CN1651464A

CN1651464A - 链抗生物素/粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白

Info

Publication number: CN1651464A
Application number: CN 200410052536
Authority: CN
Inventors: 高基民
Original assignee: Individual
Current assignee: Wenzhou Medical College
Priority date: 2004-12-07
Filing date: 2004-12-07
Publication date: 2005-08-10
Anticipated expiration: 2024-12-07
Also published as: CN1322011C

Abstract

本发明为一种基因工程技术生产的链抗生物素/粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白(SA/GM－CSF融合蛋白)。通过对SA和GM－CSF的cDNA进行改造，如引入甘氨酸/丝氨酸丰富的17肽作为两者间链接接头等措施，获得了SA和GM－CSF融合基因，构建了SA/GM－CSF表达质粒，将其转化大肠杆菌并得到了原核高效表达；SA/GM－CSF融合蛋白经纯化复性后具有SA和GM－CSF的双重活性，即既对生物素有高亲合性，又具有相应的GM－CSF的生物活性。因此，这些SA/GM－CSF融合蛋白可用于已生物素化的细胞、组织或各类抗原的修饰以增强其免疫原性并调节机体的免疫反应，从而预防和治疗肿瘤和传染病。

Description

链抗生物素/粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白

一、技术领域

本发明属基因工程领域，为两种链抗生物素/粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白，即GM-CSF-L-SA和SA-L-GM-CSF，其中L为接头，是甘氨酸/丝氨酸丰富的17肽(EFSSGGSGGGGSGGGGS)。

二、背景技术

GM-CSF有如下功能：维持和促进造血干细胞以及某些成熟的血细胞(如中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞和噬酸性粒细胞)的生长；激活中性粒细胞、巨噬细胞和噬酸性粒细胞对病原体及肿瘤的杀伤活性，增强树突状细胞的抗原提呈功能，从而提高机体对特异性肿瘤抗原和某些胞内病原体(如病毒、寄生虫、分枝杆菌)抗原的识别能力；并可作为中性粒细胞和巨噬细胞的趋化因子。因此，GM-CSF能使机体有效地清除肿瘤细胞、病毒、细菌或真菌感染的细胞，在疾病的预防和治疗中扮演了重要的角色。

链抗生物素(SA)是由抗生物素链霉菌产生的非糖基化同源四聚体蛋白，故一个链抗生物素蛋白可结合四个生物素。它能与生物素紧密非共价结合(Kd＝10-15M)，其结合力是抗原—抗体间作用力的一千至一百万倍。由于链抗生物素可与生物素快速且几乎不可逆的强力结合，以及生物素较容易参入各种生物分子(如蛋白质，核酸和脂多糖)中，即生物素化，故链抗生物素—生物素间的强力作用早已用于生物医学的许多领域(Sano，T.and Cantor，C.R.(2000)Streptavidin-containing chimericproteins：design and production.Methods Enzymol.326，305-311.)。

三、发明内容

SA/GM-CSF融合蛋白的发明过程如下：为了获得含有SA/GM-CSF融合基因的质粒，我们对GM-CSF或SA cDNA进行了克隆和末端改造，如除去其终止密码子和引入甘氨酸/丝氨酸丰富的17肽作为接头，构建了GMCSF-L-SA-pET24和SA-L-GM-CSF-pET24重组质粒；将这两个重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得相应的工程菌大肠杆菌GM-CSF-L-SA/pET24和SA-L-GM-CSF/pET24，并对GMCSF-L-SA和SA-L-GM-CSF融合基因实现了表达，表达效率为20-30％；融合蛋白在细菌内主要以包涵体形式存在；分离纯化蛋白并复性处理后，获得了双功能融合蛋白。

本发明SA-L-GM-CSF和GM-CSF-L-SA双功能融合蛋白，其中SA能强力结合生物素，而GM-CSF的生物学活性为ED₅₀＝0.1～0.5ng/ml。

这些SA/GM-CSF双功能融合蛋白可通过SA与生物素的强力结合将GM-CSF锚定在生物素化的肿瘤细胞表面，且能在γ射线灭活肿瘤细胞表面稳定存在，并仍保持GM-CSF的活性。

