Um componente necessário do vetor é um promotor eucariótico. Exemplos não limitantes dos promotores incluem, mas não são limitados ao promotor/intensificador precoce de citomegalovírus (CMV), promotor do fator 1 alfa de alongamento da tradução humana (EF1a), promotor de ubiquitina C humana (Ubc), promotor do vírus de vacuolização de símio (SV40), promotor de fosfoglicerato quinase 1 (PGK) de murino e promotor de beta actina humana. Um grupo de vetores mais preferíveis para a expressão de VEGF são os vetores adequados para células humanas que contêm o promotor imediato precoce de citomegalovírus (daqui por diante - promotor de CMV), um gene de resistência ao antibiótico e uma região para uma origem de replicação que fornece o número moderado ou alto de cópias de plasmídeo que pode ser, por exemplo, a origem de replicação de ColE1, pUC, pBR322 ou p15A. Um grupo mais preferível de vetores incluem um gene que fornece resistência ao antibiótico canamicina que codifica a neomicina fosfotransferase (NPT II), que permite excluir o uso de antibióticos do grupo da ampicilina do processo de produção de um plasmídeo. Como os vetores para a obtenção do DNA plasmidial-alvo, plasmídeos que codificam uma ORF de outros genes podem ser usados. O DNA plasmidial-alvo pode ser obtido a partir de tais moléculas de DNA plasmidial pela eliminação de uma região de ORF de um gene heterólogo com o uso de endonucleases de restrição, isolamento do fragmento aceptor de DNA e sua ligação subsequente com o fragmento de DNA doador que codifica a ORF do cDNA de VEGF humano. Um exemplo de plasmídeo aceptor pode ser o plasmídeo pEGFP-N2. Uma região da fase de leitura aberta do cDNA de VEGF humano pode ser selecionada entre, por exemplo, quatro variantes de splice conhecidas que codificam isoformas de VEGF que possuem uma extensão de 121, 145, 165 ou 189 aminoácidos. Uma isoforma de VEGF mais preferida para obtenção do DNA plasmidial é a variante de splice que possui a extensão de 165 aminoácidos. A região da ORF do cDNA de VEGF humano pode ser derivada do cDNA total de tecido humano ou sintetizado a partir de oligonucleotídeos que se superpõem.

[0018] Na parte sintética da ORF do cDNA de VEGF humano, uma parte ou todos os códons podem ser substituídos pelos códons degenerados. O fragmento sintético de cDNA pode substituir a região natural se ele fornece a vida útil do cDNA e a eficiência da tradução do gene-alvo comparável com aquela do fragmento natural. O cDNA de VEGF que é usado para a obtenção de um plasmídeo-alvo pode conter um polimorfismo conhecido (substituição de nucleotídeos isolados) que não altera a composição de aminoácidos do polipeptídeo codificado. O uso de cDNA de VEGF que contém tal polimorfismo não altera as propriedades do derivado do plasmídeo-alvo. Um plasmídeo mais preferível que codifica VEGF e é pretendido para uso médico é um produto de ligação da ORF da região de VEGF da isoforma que possui 165 aminoácidos e o fragmento aceptor do plasmídeo pBK-CMV.

[0019] O DNA plasmidial pCMV-VEGF165, que está descrito na patente RU2297848, tem 4859 pares de base de extensão e tem a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:1. A estrutura do plasmídeo pCMV-VEGF165 está apresentada na Fig. 1.

[0020] O plasmídeo que tem 4859 pares de base compreende: 1. A região entre os nucleotídeos 1 a 361, da sequência entre os nucleotídeos 968-4859 do vetor pBK-CMV, que inclui: 1.1 os elementos que fornecem a expressão de um gene-alvo em células de mamífero: a região do promotor/intensificador precoce de CMV (nucleotídeos 4626 - 355) que inclui a região intensificadora (nucleotídeos 4684-231) e o promotor de citomegalovírus (nucleotídeos 274-355); o elemento TATA box (nucleotídeos 320-326); o início da transcrição (349); o sinal de poliadenilação e o terminador do vírus SV40 (nucleotídeos 1306-1531); e 1.2 . os elementos que mantêm a presença do plasmídeo em células bacterianas, a região de iniciação de replicação do bacteriófago f1 (nucleotídeos 1583-1995); o promotor procariótico do gene bla (nucleotídeos 2058-2086); a sequência que codifica aminoglicosídeo-3’- fosfotransferase que fornece resistência bacteriana a canamicina (nucleotídeos 2519-3313); e a região de replicação do plasmídeo de pBR322 (nucleotídeos 3907-4526); 2. A região entre os nucleotídeos 362-967, que inclui a sequência de Kozak (nucleotídeos 380-391) que está localizada em volta do códon de partida de um gene-alvo e fornece a iniciação da tradução de mRNA do gene-alvo, a fase de leitura aberta do gene que codifica VEGF 165 (nucleotídeos 392-964) e o códon de parada (nucleotídeos 965-967).

[0021] O plasmídeo contém os sítios de reconhecimento para endonucleases de restrição NdeI (1); BamHI (364); EcoRI (373); BsrGI (854); Xmal (969); Acc651 (978); Bell (1307); Narl (2650); ApaLI (4254); e Pcil (4568).

[0022] O plasmídeo foi obtido pelo uso de métodos conhecidos de manipulação de gene, plasmídeos comercialmente disponíveis e regiões clonadas de cDNA humano (Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning. 2nd ed. New York, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989).

