ES2882582T3 - Dispositivos microfluídicos que implementan el circuito de sangre y orina para emular el sistema microfisiológico homeostático - Google Patents
Dispositivos microfluídicos que implementan el circuito de sangre y orina para emular el sistema microfisiológico homeostático Download PDFInfo
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Abstract
Un dispositivo microfluídico que comprende un circuito de sangre con uno o más compartimentos de cultivo celular y un circuito de orina que comprende una unidad de filtración y una unidad de reabsorción, en donde ambos circuitos están conectados entre sí a través de la unidad de filtración y la unidad de reabsorción, y que además comprende un compartimento de depósito además de uno o más compartimentos de cultivo celular, que sirve para añadir solución de nutrientes al sistema.
Description
DESCRIPCIÓN
Dispositivos microfluídicos que implementan el circuito de sangre y orina para emular el sistema microfisiológico homeostático
CAMPO TÉCNICO
La presente descripción se refiere a nuevos dispositivos microfluídicos y su uso para el funcionamiento de sistemas microfisiológicos. Los nuevos dispositivos microfluídicos son particularmente útiles para el análisis farmacocinéticofarmacodinámico en el contexto de perfiles de ADME(T). La presente descripción proporciona nuevos dispositivos microfluídicos que comprenden un primer circuito de "sangre" con uno o más compartimentos de cultivo celular, y un segundo circuito de "orina" que comprende una unidad de filtración y reabsorción renal, en donde ambos circuitos están conectados entre sí a través de la unidad de filtración y la unidad de reabsorción. La presente descripción proporciona además métodos, kits y ensayos que implementan los nuevos dispositivos microfluídicos.
ANTECEDENTES TÉCNICOS
Los dispositivos microfluídicos son capaces de emular la biología humana in vitro a la escala biológicamente aceptable más pequeña. A diferencia de los cultivos de células y tejidos convencionales (estáticos), los sistemas microfisiológicos aplican flujo de fluido dinámico para la nutrición fisiológica de los tejidos como un factor para imitar la función de los órganos con un uso mínimo de células y tejidos humanos. La tecnología de multiórganos en chips es de particular interés para la industria farmacéutica en términos de desarrollo de fármacos y ensayos de toxicidad. Los modelos de multiórganos en un chip pueden mejorar la comprensión fundamental de los procesos biológicos complejos y se considera que permiten realizar ensayos más rápidos, precisos, rentables y clínicamente relevantes de fármacos, así como de cosméticos. Por tanto, existe un creciente reconocimiento en la técnica de que los ensayos in vitro usando sistemas microfisiológicos implementados en dispositivos microfluídicos pueden ser más eficaces y también más fiables que los ensayos in vivo.
Existe una necesidad en la técnica de nuevos sistemas microfluídicos de multiórganos que soporten las condiciones fisiológicas para mantener microambientes estables durante un largo periodo de tiempo y que permitan imitar la interacción fisiológica de dos o más modelos que emulan la funcionalidad de órganos. La presente descripción aborda esta necesidad proporcionando dispositivos microfluídicos nuevos, que se caracterizan específicamente por un circuito de sangre y un circuito de orina que establecen un sistema microfisiológico homeostático.
Sakolish y Mahler (RSC Adv., 2017, 7, 4216-4225) describen la disposición de las barreras de filtración renal del glomérulo y el túbulo en un dispositivo microfluídico que se usa específicamente en el cultivo de células renales humanas. Giobbe et al. (Nat. Methods, 2015, 12 (7), 637-640) describen la diferenciación funcional de células madre pluripotentes humanas en un chip. Zhang et al. (Future Sci. OA, 2017, 3 (2), FSO197) describen cultivos de células madre y diferenciación en dispositivos microfluídicos con el objeto de hacer órgano en un chip. El documento WO2013086329A describe un dispositivo microfluídico adaptado para imitar tejidos y órganos. Uno de los órganos a emular es el riñón, que comprende dos canales microfluídicos y una membrana.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
El nuevo dispositivo microfluídico proporcionado por la presente descripción permite, entre otros, emular interacciones fisiológicas de dos o más funciones de órganos dentro de un sistema para permitir la generación de datos a partir de un sistema microfisiológico homeostático. El sistema microfisiológico establecido con el nuevo dispositivo microfluídico soporta las condiciones fisiológicas para mantener microambientes estables en un sistema que imita la interacción e interferencias de varios modelos que emulan la función de los órganos.
El nuevo dispositivo microfluídico proporcionado por la presente descripción permite emular la interferencia de órgano a órgano humano, las rutas de ADME y los circuitos reguladores sistémicos entre modelos de órganos, como se demuestra en el presente documento. En particular, el nuevo dispositivo microfluídico proporciona un sistema microfisiológico con un microambiente estable, particularmente adecuado para la implementación de ensayos para el análisis farmacocinético-farmacodinámico en el contexto del perfil de ADME(T).
Los nuevos dispositivos microfluídicos proporcionados por la presente descripción proporcionan además el diseño de organoides o tejidos con sistemas microfisiológicos in vitro que usan células precursoras específicas de órganos derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) u organoides específicos de órganos derivados de iPSC.
En particular, la presente descripción proporciona:
[1] Un dispositivo microfluídico que comprende un circuito de sangre con uno o más compartimentos de cultivo celular y un circuito de orina que comprende una unidad de filtración y una unidad de reabsorción, en donde ambos circuitos están conectados entre sí a través de la unidad de filtración y la unidad de reabsorción, que comprende además un compartimento de depósito además de uno o más compartimentos de cultivo celular, que sirve para añadir solución de nutrientes al sistema.
[2] El dispositivo microfluídico de [1], en donde la unidad de filtración comprende una barrera de filtración que permite selectivamente el paso de moléculas desde el primer circuito al segundo circuito en función del tamaño y la carga de las moléculas.
[3] El dispositivo microfluídico de [2], en donde la barrera de filtración es una barrera mecánica o biológica, preferiblemente una barrera biológica que comprende podocitos.
[4] El dispositivo microfluídico de uno cualquiera de [1] -[3], en donde la unidad de reabsorción comprende una barrera que permite la reabsorción de fluido desde el segundo circuito al primer circuito.
[5] El dispositivo microfluídico de [4], en donde la barrera de reabsorción es una barrera biológica, preferiblemente en donde la barrera biológica comprende células del túbulo renal.
[6] El dispositivo microfluídico de cualquiera de [1]-[5], en donde al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito comprende un órgano equivalente que imita la función hepática, y al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito comprende un órgano equivalente que imita la función intestinal.
[7] Uso del dispositivo microfluídico de uno cualquiera de [1]-[6] en pruebas analíticas, diagnósticos, investigación, validación de objetivos, estudios de toxicidad, ingeniería de tejidos, fabricación de tejidos, cribado de fármacos y/o análisis farmacocinético-farmacodinámico.
[8] Un método de funcionamiento de un sistema microfisiológico que hace uso del dispositivo microfluídico de uno cualquiera de [1]-[6].
[9] El método de [8], que además comprende añadir selectivamente una solución de nutrientes al sistema microfisiológico a través del compartimento de cultivo celular que comprende un órgano o tejido equivalente que comprende células epiteliales del tracto gastrointestinal e imita la función intestinal.
[10] Un método para detectar un analito en un sistema microfisiológico que hace uso del dispositivo microfluídico de uno cualquiera de [1 ]-[6], en donde el método comprende añadir una muestra de ensayo a un compartimento de cultivo celular del primer circuito, preferiblemente en donde el compartimento de cultivo celular comprende un tejido que comprende células epiteliales del tracto gastrointestinal, la piel o el aparato respiratorio.
[11] Un método para imitar la homeostasis que comprende operar un sistema microfisiológico que comprende un primer circuito con uno o más compartimentos de cultivo celular y un segundo circuito que comprende una unidad de filtración y una unidad de reabsorción, en donde ambos circuitos están conectados entre sí a través de la unidad de filtración y la unidad de reabsorción.
