CN105308173B - 用于刺激血管生成的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于在血管组织中诱导生长的药物组合物，其包括编码血管内皮生长因子(VEGF)的纯化的质粒DNA和可药用赋形剂，所述可药用赋形剂包括有效量的作为媒介物和/或用于将pH稳定在7.0到9.0的范围内的pH稳定剂的低温防护剂。本发明还提供了编码VEGF的质粒DNA的储存方法，所述方法包括将纯化的质粒DNA与至少一种低温防护剂的溶液混合，所述低温防护剂具有媒介物和/或pH范围为7.0‑9.0的pH稳定剂的性质。将溶液冻干并储存在+2℃到+8℃。可以使用通过培养大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)菌株TOP10/pCMV‑VEGF165而生产的超螺旋DNA pCMV‑VEGF165。将所述药物组合物以足以提供必要的治疗效果的量给药到人类。所提供的质粒DNA pCMV‑VEGF165的药物组合物当在从+2℃到+8℃的温度下储存较长时间时并不会显著改变活性物质的性质。

Description

用于刺激血管生成的药物组合物

技术领域

本发明的目的属于生物技术，即质粒DNA的菌株生产者，一种能够在注射位点诱导血管生长(血管形成)的相关的药物组合物，及其在动脉粥样硬化患者下肢缺血的综合疗法以及在各种原因的创伤和溃疡的治疗中的应用，以及一种储存纯化的质粒DNA的方法。

背景技术

采用裸质粒DNA用于治疗疾病或针对病原体或肿瘤细胞的抗原而接种疫苗的基因治疗使得开发出了在不利条件下、尤其是在正温度或增加的温度下可被储存、运输并被专家使用的治疗性DNA的最终剂型。储存的质粒DNA的物理和化学稳定性受到赋形剂的组成、其在最终剂型和/或储存条件下的浓度和/或含量的显著限定(Schleef M.,Schmidt T.,无动物生产ccc-超螺旋质粒用于研究和临床应用(Animal-free production of ccc-supercoiled plasmids for research and clinical applications),J.Gene Med.,6Suppl 1:S45-53(2004))。影响储存的质粒DNA的药学活性形式的主要过程是DNA链的降解，其导致形成松弛的环状质粒DNA以及随后形成线性双链形式。已知当将冷冻的质粒DNA溶液储存在低于-80℃的温度下时，超螺旋DNA形式的降解几乎是难以察觉的(Walther W.,Stein U.,Voss C.,Schmidt T.,Schleef M.,Schlag P.M.,裸DNA长期储存的稳定性分析：对于非病毒体内基因转移的影响(Stability analysis for long-term storage ofnaked DNA:impact on nonviral in vivo gene transfer),Anal Biochem.,318(2):230-5(2003))。这种储存质粒DNA的方法无法在临床操作中广泛使用，因为在大多数情况下，医疗机构和药房并没有必需的冷藏设备。运输最终剂型并维持该产品的如此低温非常困难。选择合适的赋形剂组成和浓度可能使得质粒DNA溶液当储存在4℃下稳定12个月或当储存在-20℃下稳定超过三年(Przybylowski M.,Bartido S.,Borquez-Ojeda O.,SadelainM.,Riviere I.,用于人类I期临床试验和大型动物临床研究的临床级质粒DNA的生产(Production of clinical-grade plasmid DNA for human Phase I clinical trialsand large animal clinical studies),Vaccine,25(27):5013-24(2007))。

开发更稳定剂型的最常用方法是冻干法。通常，冻干剂型在4℃下稳定数年，并且在有些情况下，可以将产品储存在室温数月或乃至两年。冻干法还允许改变活性物质的浓度，其中可以将小瓶填充少量的浓缩溶液，可以将体积增加到对于产品溶解所必要的水平。可以使用低渗溶液的冻干，随后将冻干产物用盐水或正常渗透压的溶液溶解(AnchordoquyT.J.,Armstrong T.K.,Molina M.C.,低分子量葡聚糖稳定了在低渗透压下冻干期间的非病毒载体：通过再水化将悬浮液浓缩至降低的体积(Low molecular weight dextransstabilize nonviral vectors during lyophilization at low osmolalities:concentrating suspensions by rehydration to reduced volumes),J Pharm Sci.,94(6):1226-36(2005))。

通常，冻干质粒DNA溶液增加了产品进一步储存的稳定性，但冷冻和真空升华步骤可能严重损害质粒DNA的超螺旋结构(Anchordoquy T.J.,Armstrong T.K.,Molina M.C.,Allison S.D.,Zhang Y.,Patel M.M.,等,质粒DNA基治疗剂在冷冻和干燥期间的物理稳定(Physical stabilization of plasmid DNA-based therapeutics during freezing anddrying),在“Costantino HR,Pikal M.J.编辑，生物药品冻干(Lyophilisation ofbiopharmaceuticals),AAPS出版社”中；pp.605-41(2004))。特别是，从不含赋形剂的冷冻的水溶液进行DNA冻干引起配位水分子即DNA分子的水合包膜的消除，导致DNA分子的结构完整性丧失(Poxon S.W.,Hughes J.A.,冻干法对质粒DNA活性的影响(The effect oflyophilization on plasmid DNA activity),Pharm Dev Technol.,5(1):115-22(2005))。包括含氮碱基之间的互补键的降解以及堆积的部分降解的DNA分子构型受损的结果导致不希望的事件，即，质粒DNA的生物活性从原始活性降低高达25％(AnchordoquyT.J.,Armstrong T.K.,Molina M.C.,低分子量葡聚糖稳定了在低渗透压下冻干期间的非病毒载体：通过再水化将悬浮液浓缩至降低的体积(Low molecular weight dextransstabilize nonviral vectors during lyophilization at low osmolalities:concentrating suspensions by rehydration to reduced volumes),J Pharm Sci.,94(6):1226-36(2005))。已知通过升华除去的配位水分子的损失可通过向冻干溶液添加非挥发性亲水物质例如糖和多元醇而抵消(Maitani Y.,Aso Y.,Yamada A.,Yoshioka S,.糖类对于具有高转染效率的冻干脂质体/DNA复合物的储存稳定性的作用(Effect of sugarson storage stability of lyophilized liposome/DNA complexes with hightransfection efficiency),Int J Pharm.,356(l-2):69-75(2008))。在通过冻干法进行DNA稳定领域中大部分已知的方法使用含DNA的冷冻-干燥的脂质体(lyposome)(美国专利7,323,297)，并且因此，已知方法对于含有裸质粒DNA的溶液的适用性值得怀疑。在QuaakS.,Haanen J.,Beijnen J.,and Nuijen B.,裸质粒DNA制剂：不同的二糖对于冻干后稳定性的影响(Naked Plasmid DNA Formulation:Effect of Different Disaccharides onStability after Lyophilisation),AAPS PharmSciTech,Vol.11,No.1(2010年3月)的研究中，检测了多种多糖对于质粒DNA的冻干的影响，其明确了蔗糖与DNA按质量比20:1使用提供了对于储存来说最为稳定的剂型。该研究并没有考虑pH和盐水对于质粒DNA稳定性的影响，没有研究等渗的DNA溶液在浓度低于5mg/ml时的组成，也没有研究可能潜在地用于获得稳定冻干的大分子制备物的单糖。