[0023] Os elementos do plasmídeo recrutados conforme eles estão localizados. Posições mútuas dos elementos funcionais são importantes para a atividade efetiva do plasmídeo. Como um plasmídeo recombinante, de acordo com um objetivo da invenção, vários plasmídeos que podem ser usados contêm o gene que codifica VEGF165 sob o controle de um promotor eucariótico.

[0024] Fragmentos de DNA que codificam os mesmos elementos regulatórios podem ser derivados pela modificação da sequência de nucleotídeos de um fragmento de DNA (SEQ ID NO:1), por exemplo, com o uso de mutagênese direcionada ao sítio, em que um ou mais nucleotídeos em certos sítios podem ser deletados, inseridos ou adicionados. Os fragmentos de DNA modificados, como mencionados acima, podem ser derivados com o uso de métodos de processamento conhecido para a geração de mutações.

[0025] Para obter uma cepa produtora, o DNA plasmidial pCMV- VEGF165 pode ser inserido (transformado) em uma célula bacteriana, preferivelmente na bactéria Escherichia sp., suscetível a tal transformação pelo plasmídeo. A seleção das células transformadas não é crucial, já que os métodos e abordagens de transformação são conhecidos. Apesar de depender do tipo da célula e das condições de cultura dos transformantes derivados, a abundância e o conteúdo total do plasmídeo pCMV-VEGF165 na suspensão bacteriana pode variar, o plasmídeo-alvo poderá estar presente devido a transformação bem sucedida da célula receptora. A transformação do plasmídeo na célula implica na introdução do plasmídeo em uma célula usando métodos conhecidos. Os métodos de transformação incluem, por exemplo, um método descrito em Jac A. Nickoloff, Electroporation Protocols for Microorganisms (Methods in Molecular Biology) // Humana Press; 1st edition (August 15, 1995).

[0026] De acordo com uma modalidade, "uma célula bacteriana produtora do plasmídeo CMV-VEGF165" inclui uma célula bacteriana que tem a habilidade de manter, replicar e acumular o plasmídeo CMV- VEGF165, quando a célula bacteriana tiver sido cultivada em um meio de cultura. A expressão "célula bacteriana produtora do plasmídeo pCMV-VEGF165" significa uma célula que é capaz de acumular o plasmídeo pCMV-VEGF165 em não menos do que 1 mg/l (ou 1 μg/109 células) e, mais preferivelmente, em não menos do que 10 mg/l. O plasmídeo pCMV-VEGF165 é acumulado em uma célula, preferivelmente, na forma circular superenrolado.

[0027] Preferivelmente, as bactérias da Escherichia sp. podem ser usadas para a transformação com o plasmídeo pCMV-VEGF165 que codifica o gene de VEGFR sob o controle do promotor de CMV. Um tipo de promotor não é particularmente limitado e pode ser um promotor ativo nos miócitos, fibroblastos e endotélio, por exemplo, SV40 ou EF- 1.

[0028] A expressão "bactéria Escherichia" significa que a bactéria inclui espécies de Escherichia de acordo com a classificação conhecida na microbiologia. Como um exemplo do microrganismo que pertence espécie de Escherichia, a bactéria E. coli pode ser mencionada.

[0029] As espécies de Escherichia que podem ser usadas para transformação não são limitadas, e exemplos não limitantes da bactéria estão descritos no livro de Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Table 1). As cepas receptoras preferidas para a produção do plasmídeo pCMV-VEGF165 são as cepas de E. coli que são derivadas da cepa não patogênica K12 que contém um gene inativado recA1 do sistema de reparação do DNA, assim como um gene inativado da endonuclease endA1. Exemplos de tais cepas são DH5alfa, DH10B, XL-1Blue e TOP10.

[0030] Exemplos de uma cepa receptora para a produção do plasmídeo pCMV-VEGF165 incluem, mas não são limitados a Escherichia coli TOP10. A cepa de Escherichia coli TOP10 é caracterizada pelos sinais morfológicos, fisiológicos e bioquímicos de cultura e características genéticas descritas abaixo.

[0031] A cepa de Escherichia coli TOP10/pCMV-VEGF165 foi depositada no Russian Collection of Agricultural Microorganisms no AllRussia Research Institute for Agricultural Microbiology RCAM ARRIAM RAAS (ARRIAM, 3 Podbelsky chausse, St. Petersburg, Pushkin 8, 196608, RU) em 24 de fevereiro de 2009 e foi concedido o número de acesso 517.

[0032] As particularidades morfológicas de cultura da Escherichia coli TOP10 são: hastes gram-negativas que formam fitas; em meio de agar - forma colônias claras, semitransparentes, convexas, com bordas moderadamente precisas. A cepa é armazenada no meio de Luria- Bertrani contendo glicose 1% e glicerol 10%. A cepa é cultivada no meio de Luria-Bertani. As particularidades genéticas da cepa de Escherichia coli TOP10 são: genótipo da cepa - Δ(araA-leu)7697, [araD139]B/r, Δ(codB-lacI)3, Φ80dlacZ58(M15), galKO, mcrAO, galU-, recAI, endAI, nupG-, rpsL-(strR), Δ(mcrC-mrr)715.