[12] El método de [11], que comprende añadir selectivamente una solución de nutrientes al sistema microfisiológico a través de un compartimento de cultivo celular que comprende células epiteliales del tracto gastrointestinal, la piel o el aparato respiratorio, preferiblemente en donde las células epiteliales son células epiteliales del tracto gastrointestinal, preferiblemente del intestino delgado.
[13] Un método de cultivo y/o mantenimiento de células que comprende sembrar el dispositivo microfluídico de una cualquiera de las reivindicaciones [1]-[6] con células.
[14] Un kit para operar un sistema microfisiológico que comprende el dispositivo microfluídico de una cualquiera de las reivindicaciones [1]-[6] e instrucciones de uso.
[15] Un ensayo ADME (absorción, distribución, metabolismo, excreción) o un ensayo ADMET (absorción, distribución, metabolismo, excreción, toxicidad), que comprende el dispositivo microfluídico según una cualquiera de las reivindicaciones [1]-[6].
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Figura 1: muestra un patrón de chip de ADME-N de ejemplo (arriba) y una vista isométrica en capas separadas (abajo). La vista isométrica ilustra la posición de una membrana entre los dos circuitos (circuito de sangre y circuito de orina). ADME-N = chip ADME más equivalente neuronal.
Figura 2: muestra el diseño experimental de chips de iPSC y chips de tejido primario. RPTEC = línea celular epitelial del túbulo proximal renal. iPSC = célula madre pluripotente inducida. 2A : Diseño de experimentos 1.1 y 1.2, 2B : Diseño del experimento 2.
Figura 3: muestra mediciones de concentración de glucosa y actividad de LDH. 3A : mediciones de la concentración de glucosa y la actividad de LDH del experimento 1.1 (chips de iPSC); 3B : mediciones de la concentración de glucosa y la actividad de LDH del experimento 1.2 (chips de tejido primario). Las mediciones se hicieron diariamente en el compartimento apical del equivalente intestinal, en el depósito de medio "sangre" (para el circuito de sangre) y en el depósito de medio "orina" (para el circuito de orina).
Figura 4: muestra el equivalente tubular renal del chip de ADME-N completamente sembrado con RPTEC humanas (experimento 1.1, día 7). A : imagen de campo brillante (BF) el día 7 de cultivo. B-D: tinción inmunohistológica de las RPTEC el día 14 (experimento 1.2) B : núcleo teñido con DAPI (4',6-Diamidin-2-fenilindol); C : membranas celulares teñidas con NaK-ATPasa; D : citoesqueleto teñido con citoqueratina 8/18. RPTEC = células epiteliales del túbulo proximal renal.
Figura 5: muestra las mediciones de la concentración de aspartato transaminasa (AST) en el circuito de "sangre" en el depósito de medio 1 y el circuito de "orina" en el depósito de medio 2.
Figura 6: muestra un examen inmunohistológico de ejemplo de un equivalente de intestino de iPSC con células endoteliales primarias el día 7 del cultivo en chip de ADME-N (experimento 1.1). A : núcleo teñido con DAPI; B : células endoteliales primarias teñidas para CD31; C : Organoides intestinales de iPSC teñidos para NaK-ATPasa. D : núcleo teñido con DAPI; E : organoides intestinales de iPSC teñidos para Cyp3A4; F : Fibroblastos derivados de iPSC teñidos para vimentina.
Figura 7: muestra un examen inmunohistológico de ejemplo de equivalentes de hígado primarios (InSphero) cultivados durante dos semanas en el chip de ADME-N (experimento 1.2). A : núcleo teñido con DAPI; B : albúmina; C : Cyp3A4.
Figura 8: muestra un examen inmunohistológico de ejemplo de equivalente de hígado derivado de iPSC cultivado durante tres semanas en el chip de ADME-N (experimento 2). A : núcleo teñido con DAPI; B : fibroblastos de iPSC teñidos para vimentina; C : citoesqueleto de hepatocitos teñidos con citoqueratina 8/18, D : núcleo teñido con DAPI; E : uniones estrechas teñidas con ZO-1; F : albúmina.
Figura 9: muestra un examen inmunohistológico de ejemplo de equivalentes neuronales de iPSC cultivados durante dos semanas en el chip de ADME-N (experimento 1.2). A : núcleo teñido con DAPI; B : células neuronales teñidas con b Tubulina III; C : célula endotelial primaria teñida con vWF (factor de von-Willebrand); D : Imagen de campo brillante de esferoides neuronales extendidos sobre un hidrogel impreso que incluye células endoteliales.
Figura 10: muestra la medición de la concentración de LDH en el compartimento apical del equivalente intestinal, en el circuito de sangre en el depósito de medio 1 y en el circuito de orina en el depósito de medio 2 (experimento 2). La función de barrera del equivalente de intestino y del equivalente renal se muestra mediante diferentes concentraciones de LDH en los tres compartimentos.
Figura 11: muestra el alargamiento de las células endoteliales derivadas de iPSC en los canales del chip de multiórganos. Alta expresión del marcador endotelial CD31 el día 8 del cultivo en chip.
Figura 12: muestra una vista esquemática del corte transversal de un chip de ADME de la presente descripción. A = Administración, D = Distribución, M = Metabolismo, E = Excreción.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
El nuevo dispositivo microfluídico proporcionado por la presente descripción permite emular interacciones fisiológicas de dos o más funciones de órganos dentro de un sistema para permitir la generación de datos a partir de un sistema microfisiológico homeostático. El sistema microfisiológico implementado con el nuevo dispositivo microfluídico soporta las condiciones fisiológicas obligatorias para mantener microambientes estables en un sistema que imita la interacción y la interferencia de una serie de modelos que emulan las funciones de los órganos. La Figura 1 muestra un patrón de chip de ADME-N (ADME equivalente neuronal) de ejemplo (arriba) y una vista isométrica en capas separadas (abajo). La vista isométrica ilustra la colocación de una membrana entre los dos circuitos (circuito de sangre y circuito de orina). La figura 12 muestra una vista esquemática del corte transversal parcial de un chip de ADME de la presente descripción.
La figura 2 muestra el diseño experimental de chips de iPSC y chips de tejido primario. Se cultivaron conjuntos de chips durante 7, 14 y 21 días. En los puntos finales, se tomaron muestras celulares para los exámenes inmunohistológicos, qPCR y secuenciación de ARN. Se analizó en los líquidos sobrenadantes el contenido de glucosa, lactato, LDH (lactato deshidrogenasa), albúmina, urea, ALT (alanina aminotransferasa) y AST (aspartato transaminasa). Los controles de cultivos estáticos de los equivalentes de órganos dados se tomaron los días 0, 7 y 14.
Los nuevos dispositivos microfluídicos proporcionados por la presente descripción posibilitan específicamente la ingeniería de organoides o tejidos con sistemas microfisiológicos in vitro que usan células precursoras específicas de órganos derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) u organoides específicos de órganos derivados de iPSC. La presente descripción también demuestra que la tensión de cizalladura promueve el alargamiento de las células endoteliales derivadas de iPSC en los canales del chip de multiórganos (Fig. 11).
El nuevo dispositivo microfluídico proporcionado por la presente descripción permite emular la interacción de órgano a órgano humano, rutas de ADME y circuitos reguladores sistémicos entre modelos de órganos, como se demuestra en el presente documento. En particular, el nuevo dispositivo microfluídico proporciona un sistema microfisiológico con un microambiente estable, particularmente adecuado para la implementación de ensayos para el análisis farmacocinéticofarmacodinámico en el contexto del perfil de ADME(T). Se ha mostrado que el nuevo dispositivo microfluídico
proporcionado por la presente descripción implementa y mantiene la estabilidad homeostática del sistema microfisiológico, como se pone de manifiesto por las mediciones de glucosa y LDH representadas en las Figuras 3 y 10.