动物试验表明，经SA/GM-CSF双功能融合蛋白修饰的肿瘤疫苗具有预防和治疗肿瘤的效用。

四、附图说明

图1是质粒GM-CSF-L-SA-pET24和SA-L-GM-CSF-pET24的示意图。

图2是GM-CSF-L-SA-6His和6His-SA-L-GM-CSF融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达。

图3是GM-CSF-L-SA-6His和6His-SA-L-GM-CSF融合蛋白锚定在生物素化的B16.F10肿瘤细胞表面。

图4是锚定在生物素化且γ射线灭活肿瘤细胞表面的GM-CSF-L-SA-6His融合蛋白的稳定性测定。

图5是锚定在生物素化的肿瘤细胞表面GM-CSF-L-SA-6His融合蛋白的GM-CSF生物活性的测定。

图6是GM-CSF-L-SA-6His修饰的B6.F10肿瘤细胞致瘤性研究。

图7是GM-CSF-L-SA-6His修饰的B6.F10肿瘤细胞疫苗的预防肿瘤性研究。

图8是GM-CSF-L-SA-6His修饰的B6.F10细胞疫苗的治疗肿瘤性研究。

五、具体实施方式

通过下述实施例对本发明的技术特征作详细描述。

材料与方法：

一、细胞株、菌株与质粒：XS106细胞株(GM-CSF依赖细胞)和B16.F10(鼠黑色素瘤细胞株)；菌株Streptomyces avidinii(抗生物素链霉菌，ATCC)，DH5a和BL21(DE3)；原核表达质粒pET24a(Kana^r，Novagen)。

二、主要生化试剂及材料：DNeasy组织试剂盒和质粒DNA的制备试剂盒(Qiagen)，寡核苷酸的合成(Sigma)，Trizol，SuperScript II逆转录酶，Platinum Pfx DNA聚合酶和T4 DNA连接酶(Invitrogen)；GM-CSF标准品(R & D Systems)，琼脂糖和SDS-PAGE(Biorad)；2-Iminobiotin(Sigma)和Ni-NTA(Qiagen)填料；Sulfo-NHS-LC-Biotin(Pierce)和抗GM-CSF单克隆抗体(BD Biosciences Pharmingen)。

三、DNA片段的连接、转化及转化子筛选，限制性内切酶分析，SDS-聚丙烯酰胺凝胶点泳等常规方法均参照文献(Sambrook J，et al.Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York，2nd edition，1989)或厂家提供的产品说明书；DNA序列分析在UTSW at Dallas的DNA测序服务中心完成。

实施例1.成熟链抗生物素(SA)cDNA的制备。

用DNeasy组织试剂盒从抗生物素链霉菌抽提出细菌的基因组DNA，然后用其作为模板，通过Platinum pfx DNA聚合酶进行PCR制备成熟链抗生物素cDNA。

实施例2.成熟GM-CSF cDNA的制备。

用Trizol抽提起PHA-活化的外周血单个核细胞的总RNA，并以其作为模板，进行RT-PCR制备成熟GM-CSF cDNA。

实施例3.GM-CSF-L-SA-pET24和SA-L-GM-CSF-pET24重组质粒的构建。

用PCR制备GM-CSF-L-SA-6His和6His-SA-L-GM-CSF-pET24融合基因，并进行核苷酸序列测定；然后将其分别克隆于pET24a，获得GM-CSF-L-SA-pET24和SA-L-GM-CSF-pET24重组质粒(图1)，并对其进行限制性内切酶分析鉴定。

实施例4.GM-CSF-L-SA-6His和6His-SA-L-GM-CSF融合基因在大肠杆菌中的高效表达。

将GM-CSF-L-SA-pET24和SA-L-GM-CSF-pET24重组质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得相应的工程菌GM-CSF-L-SA/pET24和SA-L-GM-CSF/pET24；并对GM-CSF-L-SA-pET24和6His-SA-L-GM-CSF融合基因实现了表达，表达效率为20-30％，表达产物主要以包涵体的形式存在(图2)。