发明内容

本发明的目的属于质粒DNA的菌株生产者和生理上可行的药物组合物，其长期提供质粒DNA的最终剂型的稳定性并可用于基因治疗。

质粒DNA的菌株生产者大肠埃希氏杆菌(Esherichia coli)为TOP10/pCMV-VEGF165菌株，其包含质粒pCMV-VEGF165，并且当培养在培养基中时产生质粒pCMV-VEGF165的超螺旋DNA，其中该菌株已经保藏在全俄罗斯农业微生物学研究所(All-RussiaResearch Institute for Agricultural Microbiology)的俄罗斯农业微生物保藏中心(Russian Collection of Agricultural Microorganisms)RCAM ARRIAM RAAS，保藏号为517。

药物组合物包括在人类细胞中提供基因表达的功能性遗传元件的控制下编码血管内皮生长因子(VEGF)的纯化的质粒DNA的制备物，以及用于提供等渗溶液的有效量的至少一种可药用赋形剂，其中所述至少一种可药用赋形剂是至少一种低温防护剂，所述低温防护剂为媒介物(vehicle)、pH稳定剂或其组合，其中所述纯化的质粒DNA的浓度为从0.1到10mg/ml，组合物的pH为7.0到9.0。所述组合物可用于在血管组织中诱导生长。

本发明的另一个目的是储存编码血管内皮生长因子(VEGF)的纯化的质粒DNA的方法，所述方法包括向纯化的质粒DNA加入至少一种低温防护剂的溶液，从而得到等渗溶液，随后将等渗溶液冻干，并将冻干物储存在从+2℃到+8℃的温度下，其中在冻干前纯化质粒DNA的浓度为0.1到10mg/ml，等渗溶液的pH为7.0到9.0。

所述药物组合物可用于制备用于肌肉内、静脉内或动脉内、皮下和真皮内给药的注射溶液。其可作为凝胶安放在可吸收性或不可吸收性载体上而用于皮肤给药。

所述药物组合物旨在用于临时(ex tempore)制备溶液或者不然则用于向受试者(患者、伤者、动物)肌肉内或任何其他内源性给药以诱导血管组织发育。

所述药物组合物的一个治疗性适应症为各种病因的缺血性状况，包括冠心病、下肢慢性闭塞性动脉疾病；需要修复性组织过程以进行矫正的情形，例如较大、持续性创伤(溃疡)，包括烧伤，局部损伤，包括骨折和骨缺陷。

本发明的另一目的是施用所述药物组合物的方法，所述方法包括向人类受试者施用有效量的所述药物组合物以提供取决于疾病分类形式(nosologic form)和医学适应症的治疗作用。

附图说明

将容易获得对实施方式及其很多相伴的优点更为充分的理解，因为通过参考下列详细描述并联合附图进行考虑时这将变得更容易理解，其中：

图1示出了质粒pCMV-VEGF165(长度为4859个碱基对)的表达图谱。使用了如下的缩写：“CMV早期启动子/增强子区域”-巨细胞病毒的早期基因的启动子/增强子区域；增强子区域；“CMV启动子”-巨细胞病毒的启动子区域；“TATA盒”-TATA-元件；“转录起始”-转录起始的点；“Kozak”-Kozak序列；“起始密码子”-VEGF165的开放阅读框的第一个密码子；“VEGF165”-人类血管内皮生长因子165的多肽开放阅读框(ORF)；“终止密码子”；“SV40pA项”-多腺苷酸化信号和病毒终止子SV40；“CMV正向引物”-标准引物CMV正向的退火区域；“M13正向20(forward20)引物”-标准引物M13正向20的退火区域；“M13pUC正向引物”-标准引物M13pUC正向的退火区域；“pBR322起点”-质粒复制pBR322的起点区域；“fl起点”-噬菌体复制fl的起点区域；“AmpR启动子”-基因bla的原核启动子；“NTPII(新霉素磷酸转移酶；“KanR”-编码提供对卡那霉素的细菌抗性的氨基糖苷-3'-磷酸转移酶的序列。箭头示出了基因转录的方向，在括号内提供了第一个和最后一个核苷酸片段的编号。限制性内切酶的识别位点以斜体提供，在括号内给出了切割位点中的核苷酸。

图2示出了患有慢性下肢缺血的74岁患者的血管造影照片。诊断：动脉粥样硬化，双侧股髂闭塞性疾病阶段IIb-III(休息时疼痛)。入院时的值：踝臂指数-0.48(右)，0.32(左)；经皮氧分压-61mm Hg。该患者接受过物理疗法作为标准综合治疗(右旋糖苷、disaggregant)的一部分。90天时的值：步行距离-130m；踝臂指数-0.5(右)，0.57(左)；经皮氧分压-78mm Hg。A、B-治疗前的血管造影照片：股骨上部和中间三分之一处(A)；胫骨(B)；C、D-给药Neovasculgen作为综合疗法的一部分后在90天时的血管造影照片：股骨上部和中间三分之一处(C)；胫骨(D)。用箭头示出了令人满意的填满的血管，包括形成中的侧支血管。