Los compartimentos glomerular y tubular (unidad de filtración y unidad de reabsorción) se pueden lograr con una combinación de una membrana de policarbonato y una capa compacta de células renales (Fig. 4). La primera implementa una barrera técnica para filtrar constituyentes del medio de mayor peso molecular y retarda su difusión. La última reabsorbe sustancias y produce la acumulación de gradientes de concentración a través del circuito de "sangre" y "orina". Este gradiente es visible no solo para la LDH, sino también para la aspartato transaminasa (AST, Fig. 5). Ambas concentraciones claramente diferentes demuestran la función de la membrana renal del nuevo chip de ADME microfluídico proporcionado por la presente descripción. La AST se origina en el equivalente de hígado, ya que es una enzima intracelular que se encuentra en los hepatocitos.
Todos los equivalentes de órganos se evaluaron de forma inmunohistoquímica para determinar la identidad, funcionalidad y viabilidad (Figs. 6-9).
El análisis metabólico puso de manifiesto el establecimiento de una homeostasis reproducible entre todos los equivalentes de órganos. La presente descripción permite demostrar la polarización celular, reorganización, función de barrera y el tráfico que se observa in vivo. La obtención de un microambiente estable en el nuevo dispositivo microfluídico combinando un primer circuito con uno o más compartimentos de cultivo celular y un segundo circuito que comprende una unidad de filtración y reabsorción que solapa con el primer circuito en las unidades renales abre posibilidades para ensayos de dosis repetidas, p. ej., en el desarrollo de fármacos.
La presente descripción proporciona un nuevo dispositivo microfluídico que comprende un primer circuito con uno o más compartimentos de cultivo celular y un segundo circuito que comprende una unidad de filtración y una unidad de reabsorción, en donde ambos circuitos están conectados entre sí a través de la unidad de filtración y la unidad de reabsorción. La figura 1 muestra un diseño de ejemplo de un nuevo dispositivo microfluídico que comprende dos circuitos (denominados "circuito de sangre" y "circuito de orina") que contienen cavidades para la incorporación de los siguientes equivalentes de órganos: intestino, hígado, riñón (segregado en glomérulo y túbulo), y tejido neuronal. Los tres primeros tejidos se usan para lograr el llamado perfil de ADME (adsorción, distribución, metabolismo, excreción). El último es un tejido adicional que complementa ese perfil. El chip se denomina, por lo tanto, chip de ADME-N (ADME equivalente neuronal/tejido). Un compartimento de depósito en cada circuito permite la toma de muestra de los líquidos sobrenadantes ("depósito de medio 1 y 2"). El medio se perfunde a través de la red microfluídica mediante dos microbombas neumáticas incorporadas, una para cada circuito. Los circuitos se solapan en los dos compartimentos de la unidad renal y están separados por una membrana porosa de policarbonato.
En comparación con los sistemas/chips de un solo órgano, el sistema microfisiológico/chip microfluídico de la presente descripción se puede considerar como un sistema/chip de multiórganos dado que el dispositivo microfluídico comprende dos circuitos y, por lo tanto, comprende al menos dos compartimentos de cultivo celular, estando uno de ellos localizado en el primer circuito, y siendo el otro una de las unidades del segundo circuito que imita la función renal, en particular la unidad de reabsorción.
En varias realizaciones, se puede considerar que el nuevo dispositivo microfluídico comprende un primer circuito con uno o más compartimentos de cultivo celular, y un segundo circuito que comprende una unidad de filtración y una unidad de reabsorción, donde ambos circuitos se solapan en la unidad de filtración y la unidad de reabsorción. En varias realizaciones preferidas, las partes que solapan de los dos circuitos (o las partes que conectan ambos circuitos entre sí) están separadas por una membrana porosa. Estas partes de solapamiento/conexión se refieren específicamente a la unidad de filtración y la unidad de reabsorción.
En varias realizaciones, dicha membrana porosa que separa las partes de solapamiento/conexión de los dos circuitos es una membrana porosa sintética o biológica. En diversas realizaciones, dicha membrana porosa puede estar hecha de colágeno, fibrina, matriz extracelular (incluyendo matriz de órgano descelularizada) o mezclas de los mismos, sin estar limitado a ello. En varias realizaciones, la membrana porosa presenta las mismas propiedades que un inserto Transwell®. En varias realizaciones, la membrana porosa es reabsorbible por las células. En varias otras realizaciones, la membrana porosa está hecha de policarbonato. En varias otras realizaciones, la membrana porosa es una membrana porosa hecha de poli(dimetilsiloxano) (PDMS).
La unidad de filtración y la unidad de reabsorción son compartimentos de cultivo celular separados para la incorporación de células renales, en particular un equivalente glomerular renal (unidad de filtración) y un equivalente tubular renal (unidad de reabsorción).
Como se describe en el presente documento, las expresiones "compartimento(s) de cultivo celular" y "cámara(s) de cultivo celular" o "cavidad(es) de cultivo celular" se pueden usar indistintamente en el presente documento. Un compartimento de cultivo celular según la presente descripción es un compartimento, cámara o cavidad particularmente adecuado para cultivar células y tejidos como se usa y describe en el contexto de la presente descripción. En varias realizaciones, el compartimento de cultivo celular comprende un formato de placa de pocillos, en particular placas de cultivo celular de (micro)pocillos (o multipocillos) en cualquiera de los formatos de 6, 12, 24, 48, 96 y 384 pocillos. Las realizaciones preferidas abarcan multipocillos en formato de 24, 48, 96 o 384 pocillos. Los
multipocillos pueden estar hechos de una variedad de materiales, aunque los materiales más comunes son poliestireno y polipropileno, que pueden usarse en diversas realizaciones de la presente descripción. En varias otras realizaciones, el compartimento de cultivo celular es un inserto Transwell® (microfluídico), más preferiblemente un inserto Transwell® (microfluídico) hecho de policarbonato (PC), poliéster (PE), politetrafluoroetileno (PTFE) recubierto de colágeno o PET (poli(tereftalato de etileno)). Como se describe en el presente documento, se puede describir que un compartimento de cultivo celular usado en el contexto de la presente descripción tiene una membrana porosa (superficie) para el cultivo y crecimiento de células/tejidos.
Como se describe en el presente documento, una membrana porosa significa específicamente, sin estar limitado a ello, una membrana que tiene una estructura porosa que se puede usar no solo para filtrar, medir y/o separar moléculas químicas y/o biológicas, sino también como una superficie para cultivo y crecimiento de células o tejidos. La membrana porosa de un compartimento de cultivo celular, como se usa en el contexto de la presente descripción, sirve específicamente para establecer una conexión fluida entre el equivalente de órgano comprendido por el compartimento de cultivo celular y la red microfluídica. Por consiguiente, en varias realizaciones, la membrana porosa de un compartimento de cultivo celular como se describe en el presente documento está dispuesta de manera que el equivalente de órgano (células/tejido) colocado sobre la superficie de la membrana porosa esté en conexión fluida con los canales microfluídicos del dispositivo microfluídico. En varias realizaciones, la membrana porosa se puede sembrar con células en ambos lados de la membrana. Preferiblemente, las células endoteliales se siembran en el lado inferior de la membrana porosa.
En general, mediante los procedimientos de fabricación el tamaño de los poros se puede ajustar desde unos pocos nanómetros a micrómetros, permitiendo así la filtración, medición y separación de moléculas químicas y biológicas objetivo, y también el flujo fluídico entre los equivalentes de órganos en los compartimentos de cultivo celular y la red de canales microfluídicos. En varias realizaciones, la membrana porosa es una membrana porosa como se ha descrito antes. Por lo tanto, la membrana porosa puede ser una membrana porosa sintética o biológica. En diversas realizaciones, dicha membrana porosa puede estar hecha de cualquiera de colágeno, fibrina o matriz extracelular (incluyendo matriz de órgano descelularizada) sin estar limitada a ello. En varias realizaciones, la membrana porosa presenta las mismas propiedades que un inserto Transwell®. En varias realizaciones, la membrana porosa es reabsorbible por las células. En varias otras realizaciones, la membrana porosa está hecha de policarbonato. En varias otras realizaciones preferidas, la membrana porosa es una membrana porosa hecha de poli(dimetilsiloxano) (PDMS).