[0033] A transformação da cepa de Escherichia coli TOP10 com o plasmídeo pCMV-VEGF165 resulta na produção da cepa produtora TOP10/pCMV-VEGF165 que fornece a biossíntese do plasmídeo pCMV-VEGF165 na quantidade de 5 a 20 mg/l, quando cultivada em frascos com agitação por 12 a 20 horas no meio de Luria-Bertani com a adição de canamicina até 30 μg/ml, em que não menos do que 70% do plasmídeo pCMV-VEGF165 está presente na forma superenrolada.

[0034] Um método para a preparação do plasmídeo pCMV- VEGF165 altamente purificado inclui cultivar as bactérias acima mencionadas em um meio de cultura adequado para o crescimento das células procarióticas transformadas; selecionar a biomassa celular; ressuspender as células; conduzir a lise alcalina das células; renaturar seletivamente o DNA plasmidial com uma solução ácida; separar o pélete precipitado; concentrar pela ultrafiltração; separar as impurezas estranhas e o RNA por filtração em gel em uma solução que contenha um concentração elevada de sal (por exemplo, salina); separar o DNA genômico residual, endotoxina e impurezas relacionadas pela cromatografia de afinidade (tiofílica); purificação final pela cromatografia com troca de ânion e concentração subsequente; e dessalinização da solução do plasmídeo purificado pCMV-VEGF165 com ultrafiltração/diafiltração.

[0035] A preparação derivada do plasmídeo pCMV-VEGF165, que é adequada para a produção posterior de uma composição farmacêutica e uma forma de dosagem finalizada, é caracterizada pelas seguintes propriedades: 1) Proporção de impurezas relacionadas (formas em anel e lineares relaxadas do plasmídeo) - não mais do que 5% (daqui por diante - a proporção de uma concentração de uma substancia ativa). 2) Proporção de DNA genômico de E. coli - não mais do que 1%. 3) Proporção de RNA - não mais do que 1%. 4) Proporção de proteína total - não mais do que 0,1%. 5) Conteúdo de endotoxina - não mais do que 50 EU/1 mg da substancia ativa.

[0036] Uma solução de DNA plasmidial pCMV-VEGF165 adequada para a produção posterior de uma composição farmacêutica e uma forma de dosagem finalizada pode ser preparada com o uso de outros métodos conhecidos para o isolamento e purificação de DNA, por exemplo, usando um método de lise térmica de bactéria na presença de um detergente, um método de precipitação seletiva de RNA com cloreto de cálcio, um método para a separação de formas superenroladas e relaxadas de plasmídeo com o gradiente de eluição e outros métodos descritos, por exemplo, em D.M.F. Prazeres, "Plasmid Biopharmaceuticals: Basics, Applications and Manufacturing", John Wiley & Sons, Inc., (2011) ISBN: 978-0-470-23292-7.

[0037] Uma forma de dosagem finalizado do DNA plasmidial pCMV- VEGF165 deve ser adequada para injeções intramusculares e não deve alterar significativamente as propriedades da substancia ativa durante o armazenamento em longo prazo. Uma forma de dosagem finalizada possível do plasmídeo pCMV-VEGF165 inclui, mas não está limitada a uma solução congelada, uma solução líquida, liofilizado, isto é, uma solução seca por congelamento e um filme amorfo.

[0038] Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende uma preparação de DNA plasmidial purificado que codifica um fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) sob o controle de elementos genéticos funcionais que fornecem expressão de gene em células humanas e uma quantidade eficaz de pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável para o fornecimento de uma solução isotônica, em que o pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável é pelo menos um crioprotetor que seja um veículo, um estabilizador do pH ou uma combinação desses, em que a concentração do DNA plasmidial purificado esteja entre 0,1 a 10 mg/l e o pH da composição esteja entre 7,0 a 9,0.

[0039] Em outra modalidade, a composição farmacêutica compreende o DNA plasmidial purificado e uma quantidade eficaz de glicose e fosfato de sódio para formar uma solução isotônica para injeção, em que o pH da composição é 7,8.

[0040] Em outra modalidade diferente, o pH da composição está entre 7,2 a 8,5 e preferivelmente entre 7,4 a 8,2.

[0041] Em outra modalidade, a composição compreende DNA plasmidial purificado, entre 200 a 400 mM de glicose e entre 3 a 30 nM de fosfato de sódio.

[0042] Em uma modalidade diferente, a composição farmacêutica compreende entre 0,8 a 1,2 mg/ml do DNA plasmidial purificado pCMV- VEGF165, entre 280 a 320 mM de dextrose; e entre 8 a 12 mM de fosfato de sódio, em que o pH da composição está entre 7,4 a 8,2.

[0043] Uma variante mais preferível da forma dosagem finalizada é uma solução líquida ou um liofilizado, já que elas podem ser armazenadas em temperaturas positivas, isto é, em refrigeradores farmacêuticos padronizados e não requerem um grande período de tempo para a preparação das injeções.

[0044] Uma variante até mais preferida da forma de dosagem finalizada é um liofilizado, já que a ausência de água retarda potencialmente as reações químicas da degradação da cadeia de DNA o que resulta na conversão do DNA plasmidial superenrolado na forma circular relaxada. Além disso, quando uma forma de dosagem líquida do DNA plasmidial é armazenada, um contato em longo prazo da solução e um material de lacre de borracha pode ocorrer, em que o lacre de borracha pode conter potencialmente íons extraíveis de metais de transição que podem acelerar a degradação das cadeias de DNA por meio da catalisação da formação de radicais hidroxila.