实施例5.GM-CSF-L-SA-6His6和His-SA-L-GM-CSF融合蛋白的制备。

1.制备包涵体。5克菌体悬于100ml 1xPBS中，冰浴中超声(电流270mA)，30秒×10次(每次间隔30秒)；裂解液于4℃离心10分钟(8000g)，将沉淀悬浮于100ml 1xPBS(内含4mol/L尿素，0.5％Triton X-100，20mmol/L EDTA)中进行漂洗，随后离心(1000g×10分钟)收集沉淀；漂洗两次后，溶于100mmol/L磷酸钠缓冲液，8mol/L尿素(pH8.0)中，15000g×15分钟得上清。

2.Ni-NTA柱层析：将制备的包涵体溶解液上样于Ni-NTA柱(2.6×5cm)，用平衡液(100mmol/L磷酸钠缓冲液，8mol/L尿素，pH8.0)进行冲洗至样品A₂₈₀恢复至基线；然后用洗脱液(100mmol/L磷酸钠缓冲液，8mol/L尿素，pH4.5)进行洗脱，收集融合蛋白质峰(SDS-PAGE鉴定)。

3.透析复性：将Ni-NTA柱层析纯化获得的GM-CSF-L-SA-6His和6His-SA-L-GM-CSF融合蛋白调至OD₂₈₀＝0.2，在大于20倍体积的透析液(100mmol/L NaHCO3，1.0mol/L尿素，1mmol/L还原型谷胱苷肽，0.2mmol/L氧化型谷胱苷肽，pH9.0)中4℃透析复性12小时；然后在50mmol/L NaHCO3，500mmol/L NaCl，pH11中继续透析6小时；离心除去不溶物，收集上清。

4.2-Iminobiotin亲和柱层析：用平衡液(50mmol/L NaHCO3，500mmol/L NaCl，pH11)洗脱5个柱体积后(柱体积0.5×2cm)，将收集的已复性融合蛋白质液上亲和层析柱，并用平衡液洗脱至样品A₂₈₀恢复至基线；然后，用50mmol/L NaAc，pH4.0洗脱，分管收集各洗脱峰，并用10x平衡液(500mmol/LNaHCO3，5mol/L NaCl，pH11)将收集的融合蛋白质液调至pH8.0，并过滤除菌分装，储存于-20℃备用。

实施例6.GM-CSF-L-SA-6His和6His-SA-L-GM-CSF融合蛋白中GM-CSF活性的测定。

利用XS106细胞株³H掺入法对GM-CSF的活性进行测定，测得的GM-CSF活性为ED₅₀＝0.1～0.5ng/ml。

实施例7.将GM-CSF-L-SA-6His和6His-SA-L-GM-CSF融合蛋白锚定在生物素化的B16.F10表面。

将10⁷B16.F10细胞悬浮在1ml 1xPBS中，加入0.5mg Sulfo-NHS-LC-Biotin并混匀后，室温下作用30分钟；用1xPBS洗涤细胞3次后，每10⁶B16.F10细胞加入200ng GM-CSF-L-SA-6His或6His-SA-L-GM-CSF融合蛋白，冰上作用30分钟；1xPBS洗涤细胞1次后，用抗GM-CSF单克隆抗体及荧光标记的二抗经流式细胞仪对锚定在生物素化的B16.F10表面上的GM-CSF-L-SA-6His或6His-SA-L-GM-CSF融合蛋白进行检测(图3)，并对已锚定的GM-CSF-L-SA-6His融合蛋白的稳定性进行分析(图4)。

实施例7.对锚定在生物素化的B16.F10表面上的GM-CSF-L-SA-6His融合蛋白进行GM-CSF生物活性的测定。

首先将表面已锚定了GM-CSF-L-SA-6His或6His-SA-L-GM-CSF融合蛋白的10⁶B16.F10经超声破碎，离心收集其不溶的膜性成分；然后将其悬浮于100μl完全培养基中，用XS106细胞株³H掺入法对其中的GM-CSF进行生物活性测定(图5)。

实施例8.GM-CSF-L-SA-6His修饰的B6.F10肿瘤细胞致瘤性研究。

分别将10⁵GFP(绿色荧光蛋白)-L-SA-6His(阴性对照)和GM-CSF-L-SA-6His修饰的、活力好的B6.F10肿瘤细胞接种于C57BL/6小鼠左肋腹部的皮下，然后观察肿瘤的生长情况和小鼠在45天内的成活情况(图6)。