具体实施方式

本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献以其全部内容通过参考并入本文。此外，除非另行规定，否则材料、方法和实施例仅为示例性的，并且不计划是一种限制。编码血管内皮生长因子的质粒DNA可通过将人类cDNA VEGR的开放阅读框(ORF)与质粒载体连接、以及在大肠埃希氏杆菌细胞中复制质粒而获得，所述质粒载体提供所编码基因在人类细胞中的表达。载体的实例可以是质粒pcDNA、pCMV-Script和pBK-CMV(来源-超文本传送协议://addgene.org/vector-database/处的电子数据库)。载体的必要组件是真核细胞启动子。启动子的非限制性实例包括但不限于巨细胞病毒早期启动子/增强子(CMV)、人类翻译延伸因子1α(EF1a)启动子、人类泛素C(Ubc)启动子、猿猴空泡病毒(SV40)启动子、鼠源磷酸甘油酸激酶1(PGK)启动子和人类β-肌动蛋白启动子。用于表达VEGF的载体的更优选的组为适合于人类细胞的载体，其包含巨细胞病毒的立即早期启动子(下文中-CMV启动子)、抗菌素抗性基因、以及提供中等或高的质粒拷贝数的复制起点的区域，其可以为例如CoIEl、pUC、pBR322或pl5A的复制起点。载体的更优选组包括编码新霉素磷酸转移酶(NPT II)、提供对抗生素卡那霉素抗性的基因，该种基因使得可以从制造质粒的过程中排除使用氨苄西林组的抗生素。作为用于获得目标质粒DNA的载体，可以使用编码其他基因的ORF的质粒。可以通过使用限制性内切酶除去异源基因的ORF区域、分离受体DNA片段及随后将其与编码人类cDNA VEGF的ORF的供体DNA片段连接，从而从这些质粒DNA获得目标质粒DNA。受体质粒的一个实例可以是质粒pEGFP-N2。人类cDNA VEGF的开放阅读框的区域可以选自例如编码具有121、145、165或189个氨基酸长度的VEGF同种型的四个已知的剪接变体。用于获得质粒DNA的更优选的VEGF同种型是具有165个氨基酸长度的剪接变体。人类cDNAVEGF的ORF区域可能来源于人类组织的总cDNA或从叠加的(overlaying)寡核苷酸合成。

在人类cDNA VEGF的ORF的合成部分中，一部分或所有密码子可被简并密码子置换。cDNA的合成的片段如果提供了与天然片段可比的cDNA的生存期和目标基因翻译的效率，则可置换天然区域。用于获得目标质粒的VEGF的cDNA可以包含已知的多态性(分离的核苷酸的取代)，其不改变所编码多肽的氨基酸组成。含有这种多态性的VEGF的cDNA的使用并不改变所衍生的目标质粒的性质。编码VEGF并旨在用于医学用途的更优选的质粒为具有165个氨基酸的同种型的VEGF区域的ORF与质粒pBK-CMV的受体片段的连接产物。

在专利RU2297848中描述的质粒DNA pCMV-VEGF165长度为4859个碱基对，核苷酸序列为SEQ ID NO:1。质粒pCMV-VEGF165的结构在图1中给出。

具有4859个碱基对的质粒包括：

1.核苷酸1-361之间的区域，来自载体pBK-CMV的核苷酸968-4859之间的序列，其包括：

1.1.提供目标基因在哺乳动物细胞中的表达的元件：CMV早期启动子/增强子区域(核苷酸4626-355)，其包括增强子区域(核苷酸4684-231)和巨细胞病毒启动子(核苷酸274-355)；TATA盒-元件(核苷酸320-326)；转录起始点(349)；多腺苷酸化信号和病毒SV40终止子(核苷酸1306-1531)；以及

1.2.维持质粒在细菌细胞中存在的元件，启动噬菌体复制的区域fl(核苷酸1583-1995)；基因bla的原核启动子(核苷酸2058-2086)；编码提供对卡那霉素的细菌抗性的氨基糖苷-磷酸转移酶的序列(核苷酸2519-3313)；以及pBR322的质粒复制的区域(核苷酸3907-4526)；

2.核苷酸362-967之间的区域，其包括位于目标基因的起始密码子附近并提供目标基因的mRNA的翻译起始的Kozak序列(核苷酸380-391)，编码VEGF 165的基因的开放阅读框(核苷酸392-964)，以及终止密码子(核苷酸965-967)。

质粒含有限制性核酸内切酶NdeI(1)；BamHI(364)；EcoRI(373)；BsrGI(854)；XmaI(969)；Acc651(978)；BelI(1307)；NarI(2650)；ApaLI(4254)；和PciI(4568)的识别位点。

通过使用基因工程的已知方法、可商购的质粒和人类cDNA的克隆区域获得质粒(Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.分子克隆(Molecular Cloning).第二版.NewYork,NY:冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)；1989)。

质粒元件根据他们被放置的位置列出。功能性元件的相互位置对于有效的质粒活性很重要。

作为重组质粒，根据本发明的目的，可以使用含有在真核启动子控制下编码VEGF165的基因的各种质粒。

编码相同的调控元件的DNA片段可通过修饰DNA片段(SEQ ID NO:1)的核苷酸序列而得到，例如使用定位诱变进行修饰，其中在某些位点的一个或多个核苷酸可以被删除、插入或增加。如上所述，修饰的DNA片段可通过使用生成突变的已知处理方法得到。