[0045] A preparação do liofilizado, isto é, uma massa amorfa ou microcristalina porosa, requer a presença de excipientes em uma solução a ser liofilizada que atuem como crioprotetor, estabilizador do pH, agente quelante, antioxidante e/ou veículo. O conjunto mínimo possível de excipientes pode incluir pelo menos um crioprotetor que tenha propriedades de um veículo, um estabilizador do pH ou uma combinação desses. Um excipiente que seja um crioprotetor e um veículo pode ser pelo menos um componente selecionado do grupo que consiste em um mono ou dissacarídeo, poliol e polímero, por exemplo, selecionado do grupo que consiste em sucrose, lactose, trealose, manitol, sorbitol, glicose, rafinose, polivinil pirrolidona e uma combinação desses. O estabilizador do pH pode ser pelo menos um componente selecionado do grupo que consiste em citrato de sódio, fosfato de sódio, Tris-HCl, Tris-acetato, glicina, metionina, arginina, histidina e outros aminoácidos.

[0046] Enquanto estudava várias composições farmacêuticas do DNA plasmidial pCMV-VEGF165, o inventor descobriu surpreendentemente que a maior estabilidade sob condições de armazenamento em uma temperatura entre +2 a +8°C foi fornecida pela combinação de excipientes tais como glicose e fosfato de sódio em pH 7,8.

[0047] Quando o volume de uma solução é o mesmo antes e depois da liofilização, a composição ótima da solução que fornece propriedades preservadas do DNA plasmidial pCMV-VEGF165 no processo de liofilização e armazenamento posterior é como a seguir: 1. Concentração do DNA plasmidial está entre 0,1 a 10 mg/ml, preferivelmente entre 0,5 a 4 mg/ml e mais preferivelmente entre 0,8 a 1,2 mg/ml. 2. Concentração de glicose (dextrose) está entre 200 a 400 mM, preferivelmente entre 250 a 350 mM e mais preferivelmente entre 280 a 320 mM. 3. Concentração de fosfato de sódio (uma mistura de fosfato trissódico, dissódico e monossódico) está entre 3 a 30 mM, preferivelmente entre 5 a 20 mM e mais preferivelmente entre 8 a 12 mM. 4. O pH da solução está entre 7,0 a 9,0, preferivelmente entre 7,2 a 8,5 e mais preferivelmente entre 7,4 a 8,2.

[0048] A estrutura do plasmídeo usado para a preparação de uma cepa produtora e uma composição farmacêutica são fornecidas na Figura 1.

[0049] Outro objetivo da invenção é um método para o armazenamento do DNA plasmidial purificado que codifica um fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) compreende adicionar uma solução de pelo menos um crioprotetor ao DNA plasmidial purificado, obtendo dessa maneira uma solução isotônica, subsequentemente liofilizando a solução isotônica e armazenando o liofilizado em uma temperatura entre +2°C a +8°C, em que a concentração do DNA plasmidial purificado antes da liofilização está entre 0,1 a 10 mg/ml e um pH da solução isotônica está entre 7,0 a 9,0. Em uma modalidade, pelo menos um crioprotetor é a glicose e a proporção em massa de glicose para o DNA plasmidial purificado na solução isotônica é de 1:50.

[0050] Em uma modalidade, o pelo menos um crioprotetor é a glicose e uma proporção de DNA plasmidial relaxado no liofilizado armazenado por 3 meses não é mais do que 10%. Em outra modalidade, o pelo menos um crioprotetor é o fosfato de sódio, em que o conteúdo de fosfato de sódio está entre 5 a 20 mM e o pH da solução isotônica está entre 7,0 a 9,0.

[0051] Outro objetivo da invenção é um método para a aplicação da composição farmacêutica, que compreende aplicar uma quantidade eficaz da composição farmacêutica para fornecer um efeito terapêutico que depende de uma forma nosológica e uma indicação médica para um indivíduo humano.

[0052] Tendo descrito o objetivo da invenção, uma compreensão adicional pode ser obtida pela referência a certos exemplos específicos que são fornecidos aqui com o propósito apenas de ilustração e não são pretendidos ser limitantes a menos que especificado de outra maneira. É apropriado dar exemplos sobre a possível implementação da invenção: preparação do DNA plasmidial pCMV-VEGF165.

EXEMPLOS Exemplo 1. Preparação de uma solução para o DNA plasmidial pCMV- VEGF165. Preparação de inóculos

[0053] Um frasco de inóculos preservados da cepa produtora TOP10/pCMV-VEGF165 de uma base de trabalho foi recuperado da base de trabalho e o inóculo foi cultivado em 50 ml de um meio líquido.

Biossíntese de pDNA

[0054] Um fermentador com um frasco de 10 litros foi preparado, o frasco foi esterilizado com um meio tubos de liberação e remoção foram assepticamente fixados, um conjunto de medição de parâmetros de conexão foi calibrado, o fermentador foi inoculado e cultivado por 8 horas até que uma concentração constante de oxigênio dissolvido (fase de crescimento estacionário da cultura) fosse obtida com uma taxa fixa de um misturador de 1000 rpm, depois que a aeração foi paralisada e o frasco foi resfriado. Uma amostra de uma suspensão de cultura foi transferida para a análise da densidade de cultura.