实施例9.GM-CSF-L-SA-6His修饰的B6.F10肿瘤细胞疫苗的预防肿瘤性研究。

分别将10⁶GFP-L-SA-6His和GM-CSF-L-SA-6His修饰的、γ射线灭活(20000rad)的B6.F10肿瘤细胞接种于C57BL/6小鼠左肋腹部的皮内，14天后加强一次；7天后，将10⁵未经任何处理的B6.F10肿瘤细胞接种于小鼠右肋腹部的皮下，然后观察肿瘤的生长情况和小鼠在40天内的成活情况(图7)。

实施例10.GM-CSF-L-SA-6His修饰的B6.F10细胞疫苗的治疗肿瘤性研究。

将10⁵未经任何处理的B6.F10肿瘤细胞接种于小鼠右肋腹部的皮下；4，11和18天后，分别将10⁶GFP-L-SA-6His或GM-CSF-L-SA-6His修饰的、γ射线灭活(20000rad)的B6.F10肿瘤细胞接种于C57BL/6小鼠左肋腹部的皮内，然后观察肿瘤的生长情况和小鼠在40天内的成活情况(图8)。

链抗生物素/粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白

<110>高基民

<120>链抗生物素/粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白

<160>2

<210>1

<211>930bp

<212>DNA

<213>人工DNA

<220>

<221>GMCSF-L-SA-6His

<222>(1-381bp)

<223>该DNA片段为编码小鼠成熟GM-CSF的cDNA，其中5’端含有ATG，作为大肠杆菌翻译GMCSF-L-SA-6His融合蛋白的起始密码，3’端含有一个EcoRI的酶切位点。

<220>

<221>GMCSF-L-SA-6His

<222>(382-426bp)

<223>该DNA片段(45bp)编码富含甘氨酸和丝氨酸的链接肽(L)，此15肽非常灵活，有助于融合蛋白中各单元蛋白质分子的独立折叠，从而保存各自的生物活性，最终提高融合蛋白的双重活性。此外，其3’端含有一个BamHI的酶切位点。

<220>

<221>GMCSF-L-SA-6His

<222>(427-930bp)

<223>DNA片段(504bp)编码链霉菌成熟的全长抗生物素(SA)，其3’端含有编码一个XhoI位点，6个组氨酸和终止码的序列(904-930bp)。

<400>1

1 ATGGCACCCACCCGCTCACCCATCACTGTCACCCGGCCTTGGAAGCATGTAGAGGCCATC 60

MetAlaProThrArgSerProIleThrvalThrArgProTrpLysHisValGluAlaIle

61 AAAGAAGCCCTGAACCTCCTGGATGACATGCCTGTCACATTGAATGAAGAGGTAGAAGTC 120

LysGluAlaLeuAsnLeuLeuAspAspMetProValThrLeuAsnGluGluValGluVal

121 GTCTCTAACGAGTTCTCCTTCAAGAAGCTAACATGTGTGCAGACCCGCCTGAAGATATTC 180

ValSerAsnGluPheSerPheLysLysLeuThrCysValGlnThrArgLeuLysIlePhe

181 GAGCAGGGTCTACGGGGCAATTTCACCAAACTCAAGGGCGCCTTGAACATGACAGCCAGC 240

GluGlnGlyLeuArgGlyAsnPheThrLysLeuLysGlyAlaLeuAsnMetThrAlaSer

241 TACTACCAGACATACTGCCCCCCAACTCCGGAAACGGACTGTGAAACACAAGTTACCACC 300

TyrTyrGlnThrTyrCysProProThrProGluThrAspCysGluThrGlnValThrThr

301 TATGCGGATTTCATAGACAGCCTTAAAACCTTTCTGACTGATATCCCCTTTGAATGCAAA 360

TyrAlaAspPheIleAspSerLeuLysThrPheLeuThrAspIleProPheGluCysLys

361 AAACCAGTCCAAAAAGAATTCTCGAGCGGGGGCAGCGGGGGCGGAGGCAGCGGCGGGGGC 420

LysProValGlnLysGluPheSerSerGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGly

421 GGATCCGACCCCTCCAAGGACTCGAAGGCCCAGGTCTCGGCCGCCGAGGCCGGCATCACC 480

GlySerAspProSerLysAspSerLysAlaGlnValSerAlaAlaGluAlaGlyIleThr

481 GGCACCTGGTACAACCAGCTCGGCTCGACCTTCATCGTGACCGCGGGCGCCGACGGCGCC 540

GlyThrTrpTyrAsnGlnLeuGlySerThrPheIleValThrAlaGlyAlaAspGlyAla

541 CTGACCGGAACCTACGAGTCGGCCGTCGGCAACGCCGAGAGCCGCTACGTCCTGACCGGT 600

LeuThrGlyThrTyrGluSerAlaValGlyAsnAlaGluSerArgTyrValLeuThrGly

601 CGTTACGACAGCGCCCCGGCCACCGACGGCAGCGGCACCGCCCTCGGTTGGACGGTGGCC 660

ArgTyrAspSerAlaProAlaThrAspGlySerGlyThrAlaLeuGlyTrpThrValAla

661 TGGAAGAATAACTACCGCAACGCCCACTCCGCGACCACGTGGAGCGGCCAGTACGTCGGC 720

TrpLysAsnAsnTyrArgAsnAlaHisSerAlaThrThrTrpSerGlyGlnTyrValGly

721 GGCGCCGAGGCGAGGATCAACACCCAGTGGCTGCTGACCTCCGGCACCACCGAGGCCAAC 780

GlyAlaGluAlaArgIleAsnThrGlnTrpLeuLeuThrSerGlyThrThrGluAlaAsn

781 GCCTGGAAGTCCACGCTGGTCGGCCACGACACCTTCACCAAGGTGAAGCCGTCCGCCGCC 840

AlaTrpLysSerThrLeuValGlyHisAspThrPheThrLysValLysProSerAlaAla

841 TCCATCGACGCGGCGAAGAAGGCCGGCGTCAACAACGGCAACCCGCTCGACGCCGTTCAG 900

SerIleAspAlaAlaLysLysAlaGlyValAsnAsnGlyAsnProLeuAspAlaValGln

901 CAGCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA 930

GlnLeuGluHisHisHisHisHisHis *

<210>2

<211>891bp

<212>DNA

<213>人工DNA

<220>

<221>6His-SA-L-GMCSF

<222>(1-459bp)

<223>该DNA片段为编码链霉菌抗生物素核心部分(与成熟的全长抗生物素相比，在N-端缺失了13个氨基酸)的cDNA，其中5’端含有ATG起始密码子和6个组氨酸密码子。

<220>

<221>6His-SA-L-GMCSF

<222>(460-513bp)

<223>该DNA片段编码L链接肽(460-504bp)，并且其3’端含有BamHI和EcoRI的酶切位点。

<220>

<221>6His-SA-L-GMCSF

<222>(514-891bp)

