CN1221754A - 血小板生成素/粒、巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白及用途 - Google Patents
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Abstract
一种能刺激全血细胞生长的重组人血小板生成素/粒、巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白(rhTPO/GM-CSF)。属生物产品及用途领域。将人血小板生成素(hTPO)N-端1—174位氨基酸融合于人粒、巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)127个氨基酸的N-端,得到具有TPO及GM-CSF双重生物活性的融合蛋白,分子量为34KDa。rhTPO/GM-CSF融合蛋白具有对红细胞系、巨核细胞系及粒细胞系造血的刺激作用,可用于治疗各种原因引起的造血组织损伤综合症。
Description
本发明涉及一种生物工程产品,及该产品的用途,具体地说涉及重组人血小板生成素/粒、巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白(recombinant humanthrombopoietin/granulocyte-macrophage colony-stimulating factor fusion protein,rhTPO/GM-CSF),及其对各类造血组织损伤的治疗作用。
人类各类恶性肿瘤的治疗,除手术外以放疗及化疗最为常用。然而有效的放疗及化疗常常造成机体造血组织的严重损伤,引起阻碍治疗进一步进行的贫血、感染及出血症状,甚至死亡。目前临床上除了血液制品的支持治疗外,已应用了红细胞生长因子(erythropoietin EPO)、粒、巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor GM-CSF)及血小板生成素(thrombopoietin TPO)等生物因子来治疗继发性全血细胞减少,并收到了良好的效果。TPO单独使用时可刺激红细胞系及巨核细胞系造血,不能刺激粒细胞系的造血(Molineux G,et al.Stem Cell.1997,15:43-49);GM-CSF单独使用时可刺激粒细胞系的造血,不能刺激红细胞系及巨核细胞系造血(Broxmeyer HE,et al,Exp Hematol.1988,16:594-602)。近年来,随着分子生物学和基因工程技术的发展,人们不但研究单一的天然生物因子,而且为了不同的目的构建融合的生物活性因子。自1986年日本的Masahata等在大肠杆菌中表达了人干扰素γ(IFN-γ)/白细胞介素2(IL-2)的融合蛋白以来,迄今国内外已有了PLXY321、IFN-γ/肿瘤坏死因子(TNF)、IL-2/IL-6、IL-3/EPO及CH925等具不同作用的融合蛋白因子的研究报道(白介素6-白介素2融合蛋白及其制法和用途专利申请号993100115.3)。目前尚未见到TPO和GM-CSF融合蛋白的报道。
本发明的目的是获得一个具有能同时促进机体红细胞系、粒细胞系及巨核细胞系造血的生物细胞因子,以治疗临床上各类造血组织损伤综合症。