Produção de biomassa

[0055] A biomassa, isto é, o pélete celular, foi separada da cultura líquida em uma centrifuga de piso intermitente de alta velocidade com um rotor de ângulo fixo. O sobrenadante do líquido de cultura foi transferido para uma autoclave para desinfecção e neutralização. A biomassa derivada foi mantida em bolsas de centrífuga em baixa temperatura em um refrigerador. Uma amostra da biomassa foi transferida para análise do conteúdo e integridade da substância-alvo. Suspensão, lise e neutralização da biomassa

[0056] Biomassa descongelada foi transferida para um recipiente de lise e suspensa com um agitador superior em uma solução da suspensão. A lise celular foi realizada com uma solução de hidróxido de sódio e dodecil sulfato de sódio pela misturação com o agitador superior por 5 minutos. Durante a misturação, uma solução de acetato de potássio foi adicionada para neutralização e formação simultânea do precipitado de restos celulares, DNA genômico ligado a histonas e proteínas. O precipitado foi formado como resultado da transformação de dodecil sulfato de sódio em um sal de potássio insolúvel e coagulação da micela. Ao mesmo tempo, a neutralização da solução resultou na renaturação do DNA plasmidial.

Preparação de lisina clarificada

[0057] A suspensão obtida foi transferida para bolsas de centrifugação e o precipitado foi separado em uma centrifuga de piso intermitente de alta velocidade com um rotor de ângulo fixo. O sobrenadante do líquido de cultura foi transferido para desinfecção e neutralização em uma autoclave. A solução foi clarificada do DNA plasmidial que também continha compostos relacionados - uma forma relaxada e linear do DNA plasmidial, assim como impurezas estranhas tais como DNA genômico, RNA, proteínas e LAL-endotoxina residuais - foi coletada no vaso de alimentação de um conjunto de ultrafiltração.

Ultrafiltração

[0058] A solução de DNA plasmidial foi concentrada pela ultrafiltração em fluxo tangencial com cartuchos de fibra oco com o ponto de corte limite de 500 kDa. Como parte da ultrafiltração, a remoção adicional por 9 vezes das moléculas que possuem um tamanho menor do que 3kDa também ocorreu, por exemplo, remoção de proteínas, transporte de RAN, LAL-endotoxina e fragmentos curtos de DNA genômico. A solução foi concentrada até 9 vezes. A solução concentrada de plasmídeo foi coletada em um frasco de vidro, a unidade de ultrafiltração foi lavada com uma solução para filtração em gel e combinada com a solução concentrada do DNA plasmidial.

Filtração em Gel

[0059] Um primeiro processo de purificação cromatográfica profunda pela filtração em gel sobre um sorvente de dextrina de poros grosseiros Sparse 6 Fast Flow "GE Lifesciences" foi realizado. Uma solução que possui uma alta concentração de sal que continha sulfato de amônia 2,1 M e EDTA-Na 10 mM foi usada para possibilitar a separação das moléculas de acordo com seus tamanhos e reter as impurezas de RNA e ALL-endotoxina com o sorvente devido a interação hidrofóbica não específica. Uma solução com impurezas e soluções de lavagem foram coletadas em um vaso e descartadas oportunamente. Uma solução de DNA plasmidial meio purificado que continha sulfato de amônia 2,1 M, foi coletada em um recipiente de vidro.

Cromatografia de afinidade

[0060] Um segundo processo de purificação cromatográfica profunda pela cromatografia tiofílica (pseudo-afinidade) sobre um sorvente PlasmidSelect Xtra "GE Lifesciences" foi conduzido. Para lavar a coluna, uma solução que continha sulfato de amônia 2,0M foi usada e a solução meio purificada foi aplicada a uma coluna com a concentração de sulfato de amônia de 2,1 M. Quando a solução foi aplicada, todas as formas de DNA e a proporção do DNA residual foram adsorvidas sobre o sorvente, no qual as proteínas residuais e endotoxina não foram absorvidas. Depois da aplicação, a coluna foi lavada com uma solução de sulfato de amônia que possui uma concentração de 2,0 M, na qual o DNA residual, DNA genômico e composições relacionadas ao DNA plasmidial são eluídas. A substancia ativa HSCI-01 foi eluída com uma solução de sulfato de amônia que possui uma concentração de 1,7 M. A coluna foi regenerada e purificada com uma solução de hidróxido de sódio que possui a concentração de 0,1 M. Uma solução com impurezas e soluções de lavagem foi coletada em um recipiente e descartada oportunamente. Uma solução de DNA plasmidial meio purificado foi coletada e continha sulfato de amônia 1,7 M em um recipiente de vidro e diluída com água para injeção na proporção de 1:2.

Cromatografia de troca de ânion

[0061] Um terceiro processo de purificação cromatográfica profunda pela cromatografia de troca de ânion sobre um solvente SOURCE 30Q "GE Lifesciences" foi conduzido. Uma substancia ativa foi absorvida sobre uma coluna e lavada com uma solução contendo cloreto de sódio 0,4 M. Quando a coluna foi lavada, um cátion da substancia ativa foi substituído de um íon de amônia para um íon de sódio e a endotoxina residual foi eluída. A substância ativa foi eluída com uma solução de cloreto de sódio 1M. Uma solução contendo impurezas e soluções de lavagem foi coletada em um recipiente e descartada oportunamente. Uma solução do DNA plasmidial purificado foi coletada em um recipiente de vidro.