<223>该DNA片段编码小鼠成熟GM-CSF，其5’端含有ATG，从而编码一额外的甲硫氨酸。

<400>2

1 ATGCATCATCACCATCACCATGAGGCCGGCATCACCGGCACCTGGTACAACCAGCTCGGC 60

MetHisHisHisHisHisHisGluAlaGlyIleThrGlyThrTrpTyrAsnGlnLeuGly

61 TCGACCTTCATCGTGACCGCGGGCGCCGACGGCGCCCTGACCGGAACCTACGAGTCGGCC 120

SerThrpheIleValThrAlaGlyAlaAspGlyAlaLeuThrGlyThrTyrGluSerAla

121 GTCGGCAACGCCGAGAGCCGCTACGTCCTGACCGGTCGTTACGACAGCGCCCCGGCCACC 180

ValGlyAsnAlaGluSerArgTyrValLeuThrGlyArgTyrAspSerAlaProAlaThr

181 GACGGCAGCGGCACCGCCCTCGGTTGGACGGTGGCCTGGAAGAATAACTACCGCAACGCC 240

AspGlySerGlyThrAlaLeuGlyTrpThrValAlaTrpLysAsnAsnTyrArgAsnAla

241 CACTCCGCGACCACGTGGAGCGGCCAGTACGTCGGCGGCGCCGAGGCGAGGATCAACACC 300

HisSerAlaThrThrTrpSerGlyGlnTyrValGlyGlyAlaGluAlaArgIleAsnThr

301 CAGTGGCTGCTGACCTCCGGCACCACCGAGGCCAACGCCTGGAAGTCCACGCTGGTCGGC 360

GlnTrpLeuLeuThrSerGlyThrThrGluAlaAsnAlaTrpLysSerThrLeuValGly

361 CACGACACCTTCACCAAGGTGAAGCCGTCCGCCGCCTCCATCGACGCGGCGAAGAAGGCC 420

HisAspThrPheThrLysValLysProSerAlaAlaSerIleAspAlaAlaLysLysAla

421 GGCGTCAACAACGGCAACCCGCTCGACGCCGTTCAGCAGTCGAGCGGGGGCAGCGGGGGC 480

GlyValAsnAsnGlyAsnProLeuAspAlaValGlnGlnSerSerGlyGlySerGlyGly

481 GGAGGCAGCGGCGGGGGCGGATCCGCCGAATTCATGGCACCCACCCGCTCACCCATCACT 540

GlyGlySerGlyGlyGlyGlySerAlaGluPheMetAlaProThrArgSerProIleThr

541 GTCACCCGGCCTTGGAAGCATGTAGAGGCCATCAAAGAAGCCCTGAACCTCCTGGATGAC 600

ValThrArgProTrpLysHisValGluAlaIleLysGluAlaLeuAsnLeuLeuAspAsp

601 ATGCCTGTCACATTGAATGAAGAGGTAGAAGTCGTCTCTAACGAGTTCTCCTTCAAGAAG 660

MetProValThrLeuAsnGluGluValGluValValSerAsnGluPheSerPheLysLys

661 CTAACATGTGTGCAGACCCGCCTGAAGATATTCGAGCAGGGTCTACGGGGCAATTTCACC 720

LeuThrCysValGlnThrArgLeuLysIlePheGluGlnGlyLeuArgGlyAsnPheThr

721 AAACTCAAGGGCGCCTTGAACATGACAGCCAGCTACTACCAGACATACTGCCCCCCAACT 780

LysLeuLysGlyAlaLeuAsnMetThrAlaSerTyrTyrGlnThrTyrCysProProThr

781 CCGGAAACGGACTGTGAAACACAAGTTACCACCTATGCGGATTTCATAGACAGCCTTAAA 840

ProGluThrAspCysGluThrGlnValThrThrTyrAlaAspPheIleAspSerLeuLys

841 ACCTTTCTGACTGATATCCCCTTTGAATGCAAAAAACCAGTCCAAAAATGA 891

ThrPheLeuThrAspIleProPheGluCysLysLysProValGlnLys *

Claims

1.一种融合蛋白，其特征在于将链抗生物素(streptavidin，即SA)的基因与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因经过基因重组、表达而产生的融合蛋白，即链抗生物素/粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白(SA/GM-CSF融合蛋白)。

2.根据权利要求1所述的SA/GM-CSF融合蛋白，其特征在于SA序列可位于融合蛋白的N端或C端。

3.根据权利要求1、2所述的SA/GM-CSF融合蛋白，其特征在于SA与GM-CSF之间的接头L是甘氨酸/丝氨酸丰富的17肽(EFSSGGSGGGGSGGGGS)，接头的核苷酸序列为GAA TTC TCGAGC GGG GGC AGC GGG GGC GGA GGC AGC GGC GGG GGC GGATCC。

4.根据权利要求1、2所述的SA/GM-CSF融合蛋白，其特征在于将融合基因克隆于带有T7启动子的表达载体pET24中，构建成SA-L-GM-CSF-pET24和GM-CSF-L-SA-pET24表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)后实现了高效表达；转化后获得的工程菌命名为大肠杆菌GM-CSF-L-SA/pET24和SA-L-GM-CSF/pET24，其表达产物分别为SA-L-GM-CSF融合蛋白和GM-CSF-L-SA，均具有双功能分子活性，即强力结合生物素活性和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的生物活性。

5.根据权利要求1、2所述的SA/GM-CSF融合蛋白，其特征在于将6His引入融合蛋白的N端(如6His-SA-L-GM-CSF)或C端(如GM-CSF-L-SA-6His)，从而便于这些融合蛋白的分离纯化。