本发明的目的通过以下技术方案得以实现:将编码hTPO N-端1-174位氨基酸的DNA片段利用酶切及连接的方法,融合于完整的127个氨基酸的hGM-CSF成熟蛋白编码序列N-端,获得编码hTPO/GM-CSF的融合基因。将融合基因插入合适的表达质粒pBV220,并转入合适的宿主细胞JM101,表达融合基因编码的融合蛋白。该融合蛋白N-端含hTPO分子第1-174位氨基酸序列,C-端为hGM-CSF成熟蛋白的127个氨基酸序列,在原核细胞中表达的融合蛋白以包涵体形式存在。将包涵体用2%Triton X100和1%脱氧胆酸洗涤后得到纯度为70%的包涵体。将包涵体溶于6M盐酸胍20mMDTT溶液中溶解后,在含1.4M盐酸胍的复性液中复性。复性产物经过Q-SepharoseFF阴离子交换柱层析纯化和透析,得到高活性的hTPO/GM-CSF融合蛋白。高活性的hTPO/GM-CSF融合蛋白也可用SDS-PAGE电泳几ZnSO4负染法直接从凝胶上分离纯化获得。以纯化的、1∶10至1∶10000倍比稀释的rhTPO/GM-CSF融合蛋白培养小鼠骨髓造血祖细胞,结果各个浓度的rhTPO/GM-CSF融合蛋白对小鼠骨髓造血祖细胞的CFU-E,BFU-E,CFU-Meg与CFU-GM均有明显的刺激作用。说明rhTPO/GM-CSF融合蛋白即有与TPO相同的刺激小鼠骨髓红细胞系、巨核细胞系的作用,又有与GM-CSF相同的刺激粒细胞系的作用,具备了TPO和GM-CSF双重的生物活性。在对Co60照射所致小鼠造血组织损伤模型的治疗中可见,hTPO/GM-CSF融合蛋白可促进受照小鼠血像的早期恢复。说明,rhTPO/GM-CSF融合蛋白是一个具有TPO和GM-CSF双重生物活性的新的生物因子,对骨髓红细胞系、粒细胞系及巨核细胞系三系造血均有明显的刺激活性。rhTPO/GM-CSF融合蛋白可用于治疗电离辐射,化学药物及生物病源体等因素造成的红细胞,白细胞及血小板减少和缺乏引起的贫血、感染和出血等症状。本发明的主要内容是在获取hTPO/GM-CSF融合蛋白cDNA,并成功构建高效表达菌株的基础上,建立了一整套工程菌诱导表达、包涵体的分离和裂解、蛋白质纯化和复性工艺,以获得rhTPO/GM-CSF融合蛋白纯品,并对rhTPO/GM-CSF融合蛋白的生物学性能进行了描述,表明了rhTPO/GM-CSF融合蛋白能同时促进机体红细胞系、粒细胞系及巨核细胞系三系造血,可用于治疗放、化疗等各种原因造成的造血组织损伤综合症。
结合附图说明本发明的具体实施方法如下:
图1为rhTPO/GM-CSF融合蛋白基因的硷基序列(bp)。
图2为rhTPO/GM-CSF融合蛋白的表达质粒构建图。图中1是pUC18-TPO:2是pUC18-GM-CSF;3是TPO基因片段;4是GM-CSF基因片段;5是pBV220;6是pBV220-TPO/GM-CSF。
实施例一.rhTPO/GM-CSF融合基因的构建
图1为rhTPO/GM-CSF融合蛋白基因的硷基序列。提取pUC18/hTPO及pUC18/hGM-CSF质粒DNA,纯化。以EcoRⅠ及SacⅠ酶切取编码hTPO N-端1-174位氨基酸的DNA片段,以EcoRⅠ和BamHⅠ酶切取编码hGM-CSF127个氨基酸成熟蛋白的DNA片段,以T4连接酶将hTPO的DNA片段融合于hGM-CSF的DNA片段的N-端,获得编码hTPO/GM-CSF的融合基因。将融合基因插入原核表达质粒pBV220的多克隆酶切位点EcoRⅠ和BamHⅠ之间,如图2所示,并转入原核宿主细胞大肠杆菌JM101,经筛选得到了含重组质粒pBV220/TPO/GM-CSF的阳性克隆。
实施例二.rhTPO/GM-CSF融合蛋白的表达及小量制备
1rhTPO/GM-CSF融合蛋白在大肠杆菌JM101中的表达
挑取转化阳性的大肠杆菌JM101菌落,接种于LB培养基中,30℃振摇培养过夜。次日转接2%于新鲜LB培养基中,30℃振摇培养至OD600达0.4,调温至42℃继续诱导培养4小时。离心收菌,以PBS缓冲液洗涤后超声破碎,离心收集包涵体。行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。结果表达产物的SDS-PAGE电泳见一个分子量为34KDa的新的蛋白条带,其分子量大小与预算一致。经激光密度扫描测定表达量约占菌体总蛋白量的18.22%,占包涵体蛋白的51.82%。
2rhTPO/GM-CSF融合蛋白的小量制备