Ultrafiltração e diafiltração

[0062] A solução do DNA plasmidial purificado foi concentrada pela ultrafiltração em um aparelho com um módulo de fibra oca com um limiar de ponto de corte de 300 kDa. Quando a concentração de 0,25% foi atingida, o aparelho foi mudado para o modo de diafiltração e uma troca completa de tampão com água para injeção foi realizada. O filtrado foi coletado em um recipiente e descartado oportunamente. O filtrado foi vertido em um recipiente de vidro e a concentração do DNA plasmidial superenrolado foi medida em uma temperatura abaixo de 70°C.

Exemplo 2. Produção de variantes liofilizadas para estudos de estabilidade

[0063] Para derivar variantes de uma composição farmacêutica, uma solução sem sal do DNA plasmidial pCMV-VEGF165 que possui uma concentração de aproximadamente 2,5 mg/ml e o conteúdo residual de Tris-GCl, pH = 7,5 e NaCl não mais do que 1 mM foram usados. Como crioprotetores, a glicose, sucrose e lactose foram adicionadas para atingir os requisitos de não menos do que aqueles da European Pharmacopeia. Como estabilizador do pH, uma solução de fosfato de sódio que tem um pH entre 7,2 a 9,0 foi usada. Um sacarídeo na concentração final de 300 mM e fosfato de sódio na concentração final de 10 mM foram usados. Tais concentrações dos excipientes forneceram a isotonicidade da solução para administração endógena. A concentração final de DNA nas composições farmacêuticas derivadas era de 1 mg/ml. A liofilização foi conduzida em frascos de vidro de 5 ml que foram equipados com lacres de borracha meio abertos para liofilização e preenchidos com 1,2 ml das soluções de teste. Um regime de secagem de liofilização para todas as amostras de teste é mostrado na Tabela 1 abaixo. Tabela 1. Regime de secagem de liofilização

[0064] A pressão na câmara de trabalho no processo de secagem era de 60 μbar, a temperatura do produto depois da finalização do estágio de congelamento não deve ser maior do que -45°C, isto é, 2°C menor do que a temperatura de transição vítrea (Tg) da glicose e mais do que 10°C menor do que a Tg de todos os outros açúcares. A temperatura do produto depois da liofilização não deve ser menor do que 15°C. A temperatura dos produtos foi medida com termopares congelados nos frascos com simuladores do produto que contêm todos os excipientes, exceto o DNA. Depois da secagem final, os frascos foram pressurizados em uma atmosfera de ar seco estéril com bateria de compressão. Os frascos não carregados foram fechados com tampas de alumínio.

[0065] Para comparar a estabilidade do produto quando armazenado em uma temperatura elevada, uma solução de fosfato de sódio que tem um pH de 7,8 que foi usada, foi obtida pela mistura de soluções de fosfato dissódico e monossódico na proporção molar de 91,5 para 8,5. Os frascos liofilizados fechados foram armazenados a +37°C em um termostato seco, em que o conjunto de frascos era retirado uma vez por mês, o liofilizado foi dissolvido e uma proporção do DNA plasmidial relaxado foi medido pela cromatografia de troca de íon analítica. Os resultados da medição são apresentados na Tabela 2. Tabela 2. Proporção de DNA plasmidial relaxado armazenado em uma temperatura elevada

[0066] Foi estabelecido que a glicose que foi usada como crioprotetor forneceu a taxa mais baixa de degradação para o DNA plasmidial superenrolado na proporção em massa do sacarídeo para DNA de 1:50 e um pH=7,8.

[0067] Como para a composição farmacêutica que contêm glicose, o relacionamento entre a estabilidade do DNA plasmidial superenrolado e o pH da solução e a concentração de fosfato de sódio (pH 7,8) foi investigado. Foi estabelecido que a estabilidade do DNA plasmidial superenrolado não tinha se alterado significativamente nas várias concentrações de fosfato de sódio entre 5 a 20 mM (dados não mostrados). Para os vários pH da solução, foi mostrado (veja a Tabela 3) que não houve alteração significativa na estabilidade para o pH na faixa entre 7,8 a 9,0, mas a estabilidade do DNA plasmidial superenrolado estava diminuída em pH 7,2. Tabela 3. Proporção de DNA plasmidial relaxado armazenado em uma temperatura elevada e vários níveis de pH.

[0068] Portanto, de acordo com os dados de armazenamento acelerados, uma composição farmacêutica pode ser selecionada quando uma faixa de pH da composição está entre 7,8 a 9,0 e a concentração de fosfato de sódio está entre 5 a 20 mM. Como a concentração de grupos fosfato ionizados no DNA com uma concentração de DNA de 1mg/ml é de aproximadamente 3 mM, e uma concentração de sais do tampão deve exceder significativamente a concentração total de grupos ionizados em uma substancia ativa, a concentração ótima de fosfato de sódio foi selecionada para ser 10 mM. O pH ótimo da solução era de 7,8, já que tal valor é o mais próximo do pH fisiológico (7,2 a 7,4). Entretanto, deve ser considerado que o pH deve estar o mais próximo de 7,2 quanto possível e quanto maior nível de pH, maior a estabilidade do plasmídeo (até 9,0). Provavelmente, o DNA plasmidial preserva sua estabilidade em uma temperatura de armazenamento entre +2°C a +8°C e um pH de 7,0 a 9,0, que é suficiente para a terapia de gene.