Como se describe en el presente documento, la expresión "primer circuito" significa específicamente un sistema circulatorio que imita un sistema circulatorio sanguíneo de mamífero, más específicamente que imita el sistema circulatorio sanguíneo humano. Como se describe adicionalmente en el presente documento, las expresiones "primer circuito" y "equivalente del circuito de sangre" o "circuito de sangre biomimético" se pueden usar indistintamente en el presente documento. Asimismo, como se describe en el presente documento, la expresión "segundo circuito" significa específicamente un sistema circulatorio que imita un sistema urinario de mamífero, más específicamente que imita el sistema urinario humano. Como se describe adicionalmente en el presente documento, las expresiones "segundo circuito" y "equivalente del circuito de orina " o "circuito de orina biomimético" se pueden usar indistintamente en el presente documento.
La filtración renal incluye filtración tanto pasiva como activa, con el glomérulo actuando como barrera de filtración pasiva evitando que entren proteínas del suero de mayor peso molecular en la nefrona. Por consiguiente, dichas proteínas del suero de mayor peso molecular continúan circulando en el torrente sanguíneo. Como se describe en el presente documento, la unidad de filtración del nuevo dispositivo microfluídico que se describe en el presente documento comprende una barrera de filtración que permite el paso selectivamente de moléculas desde el primer circuito ("circuito de sangre") al segundo circuito ("circuito de orina") en función del tamaño y carga de las moléculas, imitando así la barrera de filtración selectiva del glomérulo.
En varias realizaciones de la presente descripción, la barrera de filtración comprendida por la unidad de filtración se implementa mediante la membrana porosa que separa la unidad de filtración (y la unidad de reabsorción) del circuito de sangre (separando las partes que solapan de los dos circuitos). Por lo tanto, según dichas realizaciones, la barrera de filtración se puede considerar una barrera de filtración mecánica (porosa). Específicamente, la barrera de filtración mecánica (porosa) está imitando la barrera de filtración del glomérulo. Por consiguiente, en diversas realizaciones, la barrera de filtración puede incluso implementarse mediante un compartimento de cultivo celular que tenga una membrana porosa. En realizaciones preferidas, la barrera de filtración mecánica tiene un tamaño de poros de aproximadamente 8 nm, pero puede tener un tamaño de poros < 8 nm. Según otras realizaciones preferidas, la barrera de filtración mecánica tiene un tamaño de poros que fija un límite superior de aproximadamente 69 kDa para que las proteínas del suero entren en el segundo circuito (de orina). En varias realizaciones, la barrera de filtración mecánica tiene un tamaño de poros que fija un límite para que la albúmina, preferiblemente seroalbúmina (o albúmina sanguínea), entre en el segundo circuito (orina).
En varias otras realizaciones de la presente descripción, la barrera de filtración comprendida por la unidad de filtración es una barrera de filtración biológica. Preferiblemente, la barrera de filtración biológica es una barrera que tiene ranuras de filtración que fijan un límite superior de aproximadamente 69 kDa para que las proteínas del suero entren en el segundo circuito (de orina). En diversas realizaciones, la barrera de filtración biológica comprende podocitos (también denominados células epiteliales viscerales). Más específicamente, la barrera de filtración biológica es una barrera de
podocitos (filtración) que evita que las proteínas del plasma sanguíneo entren en el segundo circuito (orina). La barrera de filtración de podocitos tiene preferiblemente ranuras de filtración que fijan un límite superior de aproximadamente 69 kDa para que las proteínas del suero entren en el segundo circuito (de orina). En varias realizaciones, la barrera de filtración de podocitos tiene un tamaño de poros que fija un límite para que la albúmina, preferiblemente seroalbúmina (o albúmina sanguínea), entre en el segundo circuito (orina).
En fisiología renal, la reabsorción (o reabsorción tubular) es el proceso por el cual la nefrona elimina el agua y los solutos del líquido tubular (preorina) y los devuelve a la sangre circulante. El filtrado glomerular se vuelve más concentrado, que es una de las etapas en la formación de orina. La reabsorción permite que muchos solutos útiles (principalmente glucosa y aminoácidos), sales y agua vuelvan a la circulación sanguínea. Como se describe en el presente documento, la unidad de reabsorción del nuevo dispositivo microfluídico descrito en el presente documento comprende una barrera que permite la reabsorción de fluido desde el segundo circuito (circuito de orina) al primer circuito (circuito de sangre). En varias realizaciones de la presente descripción, la barrera de reabsorción comprendida por la unidad de reabsorción puede ser una barrera mecánica (porosa) que imita la barrera de reabsorción. Preferiblemente, la barrera de reabsorción es una barrera biológica, más preferiblemente la barrera de reabsorción biológica comprende células de los túbulos renales (o células tubulares renales). Más específicamente, la barrera de reabsorción biológica es una barrera de células tubulares renales (reabsorción) que devuelve agua, sal y solutos (estos últimos incluyen proteínas) al primer circuito (circuito de sangre). Como se describe en el presente documento, la reabsorción se puede considerar como el flujo de filtrado glomerular desde la barrera de reabsorción (específicamente desde las células tubulares) hacia el primer circuito (circuito de sangre), permitiendo así el paso selectivo de ciertas sustancias, en particular agua, sal y solutos, de vuelta al primer circuito (circuito de sangre). En varias realizaciones, la célula tubular renal se puede considerar como una célula tubular proximal renal.
El segundo circuito del nuevo dispositivo microfluídico descrito en el presente documento puede comprender un compartimento, que no sirve como un compartimento de cultivo celular, pero que sirve como un compartimento de depósito (medio). Preferiblemente, dicho compartimento de depósito (medio) puede servir exclusivamente como un "depósito de muestreo" o "cámara/compartimento de muestreo" para tomar muestras del segundo circuito, y/o que sirve exclusivamente como un "depósito de muestra" o "cámara/compartimento de muestra" para añadir una muestra de ensayo al segundo circuito del sistema microfluídico. Por consiguiente, en realizaciones preferidas, el segundo circuito no comprende compartimentos de cultivo celular distintos de los dos compartimentos/unidades que forman la unidad de filtración y la unidad de reabsorción, mientras que incluye un compartimento de depósito separado (adicional), que sirve para tomar muestras (compartimento de muestreo) del segundo circuito, y/o que sirve como "depósito de muestra" o "cámara/compartimento de muestra" para añadir una muestra de ensayo al segundo circuito del sistema microfluídico.
El compartimento de depósito se puede usar para añadir una solución de nutrientes al sistema, que es por lo que también se denomina compartimento de depósito de medio. Por consiguiente, el compartimento de depósito puede tener tres funciones, toma de muestras y alimentación y adición de muestras de ensayo, sin embargo, no sirve como un compartimento de cultivo celular que lleva un equivalente de órgano.
El primer circuito del nuevo dispositivo microfluídico descrito en el presente documento comprende un compartimento, que no sirve como un compartimento de cultivo celular, pero que sirve como un compartimento de depósito (medio). Preferiblemente, dicho compartimento de depósito (medio) puede servir exclusivamente para tomar muestras del primer circuito. Además, dicho compartimento de depósito se puede usar para añadir una solución de nutrientes al sistema, que es por lo que se puede denominar compartimento de depósito de medio. Por consiguiente, el compartimento de depósito del primer circuito puede cumplir ambas funciones, muestreo y alimentación, sin embargo, no sirve como un compartimento de cultivo celular que lleva un equivalente de órgano. Por consiguiente, en realizaciones preferidas, el primer circuito puede comprender un compartimento de depósito además del uno o más compartimentos de cultivo celular, que sirve para tomar muestras (compartimento de muestreo) del primer circuito y/o para añadir medio (solución de nutrientes) al sistema.
En realizaciones preferidas de la presente descripción, al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito del nuevo dispositivo microfluídico comprende un tejido que imita la función hepática ("equivalente de hígado").