为获得生产菌株，可以将质粒DNA pCMV-VEGF165插入(转化)进细菌细胞中，优选插入对通过该种质粒的转化敏感的埃希氏杆菌属物种(Escherichia sp.)中。被转化的细胞的选择不是关键的，因为转化的方法和方式均是已知的。尽管取决于获得的转化细胞的细胞类型和培养条件，细菌悬液中质粒pCMV-VEGF165的丰度和总含量可以不同，但如果受体细胞成功转化，则将会出现目标质粒。

质粒细胞转化表示使用已知方法将质粒导入细胞中。转化方法包括例如描述在Jac A.Nickoloff,微生物电穿孔方案(分子生物学方法)(Electroporation Protocolsfor Microorganisms(Methods in Molecular Biology))//胡马纳出版社(HumanaPress)；第1版(1995年8月15日)中的方法。

根据一个实施方式，“细菌细胞-质粒CMV-VEGF165的生产者”包括当将细菌细胞培养在培养基中时有能力维持、复制和积聚质粒CMV-VEGF165的细菌细胞。术语“细菌细胞-质粒pCMV-VEGF165的生产者”是指能够积聚质粒pCMV-VEGF165至不少于1mg/l(或1μg/10⁹个细胞)、更优选不少于10mg/l的细胞。质粒pCMV-VEGF165被积聚在细胞中，优选为超螺旋环状形式。

优选地，埃希氏杆菌属细菌可用于用在CMV启动子控制下编码基因VEGFR的质粒pCMV-VEGF165进行转化。启动子的类型并没有具体限制，可以是肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞，例如SV40或EF-1中有活性的启动子。

术语“埃希氏杆菌属细菌”是指所述细菌包括根据微生物学中已知分类的埃希氏杆菌属物种。可以提及大肠埃希氏杆菌(E.coli)作为属于埃希氏杆菌属物种的微生物。

可用于转化的埃希氏杆菌属物种并不受到限制，其中所述细菌的非限制性实例描述在由Neidhardt,F.C.等人的书中(大肠埃希氏杆菌和鼠伤寒沙门氏菌(Escherichiacoli and Salmonella typhimurium)，美国微生物学会(American Society forMicrobiology)，Washington D.C.，1208，表1)。

用于生产质粒pCMV-VEGF165的优选的受体菌株为衍生自非致病菌株K12的大肠埃希氏杆菌菌株，所述非致病菌株K12包含DNA修复系统的失活基因recA1以及核酸内切酶的失活基因endAl。这些菌株的实例为DH5α、DH10B、XL-1蓝、和TOP10。

用于生产质粒pCMV-VEGF165的受体菌株的实例包括但不限于大肠埃希氏杆菌TOP10。菌株大肠埃希氏杆菌TOP10通过如下所述的培养形态、生理和生化征象和遗传特征来表征。

菌株大肠埃希氏杆菌TOP10/pCMV-VEGF165已经在2009年2月24日保藏在全俄罗斯农业微生物学研究所的俄罗斯农业微生物保藏中心RCAM ARRIAM RAAS(ARRIAM，3Podbelsky chausse，St.Petersburg，Pushkin 8，196608，RU)，并且授予保藏号为517。

大肠埃希氏杆菌TOP10的培养形态学特性为：形成链的格兰氏阴性杆；在琼脂培养基中-形成透明、半透明、凸面、中等甚且边缘均匀(even-edged)的菌落。菌株储存在含1％葡萄糖和10％甘油的Luria-Bertrani培养基中。菌株培养在Luria-Bertani培养基中。

菌株大肠埃希氏杆菌TOP10的遗传特性是：菌株的基因型-Δ(araA-leu)7697,[araD139]B/r,Δ(codB-lacI)3,

80dlacZ58(M15),galK0,mcrA0,galU-,recAl,endAl,nupG-,rpsL-(strR),Δ(mcrC-mrr)715。

菌株大肠埃希氏杆菌TOP10用质粒pCMV-VEGF165进行的转化导致生成了生产菌株TOP10/pCMV-VEGF165，当将其培养在烧瓶中在添加有30μg/ml卡那霉素达的Luria-Bertrani培养基中振摇12-20小时时，其生物合成了5-20mg/l的量的质粒pCMV-VEGF165，其中不少于70％的质粒pCMV-VEGF165以超螺旋形式存在。

制备高纯化的质粒pCMV-VEGF165的方法包括将上述细菌培养在适于转化的原核细胞生长的培养基中；选择细胞生物质；重悬浮所述细胞；对细胞进行碱裂解；用酸溶液选择性地使质粒DNA复性；分离沉淀的团块(pellet)；通过超滤浓缩；在含高浓度盐的溶液(例如盐水)中通过凝胶过滤分离外源杂质和RNA；通过亲和(亲硫)色谱分离残余基因组DNA、内毒素和相关杂质；通过阴离子交换色谱和后续浓缩进行最终纯化；以及通过超滤/渗滤将纯化的质粒pCMV-VEGF165的溶液脱盐。

获得的质粒pCMV-VEGF165的制备物，其适合用于进一步生产药物组合物和最终剂型，可通过下列特性表征：

1)相关杂质的比例(质粒的松弛的环和线性形式)-至多5％(在下文中-活性物质的浓度的比例)。

2)大肠埃希氏杆菌的基因组DNA的比例-至多1％。

3)RNA的比例-至多1％。

4)总蛋白的比例-至多0.1％。

5)内毒素含量-至多50EU/1mg活性物质。

适合于进一步生产药物组合物和最终剂型的质粒DNA pCMV-VEGF165的溶液可通过使用分离和纯化DNA的其他已知方法制备，例如，使用在存在洗涤剂时热裂解细菌的方法、用氯化钙选择性沉淀RNA的方法、采用梯度洗脱分离超螺旋和松弛的质粒形式的方法，和描述在例如D.M.F.Prazeres，“质粒生物制药学：基础、应用和生产(PlasmidBiopharmaceuticals:Basics,Applications and Manufacturing)”，John Wiley & Sons，Inc.，(2011)ISBN：978-0-470-23292-7中的其他方法。