Exemplo 3. Formulação de uma solução de DNA plasmidial purificado e produção da forma de dosagem finalizada

[0069] O DNA plasmidial como mostrado no Exemplo 1, foi obtido antes do fim do estágio da cromatografia com troca de ânion. Os seguintes estágios foram realizados como descrito abaixo.

Ultrafiltração e diafiltração

[0070] A solução do DNA plasmidial purificado foi concentrada pela ultrafiltração em um aparelho com um módulo de fibra oca com um limiar de ponto de corte de 300 kDa. Quando a concentração de 0,15% foi atingida, o aparelho foi mudado para o modo de diafiltração e uma troca completa de tampão com água para injeção foi realizada para uma solução de fosfato de sódio que tem uma concentração de 10 mM e um pH de 7,8, contendo 4,4% (300 mM) de glicose em água para injeção. O filtrado foi coletado em um recipiente e descartado oportunamente. O filtrado foi coletado em um recipiente e foi descartado oportunamente. A solução formulada concentrada foi vertida em um recipiente de vidro, a concentração do DNA plasmidial superenrolado foi medida e a solução foi trazida para uma concentração final de DNA de 0,1%.

Esterilização por filtração

[0071] A solução da substancia finalizada foi transferida para uma área limpa de classe A e a esterilização por filtração com um filtro de membrana em recipientes estéreis sem pirogênio de 250 ml para soluções para infusão de acordo com GOST 19808-86 foi conduzida. As amostras a serem transferidas para o departamento de controle de qualidade foram selecionadas, os recipientes foram fechados com lacres de borracha, depois fechados com tampas de alumínio e foram congelados em uma zona de quarentena de um depósito. A solução formulada de DNA plasmidial foi descongelada e transferida para uma área limpa de classe A. Os recipientes foram abertos e a esterilização por filtração foi realizada com discos de filtro de membrana para recipientes estéreis sem pirogênio de 250 ml para soluções para infusão de acordo com GOST 19808-86. A solução foi vertida em condições estéreis para frascos esterilizados para insulina de 5 ml de acordo com GOST 19808-86. Os frascos foram fechados com lacres de borracha de acordo com TU 38.006-269-90 e transferidos para a liofilização. Os frascos foram colocados sobre suportes de um liofilizador, foram congelados a -45°C e uma secagem a vácuo no estágio 3 foi realizada. Foram colocados lacres, os frascos foram retirados e foram fechados com tampas de alumínio de acordo com GOST P 51314-99.

Exemplo 4. Verificação da estabilidade da forma de dosagem finalizada de pCMV-VEGF165

[0072] Os frascos com o liofilizado estéril do DNA plasmidial pCMV- VEGF165 foram armazenados em um refrigerador farmacêutico a +4°C por 2,5 anos e a análise da proporção de impurezas relacionadas foi conduzida pela cromatografia de troca de ânion uma vez em 6 meses. Os resultados da análise estão apresentados na Tabela 4. Tabela 4. Estabilidade da forma de dosagem finalizada mantida na temperatura de +4°C

[0073] Portanto, a forma de dosagem do DNA plasmidial pCMV- VEGF165 ficou estável por pelo menos dois anos.

Exemplo 5. Verificação da eficiência da composição farmacêutica.

[0074] A eficácia do tratamento com uma composição farmacêutica que contém excipientes, em adição à construção do plasmídeo, foi confirmada em pacientes com isquemia crônica do membro inferior, isto é, os resultados do tratamento com a composição farmacêutica que contêm os excipientes foram inesperadamente superiores comparados ao tratamento com a composição que inclui apenas o plasmídeo (monoterapia). A maior eficácia do tratamento foi determinada no estudo que envolveu 75 pacientes com isquemia crônica do membro inferior (estágio 2a-3 de acordo com A.V. Pokrovsky-Fontaine (A.V. Pokrovsky, 2004; Inter-Society Consensus for the Management of Peripheral Arterial Disease (TASC II). Eur. J. Vase. Endovasc. Surg., oxygen pressure, ankle-brachial index and a linear blood flow rate in the posterior tibial artery.

[0075] Distância percorrida. Depois de 3 meses de tratamento, a distância percorrida pelos pacientes do grupo clínico foi de 236,49±193,49 m (distância média) e em 6 meses de 28.73±242,02 m (distância média) de 20 a 1500 m de todas as distancias obtidas) O aumento da distância média que o paciente podia caminhar sem dor foi de 149,47 m no grupo de estudo, em que a média tinha aumentado em 127,5 m e a diferença entre os valores foi estatisticamente significativa (p=0.006).

[0076] No grupo de controle, a distância média que um paciente podia caminhar sem dor diminuiu em 1,42 m, a média aumentou em 35,0 m e a diferença entre os valores não foi estatisticamente significativa (p=0,6). As diferenças na dinâmica dos valores entre os grupos (+150,89 para o valor médio e +92,5 para a média) foram estatisticamente significativos (p=0,001).