以咪唑-SDS-硫酸锌负染凝胶,切下负染的SDS-PAGE电泳凝胶上的rhTPO/GM-CSF融合蛋白条带,以50mmol/L PBS浸出蛋白因子。经50-20mmol/L的PBS缓冲液4℃透析、复性72小时。最后离心除杂质,过滤除菌,收集rhTPO/GM-CSF融合蛋白。以紫外分光光度计测得蛋白浓度为102.1ug/ml。酶联免疫吸附测定显示,rhTPO/GM-CSF融合蛋白与hGM-CSF的单克隆抗体呈阳性反应,说明本发明所构建的rhTPO/GM-CSF基因的阅读框架正确,所表达的融合蛋白确为hTPO/GM-CSF。
实施例三.rhTPO/GM-CSF融合蛋白的高效表达及大量制备
1.rhTPO/GM-CSF在大肠杆菌JM101中的高效表达
挑取JM101(pBV/TPO/GM-CSF)工程菌单菌落,接种于10ml LB培养基(含氨苄青霉素50ug/ml),200转/分振摇,30℃培养过夜。次日接种1%过夜菌于1升LB培养基(含氨苄青霉素50ug/ml),30℃振摇培养4小时。在4℃,3000转/分离心收集菌体。
2.包涵体的制备及洗涤
将收集的菌体悬于50ml裂解缓冲液(50mM Tris-Hcl pH8.0,1MNacl,,0.5mg/ml溶菌酶),室温孵育30分钟。超声破碎细菌,然后加入2%Triton X100,12000转/分,4℃离心10分钟,收集沉淀。用1%脱氧胆酸洗涤一次,再用蒸馏水洗涤一次。
3.包涵体的溶解及复性
将包涵体溶于8ml 6M盐酸胍,50mM Tris-Hcl pH8.0,20mMDTT溶液,37℃孵育1小时。4℃离心10分钟,收集上清,弃去不溶性沉淀。将溶解后的包涵体按1∶10(V/V)稀释于复性液,25℃复性36小时,复性液含50mMTris-Hcl pH8.0,1mM EDTA,4mM GSH,2mM GSSH,1.4M盐酸胍。将复性液对10升50mM Tris-Hcl pH8.0,1mM EDTA透析缓冲液彻底透析。12000转/分,4℃离心10分钟,去除沉淀。
4.纯化
将透析液按0.5ml/分钟流速上样于用50mM Tris-Hcl pH8.0,1mM EDTA平衡缓冲液平衡的(Q-Sepharose FF)阴离子交换层析柱。用平衡缓冲液洗脱未吸附杂蛋白。然后用含0-500mM Nacl的平衡缓冲液进行梯度洗脱,分步收集洗脱峰,将活性蛋白峰合并于0.9%的生理盐水彻底透析。
实施例四.rhTPO/GM-CSF融合蛋白的生物活性
1rhTPO/GM-CSF融合蛋白的体外活性测定
小鼠骨髓造血祖细胞的体外培养:取昆明种正常小鼠骨髓有核细胞,按每体系1×105个有核细胞接种于含有10-4mol/L β-巯基乙醇,3%L-谷氨酰胺,10%马血清及2.7%甲基纤维素的McCoy′s培养体系中。阳性对照组中每体系加入EPO2u,-IL-340ng,IL-12000u,或GM-CSF100ng。TPO组每体系加入本实验室制备的真核细胞稳定表达的rhTPO因子200ng。阴性对照组中只有培养体系,不含造血因子。实验组中加入1∶10,1∶100,1∶1000,1∶10000倍比稀释的rhTPO/GM-CSF融合蛋白。于37℃,5%CO2及一定的湿度下培养7天,在光学显微镜下计数BFU-E,CFU-Meg及CFU-GM集落形成数,并将BFU-E,CFU-Meg及CFU-GM集落形成数结果与阳性及阴性对照相比较。结果4个浓度的rhTPO/GM-CSF融合蛋白对小鼠骨髓造血祖细胞的红细胞系、粒细胞系及巨核细胞系均有明显的刺激作用,其中以1∶100-1∶1000稀释度的活性较高,过高或过低的因子浓度将对细胞集落的形成有影响。以析因设计资料的方差分析,得出实验组的BFU-E,CFU-Meg及CFU-GM计数在统计学上与阳性对照组比较无明显差异(P>0.05),与阴性对照组比较有非常显著的差异(P<0.01)。BFU-E及CFU-Meg计数与单用TPO组比较无明显差异(P>0.05)。