质粒DNA pCMV-VEGF165的最终剂型应该适合于肌肉注射并且应该在长期储存期间不显著改变活性物质的性质。质粒pCMV-VEGF165的可能的最终剂型包括但不限于冷冻溶液，液体溶液，冻干物、即冷冻-干燥的溶液，和无定形薄膜。

在一个实施方式中，药物组合物包括在人类细胞中提供基因表达的功能性遗传元件的控制下编码血管内皮生长因子(VEGF)的纯化的质粒DNA的制备物，以及用于提供等渗溶液的有效量的至少一种可药用赋形剂，其中所述至少一种可药用赋形剂是至少一种低温防护剂，所述低温防护剂为媒介物、pH稳定剂或它们的组合，其中所述纯化的质粒DNA的浓度为从0.1到10mg/ml，组合物的pH为7.0到9.0。

在另一个实施方式中，药物组合物包括纯化的质粒DNA和有效量的葡萄糖和磷酸钠，用于形成注射用的等渗溶液，其中组合物的pH为7.8。

而在一个不同的实施方式中，组合物的pH为7.2到8.5，优选7.4到8.2。

在一个实施方式中，所述组合物包括纯化的质粒DNA、200到400mM的葡萄糖和3到30nM的磷酸钠。

在一个不同的实施方式中，所述药物组合物包括0.8到1.2mg/ml的纯化的质粒DNApCMV-VEGF165，280到320mM的右旋糖；以及8到12mM的磷酸钠，其中组合物的pH为7.4到8.2。

最终剂型的更优选的变型是液体溶液或冻干物，因为它们可以储存在正的温度下，即储存在标准药品冰箱中，并且不需要大量时间以制备注射剂。

最终剂型的一种更为优选的变型是冻干物，因为缺乏水潜在地阻滞了导致超螺旋质粒DNA向松弛的环状形式转化的DNA链降解的化学反应。而且，当储存质粒DNA的液体剂型时，可能发生溶液与橡胶密封材料的长期接触，其中橡胶密封物可能潜在地包含可提取的过渡金属离子，其能够通过催化形成羟基自由基加速DNA链的降解。

冻干物、即无定形或微晶多孔材料的制备要求在待冻干的溶液中含有赋形剂，其起到低温防护剂、pH稳定剂、螯合剂、抗氧化剂和/或媒介物的作用。赋形剂的最小可能的组可以包括至少一种低温防护剂，所述低温防护剂具有媒介物、pH稳定剂或它们的组合的性质。作为低温防护剂和媒介物的赋形剂可以是至少一种选自如下的组分：单糖和二糖，多元醇，和聚合物，例如选自蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖、棉子糖、聚乙烯吡咯烷酮和其组合。pH稳定剂可以是至少一种选自如下的组分：柠檬酸钠、磷酸钠、Tris-HCl、Tris-乙酸盐、甘氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸、和其他氨基酸。

当研究质粒DNA pCMV-VEGF165的各种药物组合物时，发明人惊讶地发现，在从+2℃到+8℃的温度的储存条件下最大的稳定性由例如在pH7.8下的葡萄糖和磷酸钠的赋形剂的组合提供。

当溶液的体积在冻干前后相同时，在冻干过程以及进一步的储存中能够保持质粒DNA pCMV-VEGF165的性质的溶液最佳的组成如下：

1.质粒DNA的浓度从0.1到10mg/ml，优选从0.5到4mg/ml，更优选从0.8到1.2mg/ml。

2.葡萄糖(右旋糖)的浓度为从200到400mM，优选从250到350mM，更优选从280mM到320mM。

3.磷酸钠(磷酸三钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠的混合物)的浓度为从3到30mM，优选从5到20mM，更优选从8到12mM。

4.溶液的pH为从7.0到9.0，优选从7.2到8.5，更优选从7.4到8.2。

用于制备生产菌株和药物组合物的质粒的结构在图1中给出。

本发明的另一个目的是储存编码血管内皮生长因子(VEGF)的纯化的质粒DNA的方法，包含向纯化的质粒DNA加入至少一种低温防护剂的溶液，从而得到等渗溶液，随后将等渗溶液冻干，并将冻干物储存在从+2℃到+8℃的温度下，其中在冻干前纯化质粒DNA的浓度为0.1到10mg/ml，等渗溶液的pH为7.0到9.0。

在一个实施方式中，至少一种低温防护剂为葡萄糖，等渗溶液中葡萄糖与纯化的质粒DNA的质量比为1:50。

在一个不同的实施方式中，至少一种低温防护剂为葡萄糖，在储存3个月的冻干物中松弛的质粒DNA的比例为至多10％。

在又另一个实施方式中，至少一种低温防护剂为磷酸钠，其中磷酸钠的含量为从5到20mM，等渗溶液的pH为从7.8到9.0。

本发明的另一目的是施用所述药物组合物的方法，所述方法包括向人类受试者施用有效量的所述药物组合物以提供取决于疾病分类形式和医学适应症的治疗作用。

已经总体上描述了本发明的目的，可通过参考某些具体实施例而得到进一步的理解，除非另有规定，否则所述具体实施例在本文中仅提供为示例目的，并且不意欲进行限制。对本发明：制备质粒DNA pCMV-VEGF165的可能的实现方式给出实施例是恰当的。

实施例

实施例1.纯化的质粒DNA pCMV-VEGF165的溶液的制备。

接种物的制备

从工作细胞库(working bank)重新获得来自工作细胞库的生产菌株TOP10/pCMV-VEGF165的保存的接种物的小瓶，将接种物培养在50ml的液体培养基中。

pDNA的生物合成

准备10升烧瓶的发酵罐，将含培养基的烧瓶进行灭菌，无菌固定输送管线和取出管线，校准连接参数的测量套件(set)，将发酵罐接种并培养8小时，直至以1000转/分钟的搅拌器的固定速率实现溶解氧的恒定浓度(静置培养生长阶段)，之后停止充氧并冷却烧瓶。将培养悬浮液的样品转移用于分析培养密度。