[0077] Pressão de oxigênio transcutânea. No grupo clínico, houve uma tendência para um aumento estável do valor médio de TPO de 76,69±9,96 mmHg na primeira visita para 85,42±10,87 mmHg na quarta visita. O grupo de controle teve dinâmicas opostas, isto é, houve uma diminuição no valor médio de 76,89±55,76 mmHg para 75,37±61,57 mmHg para o mesmo período de observação. As diferenças observadas entre os valores no grupo clínico eram significativas e a diferença no grupo de controle não era significativa (p=0,096), isto é, os valores dos pacientes quase não se alteraram como parte do tratamento padronizado. As diferenças registradas nos aumentos dos valores médios de TPO entre os grupos (+10,25) e a média (+8,00) foram estatisticamente significativas (p=0,0001). O aumento relativo dos valores nos grupos foi: +12,40±17,69% no grupo clínico e 2,12±4,38% no grupo de controle (p=0,001).

[0078] Índice tornozelo braquial. O ABI da extremidade inferior alvo tinha uma tendência a aumentar nos pacientes do grupo clínico e a diminuir nos pacientes do grupo de controle. Portanto, no grupo clínico, o valor da linha de base 0,513±0,182 aumentou durante a terapia em 0,057 e era de 0,57 com 6 meses. A diferença observada dos valores entre a quarta e a primeira visitas no grupo clínico foi significativa (p=0,001). No grupo de controle, o índice diminuiu em 0,02 unidades com seis meses, isto é, de 0,458±0,182 para 0,438±0,187. Entretanto, as alterações não foram significativas (p=0,5).

[0079] A diferença entre os valores médios aumentados de ABI entre os grupos foi de +0,077 (média de +0,0065), as diferenças registradas foram significativas.

[0080] Taxa de fluxo sanguíneo linear (de acordo com a ultrassonografia Doppler da artéria tibial posterior. Nos pacientes do grupo clínico, o valor teve uma tendência a aumentar durante o período de estudo: o valor médio aumentou em 8,24 cm/seg., a média em 5,0 cm/seg., isto é, de 14,95±10,19 cm/seg. até 23,19±12,71 cm/seg. em seis meses. Nos pacientes do grupo de controle, o valor aumentou em 1,30 cm/seg. (de 17,60±6,60 cm/seg. no início do estudo, até 18,90±6,77 cm/seg. em seis meses), enquanto que a média não se alterou, isto é, ficou no nível de 20,0 cm/seg. Durante o estudo, as diferenças entre os grupos foram estatisticamente significativas (p=0,005).

[0081] Os valores médios no grupo clínico aumentaram em uma extensão maior comparados com os valores mostrados pelo grupo de controle (+6,94 cm/seg.), assim como a média (+5,00 cm/seg.); a diferença nos valores foi estatisticamente significativa (p=0,005). Portanto, com base no critério de eficiência da "distância percorrida sem dor", os valores tiveram um aumento significativo nos pacientes, de 135,3 m na primeira visita para 248,7 m em seis meses (aumento de 110,5%) o que é significativamente diferente da tendência do grupo de controle (p=0,001).

[0082] Critérios de eficiência adicionais: ABI - aumentou em 11,11% (p=0,001); TPO - aumentou em 11,38% (p=0.001); LBFR - aumentou em 55,12% (p=0,001).

[0083] Pedido de Patente RU2012137126, depositado em 31 de agosto de 2012 está incorporado aqui por referência. Numerosas modificações e variações dessa invenção são possíveis à luz dos ensinamentos acima. Portanto, deve ser compreendido que dentro do escopo das reivindicações em anexo, essa invenção pode ser praticada de maneira diferente daquela especificamente descrita aqui.

Claims

1. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende: uma preparação purificada do DNA plasmidial pCMV- VEGF165 que codifica um fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) sob o controle de elementos genéticos funcionais que fornecem a expressão de gene em células humanas, em que o DNA plasmidial purificado pCMV-VEGF165 tem a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:1, 3 a 30 mM de fosfato de sódio e 200 a 400 mM de glicose para fornecer uma solução isotônica, e em que a concentração do DNA plasmidial purificado é de 0,1 a 10 mg/ml, e o pH da composição é de 7,4 a 9,0.

2. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é para o tratamento de uma condição isquêmica, incluindo isquemia aterosclerótica dos membros inferiores, doença cardíaca coronária, doenças arteriais obliterativas crônicas dos membros inferiores; ou para o tratamento de feridas ou úlceras selecionadas do grupo que consiste em: feridas, úlceras, feridas e úlceras persistentes, queimaduras, danos locais, fraturas e defeitos ósseos.

3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que compreende o DNA plasmidial purificado e uma quantidade eficaz de glicose e fosfato de sódio para formar uma solução isotônica para injeções, em que o pH da composição é de 7,8.

4. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que apresenta uma das seguintes características: (a) o pH da composição está entre 7,4 a 8,2; (b) a concentração do DNA plasmidial purificado está entre 0,8 a 1,2 mg/ml.

5. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que compreende: de 0,8 a 1,2 mg/ml de DNA plasmidial purificado pCMV- VEGF165; de 280 a 320 mM de glicose; e de 8 a 12 mM de fosfato de sódio, em que o pH da composição está entre 7,4 a 8,2.

6. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que não menos do que 70% do DNA plasmidial purificado está presente na forma superenovelada.

7. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a preparação do DNA plasmidial purificado compreende: não mais do que 5% de impurezas selecionadas do grupo que consiste em: uma forma anelada relaxada, uma forma de plasmídeo linear e uma mistura dos mesmos, não mais do que 1% de DNA genômico, não mais do que 1% de RNA, não mais do que 0,1% de proteína total, e não mais do que 50 EU de uma endotoxina por 1 mg de substancia ativa.