En otras realizaciones preferidas de la presente descripción, al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito del nuevo dispositivo microfluídico comprende un equivalente de hígado, y al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito comprende un equivalente de intestino. Dicha realización es particularmente útil para lograr el perfil de ADME porque entonces el chip microfluídico comprende equivalentes de órganos de intestino e hígado (primer circuito) y riñón (segundo circuito). Como se describe en el presente documento, los equivalentes de órganos de intestino, hígado y riñón se pueden considerar equivalentes de órganos de "ADME". En diversas realizaciones, el nuevo dispositivo microfluídico puede comprender uno o más equivalentes de órganos "no ADME" adicionales, que son diferentes de los equivalentes de órganos de "ADME" de intestino, hígado y riñón. En diversas realizaciones, dichos equivalentes de órganos "no ADME" adicionales incluyen, pero no se limitan a ellos, un equivalente neuronal, un equivalente de piel o un equivalente del aparato respiratorio (preferiblemente equivalente de pulmón).
En otras realizaciones preferidas más de la presente descripción, al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito del nuevo dispositivo microfluídico comprende un equivalente de hígado, y al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito comprende un equivalente de intestino, y al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito comprende un equivalente neuronal, implementando así un chip de ADME-N.
En otras realizaciones preferidas de la presente descripción, al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito del nuevo dispositivo microfluídico comprende un equivalente de hígado, y al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito comprende un equivalente de piel. Dicha realización también es útil para lograr el perfil de ADME porque el chip microfluídico comprende entonces equivalentes de órganos de piel y de hígado (primer circuito) y de riñón (segundo circuito). La administración de una muestra de ensayo (fármaco de ensayo) se realiza entonces a través del equivalente de piel. Dichas realizaciones son particularmente útiles para ensayar cosméticos y/o productos de consumo, incluyendo cremas.
En otras realizaciones preferidas de la presente descripción, al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito del nuevo dispositivo microfluídico comprende un equivalente de hígado, y al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito comprende un equivalente de aparato respiratorio, específicamente un equivalente de pulmón. Dicha realización también es útil para lograr el perfil de ADME porque el chip microfluídico comprende entonces equivalentes de órganos del aparato respiratorio/pulmón y de hígado (primer circuito) y de riñón (segundo circuito). La administración de una muestra de ensayo (fármaco de ensayo) se realiza entonces a través del equivalente de aparato respiratorio/pulmón. Dichas realizaciones son particularmente útiles para el ensayo de sustancias, incluyendo fármacos, destinados a la aplicación a través del aparato respiratorio/pulmón.
En varias otras realizaciones de la presente descripción, al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito del nuevo dispositivo microfluídico comprende un equivalente de hígado, y al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito comprende un equivalente de intestino, y al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito comprende un equivalente de piel.
En varias realizaciones adicionales de la presente descripción, al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito del nuevo dispositivo microfluídico comprende un equivalente de hígado, y al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito comprende un equivalente de intestino, y al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito comprende un equivalente de aparato respiratorio, preferiblemente pulmón.
En otras realizaciones más de la presente descripción, al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito del nuevo dispositivo microfluídico comprende un equivalente de hígado, y al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito comprende un equivalente de intestino, y al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito comprende un equivalente de piel, y al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito comprende un equivalente de aparato respiratorio, preferiblemente pulmón.
En otras realizaciones más de la presente descripción, al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito del nuevo dispositivo microfluídico comprende un equivalente de hígado, y al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito comprende un equivalente de intestino, y al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito comprende un equivalente de piel, y al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito comprende un equivalente de aparato respiratorio, preferiblemente pulmón, y al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito comprende un equivalente neuronal.
En varias realizaciones de la presente descripción, al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito del nuevo dispositivo microfluídico comprende un equivalente de hígado, y al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito comprende un equivalente de intestino, al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito comprende un equivalente neuronal, y al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito comprende un equivalente de piel.
En varias realizaciones de la presente descripción, al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito del nuevo dispositivo microfluídico comprende un equivalente de hígado, y al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito comprende un equivalente de intestino, al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito comprende un equivalente neuronal, y al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito comprende un equivalente de aparato respiratorio, preferiblemente pulmón.
Los equivalentes de órganos preferidos incluyen equivalente de riñón, equivalente de hígado, equivalente de intestino, preferiblemente equivalente de intestino delgado, equivalente neuronal (cerebro), equivalente de aparato respiratorio/pulmón y equivalente de piel. En caso del equivalente de riñón (o renal), el equivalente significa específicamente un equivalente del glomérulo y el túbulo. Más específicamente, dichos equivalentes de glomérulo y túbulo están dispuestos en unidades separadas (unidad de filtración y unidad de reabsorción, respectivamente) del
segundo circuito del nuevo dispositivo microfluídico proporcionado en el presente documento.
Como se describe en el presente documento, un "compartimento de cultivo celular" comprende o contiene un equivalente de órgano, que abarca células y tejidos que imitan la función del órgano. Por tanto, en diversas realizaciones, las expresiones "equivalente de órgano" y "células/tejido que imitan la función de órgano" se pueden usar indistintamente en el presente documento.
En diversas realizaciones, un equivalente de órgano o un tejido que imita la función de un órgano es un tejido primario de órgano, p. ej., un tejido primario de hígado o un tejido primario de intestino. Preferiblemente, el tejido primario de órgano comprende células epiteliales del órgano respectivo, es decir, células epiteliales de, p.ej., el tubo gastrointestinal, la piel o el aparato respiratorio.
En varias realizaciones, un tejido que imita la función de un órgano puede ser un tejido que comprende células epiteliales del órgano respectivo, es decir, células epiteliales de, p.ej., el tubo gastrointestinal, la piel o el aparato respiratorio. En varias otras realizaciones, un tejido que imita la función de un órgano puede ser un tejido que comprende células de una línea celular, incluyendo células que se pueden obtener a partir de una línea celular disponible en el mercado.
En varias otras realizaciones, un tejido que imita la función de un órgano es un tejido que comprende células derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Específicamente, las células pueden derivar (es decir, diferenciarse) de una sola (es decir, uno y el mismo) iPSC donadora, que a su vez se ha obtenido (es decir, reprogramado) de un solo tipo de célula somática. Por ejemplo, las células pueden derivar (es decir, diferenciarse) de una sola (es decir, una y la misma) iPSC, que se ha obtenido (es decir, reprogramado) a partir de, p.ej., una célula somática de la piel, glóbulo blanco, célula renal, adipocitos o similares.
Como se describe en otra parte del presente documento, las células o tejidos que imitan la función de órganos incluyen organoides y esferoides. Por lo tanto, en diversas realizaciones, un equivalente de órgano significa específicamente un organoide o esferoide de una determinada función de órgano, p.ej., un organoide de células intestinales o hepatocitos, o un esferoide de células intestinales o hepatocitos.
Las células, tejidos y/u órganos del dispositivo microfluídico proporcionado por la presente descripción se pueden modelar en una complejidad bidimensional (2D), tridimensional (3D) u organotípica. 2D significa suspensión de cultivos de células monocapa, mientras que 3D incluye, p.ej., cultivos multicapa de diferente geometría, que incluye, p.ej., organoides y esferoides. Organotípico difiere de 3D por capturar características adicionales de la arquitectura de órganos in vivo.
En diversas realizaciones, un compartimento de cultivo celular que comprende un equivalente de órgano es un compartimento de cultivo celular que comprende un organoide. Como se describe en el presente documento, se puede considerar que el término "organoide" significa o representa la unidad de órgano o tejido funcional más pequeño. Se ha publicado una selección de histologías organoides, todas con funcionalidad relevante y geometría de conglomerado altamente variable, para 15 órganos humanos clave por Marx et al. (Marx et al. 2012, Altern Lab Anim 40, 235-257).