生物质的生产

在具有固定角转子的间歇落地式高速离心机中，将生物质，即细胞团块与培养液分离。将培养液的上清转移到高压灭菌器中进行灭菌和中和。将得到的生物质保留在冰箱中低温下离心袋中。将生物质样品转移用于分析目标物质的含量和完整性。

悬浮生物质、裂解和中和

将解冻的生物质转入裂解容器中，并用悬臂式搅拌器悬浮在悬浮溶液中。采用氢氧化钠和十二烷基硫酸钠的溶液通过悬臂式搅拌器混合5分钟而进行细胞裂解。在混合时，加入乙酸钾的溶液进行中和，同时形成细胞碎片、结合组蛋白的基因组DNA和蛋白质的沉淀。由于十二烷基硫酸钠转变为不溶解的钾盐和胶粒凝结物而形成了沉淀。同时，溶液的中和导致质粒DNA复性。

澄清赖氨酸的制备

将得到的悬浮液转入离心袋中，在具有固定角转子的间歇落地式高速离心机中分离沉淀物。将培养液的上清转移到高压灭菌器中进行灭菌和中和。将质粒DNA的澄清溶液收集在超滤套件的进料容器中，所述溶液还包括相关化合物-松弛和线性形式的质粒DNA、以及外源杂质例如残余的基因组DNA、RNA、蛋白质和LAL-内毒素。

超滤

将质粒DNA的溶液用截留阈值为500kDa的中空纤维筒在切向流动下通过超滤浓缩。作为超滤的一部分，同样出现了大小不到3kDa的分子的附加的9倍去除，例如，蛋白质、运输RNA、LAL-内毒素和基因组DNA的短片段的去除。溶液被浓缩高至9倍。将浓缩的质粒溶液收集在玻璃瓶中，将超滤单元用凝胶过滤用溶液洗涤并与质粒DNA的浓缩溶液合并。

凝胶过滤

在大孔糊精吸附剂Sparse 6快速流动仪“GE Life sciences”上进行通过凝胶过滤的深度色谱纯化的第一过程。使用了含2.1M硫酸铵和10mM EDTA-Na的高浓度盐的溶液，该种溶液使得可以根据分子的大小对它们进行分离，并且由于非特异性的疏水相互作用而通过吸附剂截留RNA和ALL-内毒素的杂质。将含杂质的溶液和洗涤溶液收集进容器中并在适当时候进行处理。将含有2.1M硫酸铵的半纯化的质粒DNA的溶液收集进玻璃容器中。

亲和色谱

在吸附剂PlasmidSelect Xtra“GE Lifesciences”上进行通过亲硫(假亲和)色谱的深度色谱纯化的第二过程。为了洗涤柱子，使用含2.0M硫酸铵的溶液，并将硫酸铵浓度为2.1M的半纯化的溶液施加到柱子。当溶液施加后，所有DNA形式和部分残余DNA被吸附到吸附剂上，其中残余蛋白和内毒素并不被吸附。

在施加后，用浓度为2.0M的硫酸铵溶液洗涤柱子，其中残余DNA、基因组DNA和质粒DNA的相关组成被洗脱。用浓度为1.7M的硫酸铵溶液洗脱活性物质HSCI-01。使用浓度为0.1M的氢氧化钠溶液对柱子进行再生和纯化。将杂质的溶液和洗涤溶液收集进容器中并在适当时候进行处理。将含有1.7M的硫酸铵的半纯化质粒DNA的溶液收集进玻璃容器中，并用注射用水以1:2的比例进行稀释。

阴离子交换色谱

在吸附剂SOURCE 30Q“GE Lifesciences”上进行通过阴离子交换色谱的深度色谱纯化的第三过程。活性物质被吸附到柱子上，并用含0.4M氯化钠的溶液漂洗。当柱子被洗过后，活性物质的阳离子从铵离子被置换为钠离子，并且残余内毒素被洗脱。将活性物质用1M氯化钠的溶液进行洗脱。将含杂质的溶液和洗涤溶液收集进容器中并在适当时候进行处理。将纯化的质粒DNA的溶液收集进玻璃容器中。

超滤和渗滤

在具有截留阈值为300kDa的中空纤维组件的套件中通过超滤将纯化的质粒DNA的溶液进行浓缩。当达到0.25％的浓度时，将套件切换到渗滤模式，用注射用水彻底改变缓冲液。将滤液收集进容器中并在适当时候进行处理。将滤液倒入玻璃容器中，在低于70℃的温度下测量超螺旋质粒DNA的浓度。

实施例2.生产冻干物变体进行稳定性研究

为了得到药物组合物的变体，使用了浓度约为2.5mg/ml的质粒DNA pCMV-VEGF165的无盐溶液，该溶液含有残余含量的Tris-HCl，pH＝7.5，NaCl至多1mM。作为低温防护剂，加入了葡萄糖、蔗糖和乳糖，其满足不低于欧洲药典要求的要求。作为pH稳定剂，使用了pH从7.2到9.0的磷酸钠溶液。使用了终浓度为300mM的糖类和终浓度为10mM的磷酸钠。这些浓度的赋形剂提供了用于内源性给药的溶液的等渗性。在得到的药物组合物中最终DNA浓度为1mg/ml。

在5-ml玻璃瓶中进行冻干，其配备有半开放的冻干橡胶密封物并装有1.2ml的测试溶液。所有试样的冻干干燥方案在下面的表1中示出。

表1.冻干干燥方案

阶段	持续时间，分钟	温度，℃
			1)溶液冷冻：
a)	30	-50
			b)	300	-50
2)冻干
			a)	60	-30
b)	930	-30
			c)	60	-10
d)	480	-10
			e)	60	20
f)	360	20
			3)最终干燥
a)	60	40
			b)	600	40

工作腔室在干燥过程中的压力为60微巴，冷冻阶段完成时的产品温度应该不大于零下45℃，即低于葡萄糖的玻璃化转变温度(Tg)2℃，并且比所有其他糖类的Tg低10℃以上。在冻干后的产品温度不应低于15℃。产品的温度用冷冻进小瓶中的热电偶测量，所述小瓶具有含除DNA外的所有赋形剂的产品模拟物(simulator)。在最终干燥后，采用电池压缩(battery compression)在无菌干燥空气的气氛下对小瓶进行增压。卸下的小瓶用铝帽封闭。