CFU-GM计数与单用TPO组比较有非常显著的差异(P<0.01)。单用TPO组的BFU-E及CFU-Meg计数与阳性对照组比较无明显差异(P>0.05),与阴性对照组比较有非常显著的差异(P<0.01)。单用TPO组CFU-GM计数与阴性对照组比较无明显差异(P>0.05),与阳性对照组比较有非常显著的差异(P<0.01)。说明单用TPO有刺激红细胞系及巨核细胞系的作用,但没有刺激粒细胞系的作用。rhTPO/GM-CSF融合蛋白即有与TPO相同的刺激小鼠骨髓BFU-E,CFU-Meg的作用,又有与GM-CSF相同的刺激CFU-GM的作用,具备了TPO和GM-CSF双重的生物活性。
2rhTPO/GM-CSF融合蛋白治疗造血组织损伤的活性测定
小鼠造血组织损伤模型的建立:以5.0Gy Co r射线照射昆明种正常雄性小白鼠为造血组织损伤模型。实验动物分组:分为正常动物及受照动物两大组。每大组又分为5个组:1组:正常对照组,腹腔注射生理盐水;2组:实验组,腹腔注射rhTPO/GM-CSF融合蛋白200ug/Kg/天;3组:腹腔注射TPO200ug/Kg/天和GM-CSF50ug/Kg/天混合给药组;4组:腹腔注射TPO200ug/Kg/天单药组;5组:腹腔注射GM-CSF 50ug/Kg/天单药组。观察小鼠外周血像及受照后10天小鼠骨髓造血祖细胞培养结果。结果,正常动物,给融合蛋白实验组小鼠骨髓及外周血像较正常对照组有不同程度的升高;Co60照射动物,给融合蛋白实验组小鼠骨髓及外周血像也较对照组有明显的升高。说明,rhTPO/GM-CSF融合蛋白是一个具有TPO和GM-CSF双重生物活性的新的生物因子,对骨髓红细胞系、粒细胞系及巨核细胞系三系造血均有明显的刺激活性。rhTPO/GM-CSF融合蛋白可用于治疗电离辐射,化学药物及生物病源体等因素造成的红细胞,白细胞及血小板减少和缺乏引起的贫血、感染和出血等症状。
总之,本发明公开了利用分子生物学和基因工程技术将hTPO基因与hGM-CSF基因相融合,构建了新的融合蛋白rhTPO/GM-CSF。在用途上,rhTPO/GM-CSF融合蛋白具有对红细胞系、巨核细胞系及粒细胞系的刺激作用,可用于临床治疗放、化疗等各种原因引起的造血组织损伤综合症。
Claims (5)
1一种融合蛋白造血因子,其特征在于该融合蛋白由人血小板生成素(hTPO)和人粒、巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)组成。
2根据权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于该融合蛋白N-端为hTPO的序列,C-端为hGM-CSF的序列。
3根据权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于该融合蛋白含有图1所示的DNA序列。
4根据权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于该融合蛋白包含hTPO功能段的第1-174位氨基酸序列及成熟hGM-CSF的127个氨基酸序列,分子量为34KDa。
5根据权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于该融合蛋白具有对红细胞系、巨核细胞系及粒细胞系造血的刺激作用,可用于治疗各种原因引起的造血组织损伤综合症。
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CN101863982A (zh) * | 2009-04-17 | 2010-10-20 | 哈药集团生物工程有限公司 | 一种用于升高血小板的融合蛋白及其制备方法 |
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