Como se describe adicionalmente en el presente documento, un organoide de acuerdo con la presente descripción significa específicamente un organoide de células derivadas de iPSC, sin embargo, sin estar limitado a ello. Como se describe además en el presente documento, un organoide se puede considerar como un cultivo de células/tejidos, que imita la función de un órgano. Como se describe además en el presente documento, un organoide se puede caracterizar típicamente por cualquiera de las siguientes características, sin estar limitado a ellas: (i) (al menos) construcción o estructura multicelular tridimensional; (ii) colección de tipos de células específicas de órganos; (iii) si se genera a partir de células madre (preferiblemente iPSC), generalmente recapitula el programa de organogénesis del desarrollo; (iv) autoorganización (capacidad de las células para autoensamblarse o autoorganizarse en tejidos).
En diversas realizaciones, los organoides se insertan en una matriz extracelular, preferiblemente en una matriz de gel extracelular, más preferiblemente en un extracto de matriz extracelular similar a una membrana basal (que típicamente se parece al entorno extracelular de tejido). En diversas realizaciones, el extracto de matriz (gel) extracelular similar a la membrana basal comprende una mezcla de proteínas gelatinosas. Preferiblemente, la mezcla de proteínas gelatinosas es una mezcla de proteínas gelatinosas secretadas por células de sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Más preferiblemente, la matriz (gel) extracelular similar a la membrana basal es la matriz de la membrana basal Matrigel® (Corning). En varias realizaciones de la presente descripción, la matriz (gel) extracelular es un hidrogel. En varias realizaciones de la presente descripción, la matriz (gel) extracelular es un colágeno, agarosa, aginato o hidrogel Matrigel®. En varias realizaciones adicionales, el hidrogel es un hidrogel sintético.
En diversas realizaciones, un compartimento de cultivo celular que comprende un equivalente de órgano es un compartimento de cultivo celular que comprende esferoides que imitan la función de órgano. Como se describe en el presente documento, un esferoide de acuerdo con la presente descripción significa específicamente un esferoide de células derivadas de iPSC, sin embargo, sin estar limitado a ello. Como se describe además en el presente documento, un esferoide se puede considerar como una agregación o autoensamblaje de células (grupos esféricos de), que se parecen mucho a tejidos de órganos in vivo. Un esferoide tiene, como un organoide, una arquitectura estructural tridimensional. En comparación con los organoides, se considera que existe un orden superior de autoensamblaje en
los organoides en comparación con los cultivos de esferoides. En varias realizaciones, un organoide se puede considerar como un cultivo de células/tejidos que imita la función de órgano.
Los organoides preferidos incluyen organoide de riñón, organoide de hígado, organoide de intestino, preferiblemente organoide de intestino delgado, organoide neuronal (cerebro), organoide de aparato respiratorio/pulmón y organoide de piel. En el caso de un organoide de riñón (o renal), el organoide significa específicamente un organoide del glomérulo y el túbulo. Más específicamente, dichos organoides de glomérulo y túbulo están dispuestos en unidades separadas (unidad de filtración y unidad de reabsorción, respectivamente) del segundo circuito del nuevo dispositivo microfluídico proporcionado en el presente documento.
En diversas realizaciones, la unidad de filtración y la unidad de reabsorción del segundo circuito se pueden considerar como equivalente de riñón o renal. Preferiblemente, el equivalente de riñón o renal significa un organoide de riñón o renal. Como se describe en el presente documento, un organoide de riñón o renal significa preferiblemente organoides de podocitos y células tubulares renales, más preferiblemente organoides de podocitos derivados de iPSC y células tubulares renales derivadas de iPSC. Asimismo, un organoide de hígado significa preferiblemente un organoide de hepatocitos, más preferiblemente organoides de hepatocitos derivados de iPSC. Asimismo, un organoide de intestino (delgado) significa preferiblemente un organoide de células intestinales (delgado), más preferiblemente un organoide de células del intestino (delgado) derivadas de iPSC. Asimismo, un organoide neuronal preferiblemente significa un organoide de células neuronales, más preferiblemente un organoide de células neuronales derivadas de iPSC. Asimismo, organoide del aparato respiratorio (preferiblemente pulmón) significa preferiblemente un organoide de células del aparato respiratorio, preferiblemente células pulmonares, más preferiblemente células epiteliales pulmonares. Preferiblemente, las células del aparato respiratorio o las células pulmonares son células derivadas de iPSC del aparato respiratorio o células pulmonares derivadas de iPSC, respectivamente.
En varias realizaciones de la presente descripción, el nuevo dispositivo microfluídico tiene una disposición de compartimentos de cultivo celular de acuerdo con el esquema mostrado en la Fig. 1, sin embargo, sin estar limitado a la misma. Por consiguiente, en varias realizaciones preferidas, los compartimentos de cultivo celular que comprenden el equivalente de intestino y el equivalente de hígado están dispuestos de tal manera que el último ("equivalente de hígado") se encuentra aguas abajo del primero ("equivalente de intestino") (de acuerdo con el esquema para el "circuito de sangre" representado en la Fig. 1, sin embargo, sin estar limitado al mismo). Preferiblemente, los compartimentos de cultivo celular que comprenden el "equivalente de hígado" y el "equivalente de intestino" están dispuestos en un microcanal separado, que es una rama de la estructura de microcanales principales (de acuerdo con el esquema del "circuito de sangre" representado en la Fig. 1, sin embargo, sin estar limitado al mismo). Preferiblemente, no hay otros compartimentos de cultivo celular ubicados entre los compartimentos de cultivo celular del equivalente de intestino y el equivalente de hígado. En varias realizaciones, el primer y segundo circuito pueden comprender una red microfluídica ramificada (o una red ramificada de canales microfluídicos). En realizaciones preferidas adicionales, el nuevo dispositivo microfluídico tiene una disposición de compartimentos de cultivo celular de modo que se dispone un compartimento de cultivo celular separado, además de los compartimentos de cultivo celular que comprenden el "equivalente de hígado" y el "equivalente de intestino" y que comprende un equivalente de órgano adicional diferente del "equivalente de hígado" y el "equivalente de intestino", en paralelo a los compartimentos de cultivo celular que comprenden el "equivalente de hígado" y el "equivalente de intestino". Más preferiblemente, dicho compartimento de cultivo celular adicional está dispuesto en una rama de microcanal separada dispuesta en paralelo a la rama de microcanal que comprende los compartimentos de cultivo celular que comprenden el "equivalente de hígado" y el "equivalente de intestino" (de acuerdo con el esquema para el "circuito de sangre" representado en la Fig. 1, sin embargo, sin estar limitado al mismo). Preferiblemente, el compartimento de cultivo celular adicional que comprende un equivalente de órgano adicional diferente del "equivalente de hígado" y el "equivalente de intestino" comprende un equivalente neuronal.
En caso de que el dispositivo microfluídico contenga un depósito de medio o un depósito de muestreo separado, este está dispuesto preferiblemente en la estructura principal de microcanales, es decir, no está dispuesto en una estructura de microcanal ramificado (de acuerdo con el esquema del "circuito de sangre" representado en la Fig. 1, sin embargo, sin estar limitado al mismo).
Además, en caso de que el dispositivo microfluídico contenga una microbomba, la microbomba está dispuesta preferiblemente en la estructura del microcanal principal, es decir, no está dispuesta en una estructura de microcanal ramificado (de acuerdo con el diseño del "circuito de sangre" representado en la figura 1, sin embargo, sin estar limitado al mismo).
En varias realizaciones preferidas, el segundo circuito no muestra una red ramificada, sino que es más bien un circuito o sistema de circulación no ramificado. Los términos "circuito" y "sistema de circulación" se pueden usar indistintamente en el presente documento.
El nuevo sistema microfisiológico preferiblemente es un sistema de canales cerrados. Por consiguiente, el primer y segundo circuito del nuevo dispositivo microfluídico forman un circuito cerrado, más específicamente un circuito cerrado de canales microfluídicos. Más específicamente, el nuevo sistema microfisiológico se puede considerar como un sistema microfisiológico autosostenido o autónomo. El sistema de canales cerrado que incluye las dos unidades funcionales renales (unidad de filtración y unidad de reabsorción) permite analizar específicamente la toxicidad renal
de fármacos de ensayo. En realizaciones preferidas, el sistema microfisiológico o dispositivo microfluídico funciona con una solución líquida que imita la sangre y/o una solución líquida que imita la orina en el segundo circuito.