为了比较当储存在升高的温度下时产品的稳定性，使用了pH为7.8的磷酸钠溶液，该溶液通过将磷酸氢二钠和磷酸二氢钠溶液以91.5∶8.5的摩尔比进行混合得到。将冻干的封闭小瓶储存在+37℃的干燥恒温箱中，其中每月取出一组小瓶，将冻干物溶解，通过分析型离子交换色谱测量松弛的质粒DNA的比例。测量结果在表2中给出。

表2.在升高的温度下储存的松弛的质粒DNA的比例

结果表明，用作低温防护剂的葡萄糖在糖类与DNA的质量比为1:50、pH＝7.8下提供了超螺旋质粒DNA最小的降解速率。

对于含葡萄糖的药物组合物，对超螺旋质粒DNA的稳定性和溶液的pH以及磷酸钠(pH 7.8)的浓度之间的关系进行了研究。结果发现，对于从5到20mM的各种不同浓度的磷酸钠，超螺旋质粒DNA的稳定性并没有显著改变(数据未示出)。对于溶液的各种pH，结果显示(参见表3)对于从7.8到9.0的pH范围来说稳定性没有显著改变，但超螺旋质粒DNA的稳定性在pH 7.2下降低。

表3.在升高的温度和各种pH水平下储存的松弛的质粒DNA的比例

pH	0个月	1个月	2个月	3个月
					7.2	2.2％	4.09％	7.63％	15.17％
7.8	2.2％	2.80％	5.30％	10.00％
					8.4	2.3％	2.76％	3.34％	10.69％
9	2.1％	2.51％	2.97％	8.39％

因此，根据加速储存数据，药物组合物可以选择组合物的pH范围为从7.8到9.0，磷酸钠的浓度为从5到20mM。由于DNA浓度为1mg/ml的DNA中离子化磷酸基团的浓度约为3mM，并且缓冲盐的浓度应该显著超过活性物质中离子化基团的总浓度，因此磷酸钠的最佳浓度选择为10mM。溶液的最佳pH为7.8，因为这样的值最接近于生理pH(7.2-7.4)。然而，应该考虑到pH应该尽可能接近7.2，pH水平越高，质粒稳定性越高(直到9.0)。或许，质粒DNA在储存温度从+2到+8℃和pH 7.0-9.0下保存了其稳定性，其足以用于基因治疗。

实施例3.纯化的质粒DNA的溶液的制剂和最终剂型的生产

如实施例1中示出的质粒DNA在阴离子交换色谱阶段结束之前获得。下列阶段按照如下所述进行。

超滤和渗滤

在具有中空纤维组件的套件中通过超滤将纯化的质粒DNA的溶液进行浓缩，所述中空纤维组件具有的膜的截留阈值为300kDa。当达到0.15％的浓度时，将套件切换到渗滤模式，将缓冲液彻底变为在注射用水中浓度为10mM、pH 7.8、含4.4％(300mM)葡萄糖的磷酸钠溶液。将滤液收集进容器中并在适当时候进行处理。将浓缩的配制的溶液倒入玻璃容器中，测量超螺旋质粒DNA的浓度，将溶液调整到0.1％的最终DNA浓度。

无菌过滤

将最终物质的溶液转移到A类清洁区中，在去热源的(depyrogenized)无菌250-ml容器中用圆盘膜滤器进行无菌过滤，得到符合GOST 19808-86的输注液。选择待转到质量控制部门的样品，将容器用橡胶密封物进行封闭，然后用铝帽封闭，并在仓库的隔离区进行冷冻。

将质粒DNA溶液的配制溶液解冻，转移到A类清洁区。打开容器，用圆盘膜滤器进行无菌过滤到去热源的无菌250-ml容器中得到根据GOST 19808-86的输注液。在无菌条件下将溶液倒入根据GOST 19808-86的无菌5-ml胰岛素瓶中。根据TU 38.006.269-90，将小瓶用橡胶密封物封闭，并转去冷冻干燥。

将小瓶放在冻干机的支架上，在-45℃下冷冻并进行3-阶段真空干燥。根据GOST P51314-99，放置密封物、取出小瓶并用铝帽进行封闭。

实施例4.pCMV-VEGF165的最终剂型的稳定性的验证

将含有质粒DNA pCMV-VEGF165的无菌冻干物的小瓶储存在+4℃的药物冰箱中2.5年，通过每6个月进行一次离子交换色谱进行相关杂质比例的分析。在表4中给出了分析结果。

表4.维持在+4℃的温度下的最终剂型的稳定性

因此，质粒DNA pCMV-VEGF165的剂型在至少两年内稳定。

实施例5.药物组合物的效率的验证

用含有质粒构建体以及赋形剂的药物组合物进行治疗的功效在患有慢性下肢缺血的患者中得到了证实，即用含赋形剂的药物组合物治疗的结果出人意料地优于用仅包括质粒(单一疗法)的组合物的治疗。在涉及75位患者的研究中测定了较高的治疗功效，所述患者均患有根据A.V.Pokrovsky-Fontaine的2a-3级慢性下肢缺血(A.V.Pokrovsky,2004；外周动脉疾病管理的协会间共识(Inter-Society Consensus for the Management ofPeripheral Arterial Disease)(TASC II).Eur.J.Vase.Endovasc.Surg.,胫骨后动脉中氧压力、踝臂指数和线性血流速度)。

步行距离.治疗3个月后，临床组的患者的步行距离为236.49±193.49m(平均距离)，6个月为284.73±242.02m(平均距离)(所有获得的距离为从20到1500m)。患者能够无痛苦行走的平均距离的增加在研究组中为149.47m，其中中位数增加了127.5m，值之间的差异在统计学上是显著的(p＝0.006)。