En varios aspectos de la presente descripción, al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito del nuevo dispositivo microfluídico comprende un equivalente de hígado derivado de iPSC, y al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito comprende un equivalente de intestino derivado de iPSC, y al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito comprende un equivalente neuronal derivado de iPSC, y el segundo circuito del nuevo dispositivo microfluídico comprende células epiteliales del túbulo proximal renal (RPTEC), más específicamente RPTEC sembradas en el unidad de reabsorción. Preferiblemente, el al menos un compartimento de cultivo celular que comprende un equivalente de intestino derivado de iPSC comprende organoides de células intestinales derivadas de iPSC. Más preferiblemente, los organoides de las células intestinales derivadas de iPSC se insertan en una matriz extracelular, preferiblemente en una matriz de gel extracelular, más preferiblemente en un extracto de matriz (gel) extracelular similar a la membrana basal (que típicamente se parece al entorno extracelular de tejido). En varias realizaciones, el extracto de matriz (gel) extracelular similar a la membrana basal comprende una mezcla de proteínas gelatinosas. Preferiblemente, la matriz extracelular similar a la membrana basal es la matriz de membrana basal Matrigel® (Corning).
En realizaciones preferidas adicionales, el al menos un compartimento de cultivo celular que comprende un equivalente de intestino derivado de iPSC, específicamente organoides de células intestinales derivadas de iPSC, comprende además fibroblastos y células endoteliales, más preferiblemente fibroblastos derivados de iPSC y células endoteliales derivadas de iPSC, o fibroblastos derivados de iPSC y células endoteliales microvasculares primarias. Las células endoteliales microvasculares primarias o las células endoteliales derivadas de iPSC se siembran preferiblemente en el lado basolateral del compartimento de cultivo celular.
Además, el al menos un compartimento de cultivo celular que comprende un equivalente neuronal derivado de iPSC comprende preferiblemente esferoides neuronales derivados de iPSC. Más preferiblemente, el al menos un compartimento de cultivo celular que comprende un equivalente neuronal derivado de iPSC, específicamente esferoides neuronales derivados de iPSC, comprende una barrera hematoencefálica bioimpresa. Más específicamente, el al menos un compartimento de cultivo celular que comprende un equivalente neuronal derivado de iPSC, específicamente esferoides neuronales derivados de iPSC, está enriquecido con células endoteliales, preferiblemente células endoteliales derivadas de iPSC, bioimpresas bajo los esferoides neuronales.
Además, el al menos un compartimento de cultivo celular que comprende un equivalente de hígado derivado de iPSC comprende preferiblemente esferoides de hepatocitos derivados de iPSC. Más preferiblemente, el al menos un compartimento de cultivo celular que comprende un equivalente de hígado derivado de iPSC, específicamente esferoides de hepatocitos derivados de iPSC, comprende además fibroblastos, preferiblemente fibroblastos derivados de iPSC. En realizaciones preferidas, el equivalente de hígado derivado de iPSC se logra poniendo esferoides de hepatocitos derivados de iPSC con fibroblastos derivados de iPSC en el respectivo compartimento de cultivo celular.
En varias realizaciones, las RPTEC comprenden una línea celular epitelial del túbulo proximal renal.
En varios aspectos de la presente descripción, al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito del nuevo dispositivo microfluídico comprende tejido hepático primario, y al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito comprende un tejido primario de intestino, preferiblemente un tejido primario de intestino delgado, y al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito comprende un equivalente neuronal derivado de iPSC, y el segundo circuito del nuevo dispositivo microfluídico comprende células epiteliales del túbulo proximal renal (RPTEC), más específicamente RPTEC sembradas en la unidad de reabsorción. En varias realizaciones, el tejido hepático primario comprende hepatocitos primarios (humanos). El tejido hepático primario puede ser un modelo de hígado disponible en el mercado, p.ej., Microtissues XL de hígado humano 3D InSight™, InSphero. En diversas realizaciones, el tejido hepático primario o el modelo de hígado puede comprender 50 esferoides, cada uno de los cuales contiene 3.000 hepatocitos primarios. Además, en realizaciones preferidas, el tejido del intestino primario comprende células epiteliales y endoteliales de intestino derivadas de células primarias (humanas), y más preferiblemente comprende además fibroblastos (humanos). El tejido primario de intestino puede ser un modelo de intestino disponible en el mercado, p.ej., el modelo de tejido 3D Epilntestinal® (MatTek Corporation).
Además, el al menos un compartimento de cultivo celular que comprende un equivalente neuronal derivado de iPSC comprende preferiblemente esferoides neuronales derivados de iPSC. Más preferiblemente, el al menos un compartimento de cultivo celular que comprende un equivalente neuronal derivado de iPSC, específicamente esferoides neuronales derivados de iPSC, comprende una barrera hematoencefálica bioimpresa. Más específicamente, el al menos un compartimento de cultivo celular que comprende un equivalente neuronal derivado de iPSC, específicamente esferoides neuronales derivados de iPSC, está enriquecido con células endoteliales, preferiblemente células endoteliales derivadas de iPSC, que están bioimpresas bajo los esferoides neuronales.
En varias realizaciones, las RPTEC comprenden una línea de células epiteliales del túbulo proximal renal.
En varios aspectos de la presente descripción, al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito del nuevo dispositivo microfluídico comprende un equivalente de hígado derivado de iPSC, y al menos uno de
los compartimentos de cultivo celular del primer circuito comprende un equivalente de intestino derivado de iPSC, y al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito comprende un equivalente neuronal derivado de iPSC, y el segundo circuito del nuevo dispositivo microfluídico comprende un equivalente renal derivado de iPSC. Preferiblemente, el al menos un compartimento de cultivo celular que comprende un equivalente de intestino derivado de iPSC comprende organoides de células intestinales derivadas de iPSC. Más preferiblemente, los organoides de las células intestinales derivadas de iPSC se insertan en una matriz extracelular, preferiblemente en una matriz de gel extracelular, más preferiblemente en un extracto de matriz (gel) extracelular similar a la membrana basal (que típicamente se parece al entorno extracelular del tejido). En varias realizaciones, el extracto de matriz (gel) extracelular similar a la membrana basal comprende una mezcla de proteínas gelatinosas. Preferiblemente, la matriz extracelular similar a la membrana basal es la matriz de membrana basal Matrigel® (Corning).
En realizaciones preferidas adicionales, el al menos un compartimento de cultivo celular que comprende un equivalente de intestino derivado de iPSC, específicamente organoides de células intestinales derivadas de iPSC, comprende además fibroblastos y células endoteliales, más preferiblemente fibroblastos derivados de iPSC y células endoteliales derivadas de iPSC, o fibroblastos derivados de iPSC y células endoteliales microvasculares primarias. Las células endoteliales microvasculares primarias o las células endoteliales derivadas de iPSC se siembran preferiblemente en el lado basolateral del compartimento de cultivo celular.
Además, el al menos un compartimento de cultivo celular que comprende un equivalente neuronal derivado de iPSC comprende preferiblemente esferoides neuronales derivados de iPSC. Más preferiblemente, el al menos un compartimento de cultivo celular que comprende un equivalente neuronal derivado de iPSC, específicamente esferoides neuronales derivados de iPSC, comprende una barrera hematoencefálica bioimpresa. Más específicamente, el al menos un compartimento de cultivo celular que comprende un equivalente neuronal derivado de iPSC, específicamente esferoides neuronales derivados de iPSC, está enriquecido con células endoteliales, preferiblemente células endoteliales derivadas de iPSC, sembradas en el lado basolateral del compartimento de cultivo celular.