在对照组，患者能够无痛苦行走的平均距离下降了1.42m，中位数增加了35.00m，值之间的差异在统计学上并不显著(p＝0.6)。组间值动态的差异(平均值+150.89，中位数+92.5)在统计学上是显著的(p＝0.001)。

氧的经皮压力.在临床组中，出现了TPO的平均值从第一次访问时的76.69±9.96mm Hg到第四次访问时的85.42±10.87mm Hg的稳定增加的趋势。对照组具有相反的动态，即在相同的观察期内出现了平均值从76.89±55.76mm Hg到75.37±61.57mm Hg的降低。临床组中观测到的值之间的差异是显著的，而对照组中的差异是不显著的(p＝0.096)，即作为标准治疗的一部分，患者的值几乎没有变化。所记录到的增加的平均TPO值在组间的差异(+10.25)以及中位数的差异(+8.00)在统计学上是显著的(p＝0.0001)。组中值的相对增加为：临床组+12.40±17.69％，对照组2.12±4.38％(p＝0.001)。

踝-臂指数.目标下肢的ABI在临床组的患者中有增加的倾向，在对照组的患者中有降低的倾向。因此，在临床组中，基线值0.513±0.182在治疗期间增加了0.057，在6个月时为0.57。临床组中在第四次和第一次访问之间观察到的值的差异是显著性的(p＝0.001)。在对照组中，该指数在6个月内降低了0.02单位，即从0.458±0.182降到了0.438±0.187。然而，该变化并不是显著性的(p＝0.5)。

组之间增加的平均ABI值之间的差异为+0.077(中位数+0.065)，记录到的差异为显著性的。

线性血流速度(根据胫骨后动脉的超声多普勒超生波扫描).在临床组的患者中，该值在研究期间有增加的倾向：在6个月内，平均值增加了8.24厘米/秒，中位数增加了5.0厘米/秒，即从14.95±10.19厘米/秒直到23.19±12.71厘米/秒。

在对照组的患者中，所述值增加了1.30厘米/秒(从开始研究时的17.60±6.60厘米/秒，直到在6个月时的18.90±6.77厘米/秒)，而中位数并没有变化，即处在20.0厘米/秒的水平。在研究期间，组间的差异在统计学上是显著的(p＝0.005)。

临床组中的平均值与由对照组显示的值相比增加到较大的程度(+6.94厘米/秒)，中位数也是(+5.00厘米/秒)；所述值中的差异在统计学上是显著性的(p＝0.005)。

因此，基于“无痛苦步行距离”这一效率标准，患者中该值从第一次访问时的135.3m显著增加到6个月时的248.7m(增加了110.5％)，显著不同于在对照组中的趋势(p＝0.001)。

其他效率标准：

-ABI-增加了11.11％(p＝0.001)；

-TPO-增加了11.38％(p＝0.001)；

-LBFR-增加了55.12％(p＝0.001)。

在21012年8月31日提交的RU专利申请RU2012137126通过引用并入本文。

根据上述教导可以对本发明进行各种改良和变化。因此应该理解，在权利要求书的范围内，本发明可以按照除本文所具体描述以外的其它方式进行操作。

Claims (12)

1.一种用于生产旨在诱导组织中的血管发育的药物组合物的方法，所述方法包括：

使用SEQ ID NO:1所示的pCMV-VEGF165质粒转化大肠埃希氏杆菌(Esherichia coli)TOP10菌株，

培养所述菌株以积聚pCMV-VEGF165质粒，

然后提取超螺旋形式的pCMV-VEGF165质粒，

向纯化的pCMV-VEGF165质粒添加至少一种低温防护剂的溶液，从而得到等渗溶液，

随后将所述等渗溶液冻干，以及

将冻干物储存在从+2℃到+8℃的温度下，

其中在冻干之前所述纯化的pCMV-VEGF165质粒的浓度为从0.1mg/ml到10mg/ml，所述至少一种低温防护剂包含葡萄糖和磷酸钠，在所述等渗溶液中葡萄糖与所述纯化的pCMV-VEGF165质粒的质量比为1:50，磷酸钠的含量为从5mM到20mM，并且所述等渗溶液的pH为从7.8到9.0。

2.根据权利要求1所述的方法，其中磷酸钠的含量为10mM。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述等渗溶液的pH为7.8。

4.根据权利要求1所述的方法，其中在冻干之前所述纯化的pCMV-VEGF165质粒的浓度为从0.5mg/ml到4mg/ml。

5.根据权利要求1所述的方法，其中在冻干之前所述纯化的pCMV-VEGF165质粒的浓度为从0.8mg/ml到1.2mg/ml。

6.根据权利要求1所述的方法，其中在储存了3个月的冻干物中松弛的pCMV-VEGF165质粒的比例为至多10％。

7.一种旨在诱导组织中的血管发育的药物组合物，所述组合物包括：

SEQ ID NO:1所示的纯化的pCMV-VEGF165质粒的制备物，其中所述质粒能够在人类细胞中表达VEGF165基因；以及

用于提供注射用的等渗溶液的有效量的至少一种可药用赋形剂，其中所述至少一种可药用赋形剂是至少一种低温防护剂，所述低温防护剂为媒介物、pH稳定剂或其组合，

其中所述纯化的pCMV-VEGF165质粒的浓度为从0.1mg/ml到10mg/ml，所述至少一种低温防护剂包含葡萄糖和磷酸钠，葡萄糖与所述纯化的pCMV-VEGF165质粒的质量比为1:50，磷酸钠的含量为从5mM到20mM，并且所述组合物的pH为7.8到9.0。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中磷酸钠的含量为10mM。

9.根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述组合物的pH为7.8。

10.根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述纯化的pCMV-VEGF165质粒的浓度为从0.5mg/ml到4mg/ml。

11.根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述纯化的pCMV-VEGF165质粒的浓度为从0.8mg/ml到1.2mg/ml。

12.根据权利要求7所述的药物组合物，其中不低于70％的所述纯化的pCMV-VEGF165质粒以超螺旋形式存在。

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