Además, el al menos un compartimento de cultivo celular que comprende un equivalente de hígado derivado de iPSC comprende preferiblemente esferoides de hepatocitos derivados de iPSC. Más preferiblemente, el al menos un compartimento de cultivo celular que comprende un equivalente de hígado derivado de iPSC, específicamente esferoides de hepatocitos derivados de iPSC, comprende además fibroblastos, preferiblemente fibroblastos derivados de iPSC. En realizaciones preferidas, el equivalente de hígado derivado de iPSC se logra poniendo esferoides de hepatocitos derivados de iPSC con fibroblastos derivados de iPSC en el respectivo compartimento de cultivo celular.
En varios aspectos de la presente descripción, al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito del nuevo dispositivo microfluídico comprende tejido hepático primario, y al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito comprende un tejido primario de intestino, preferiblemente un tejido primario de intestino delgado, y al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito comprende un tejido neuronal primario, y el segundo circuito del nuevo dispositivo microfluídico comprende un tejido renal primario, preferiblemente un tejido renal primario en la unidad de reabsorción, más preferiblemente un tejido tubular primario (célula epitelial) en la unidad de reabsorción y un tejido glomerular primario en la unidad de filtración. Preferiblemente, el tejido renal primario comprende células epiteliales renales, más específicamente células epiteliales del túbulo proximal renal (RPTEC), en donde las células epiteliales renales o RPTEC se pueden sembrar en la unidad de reabsorción, y el tejido glomerular primario comprende podocitos, que se pueden sembrar en la unidad de filtración. En varias realizaciones, el tejido hepático primario comprende hepatocitos primarios (humanos). El tejido hepático primario puede ser un modelo de hígado disponible en el mercado, por ejemplo, el Microtissues XL de hígado humano 3D InSight™, InSphero. Además, en realizaciones preferidas, el tejido de intestino primario comprende células epiteliales y endoteliales de intestino derivadas de células primarias (humanas), y más preferiblemente comprende además fibroblastos (humanos). El tejido de intestino primario puede ser un modelo de intestino disponible en el mercado, por ejemplo, el modelo de tejido 3D Epilntestinal® (MatTek Corporation).
Además, el tejido neuronal primario comprende preferiblemente células neuronales primarias. En otras realizaciones preferidas más, el al menos un compartimento de cultivo celular que comprende el tejido neuronal primario, específicamente células neuronales primarias, comprende además una barrera hematoencefálica bioimpresa. Más específicamente, el al menos un compartimento de cultivo celular que comprende el tejido neuronal primario, específicamente células neuronales primarias, está enriquecido con células endoteliales, que se pueden sembrar en el lado basolateral del compartimento de cultivo celular o se bioimprimen debajo de los esferoides neuronales.
En varios aspectos de la presente descripción, al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito del nuevo dispositivo microfluídico comprende un organoide de hígado, y al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito comprende un organoide de intestino, preferiblemente un organoide de intestino delgado, y el segundo circuito del nuevo dispositivo microfluídico comprende un organoide renal en la unidad de reabsorción y/o la unidad de filtración. En diversas realizaciones, al menos un compartimento de cultivo celular adicional del primer circuito comprende además un organoide adicional, que es diferente del organoide de hígado, el organoide de intestino (incluyendo el organoide de intestino delgado) y el organoide renal. Dicho organoide adicional se puede considerar como un organoide "no ADME", mientras que el organoide de hígado, el organoide de intestino (incluyendo el organoide de intestino delgado) y el organoide renal se pueden considerar como organoides "ADME".
En diversas realizaciones, dicho organoide adicional (no ADME) puede ser cualquiera de un organoide neuronal, un organoide de piel o un organoide de aparato respiratorio (preferiblemente pulmón). En varias realizaciones, al menos dos compartimentos de cultivo celular adicionales del primer circuito comprenden además dos organoides "no ADME" adicionales (un organoide por compartimento de cultivo celular adicional), que son diferentes del organoide de hígado, el organoide de intestino (incluyendo el organoide de intestino delgado) y el organoide renal. En diversas realizaciones, los dos organoides adicionales (no ADME) se pueden seleccionar de cualquiera de un organoide neuronal, un organoide de piel y/o un organoide de aparato respiratorio (preferiblemente pulmón). En otras realizaciones más, al menos tres compartimentos de cultivo celular adicionales del primer circuito comprenden además tres organoides "no ADME" adicionales (un organoide por compartimento de cultivo celular adicional). En diversas realizaciones, los tres organoides "no ADME" adicionales son un organoide neuronal, un organoide de piel y/o un organoide de aparato respiratorio (preferiblemente pulmón). Preferiblemente, los organoides son organoides de células de órganos derivadas de iPSC. Específicamente, el organoide de hígado es preferiblemente un organoide de hepatocitos derivados de iPSC, y el organoide de intestino preferiblemente es un organoide de células intestinales derivadas de iPSC, más preferiblemente un organoide de células del intestino delgado derivadas de iPSC, y el organoide neuronal preferiblemente es un organoide de células neuronales derivadas de iPSC, y el organoide renal preferiblemente es un organoide de células renales derivadas de iPSC.
En varios aspectos de la presente descripción, al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito del nuevo dispositivo microfluídico comprende un esferoide de hígado, y al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito comprende un esferoide de intestino, preferiblemente un organoide de intestino delgado, y el segundo circuito del nuevo dispositivo microfluídico comprende un esferoide renal en la unidad de reabsorción y/o la unidad de filtración. En diversas realizaciones, al menos un compartimento de cultivo adicional del primer circuito comprende además un esferoide adicional que es diferente del esferoide de hígado, el esferoide de intestino (incluyendo el esferoide de intestino delgado) y el esferoide renal. Dicho esferoide adicional se puede considerar como esferoide "no ADME", mientras que el esferoide de hígado, el esferoide de intestino (incluyendo el esferoide de intestino delgado) y el esferoide renal se pueden considerar esferoides de "ADME". En varias realizaciones, dicho esferoide adicional (no ADME) puede ser cualquiera de un esferoide neuronal, un esferoide de piel y/o un esferoide de aparato respiratorio (preferiblemente pulmón). En diversas realizaciones, al menos dos compartimentos de cultivo celular adicionales del primer circuito comprenden además dos esferoides "no ADME" adicionales (un esferoide por compartimento de cultivo celular adicional), que son diferentes del esferoide de hígado, el esferoide de intestino (incluyendo el esferoide de intestino delgado) y el esferoide renal. En varias realizaciones, los dos esferoides adicionales (no ADME) se pueden seleccionar de cualquiera de un esferoide neuronal, un esferoide de piel y/o un esferoide de aparato respiratorio (preferiblemente pulmón). En otras realizaciones más, al menos tres compartimentos de cultivo celular adicionales del primer circuito comprenden además tres esferoides "no ADME" adicionales (un esferoide por compartimento de cultivo celular adicional). En diversas realizaciones, los tres esferoides "no ADME" adicionales son un esferoide neuronal, un esferoide de piel y/o un esferoide de aparato respiratorio (preferiblemente pulmón). Preferiblemente, los esferoides son esferoides de células de órganos derivadas de iPSC. Específicamente, el esferoide de hígado es preferiblemente un esferoide de hepatocitos derivados de iPSC, y el esferoide de intestino preferiblemente es un esferoide de células intestinales derivadas de iPSC, más preferiblemente un esferoide de células de intestino delgado derivadas de iPSC, y el esferoide neuronal preferiblemente es un esferoide de células neuronales derivadas de iPSC, y el esferoide renal preferiblemente es un esferoide de células renales derivadas de iPSC.
En varias realizaciones, un compartimento de cultivo celular puede comprender uno o más equivalentes de órganos, p.ej., un equivalente neuronal junto con o en combinación con un equivalente intestinal. En varias otras realizaciones, cada compartimento de cultivo celular (o un solo compartimento de cultivo celular) puede comprender sólo un equivalente de órgano, siguiendo el principio de un equivalente de órgano individual por compartimento de cultivo celular. Por otro lado, si, por ejemplo, al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del primer circuito del nuevo dispositivo microfluídico comprende un equivalente de hígado, esto significa que podría haber dos compartimentos de cultivo celular del primer circuito que comprendan cada uno un equivalente de hígado. Sin embargo, en realizaciones preferidas, el nuevo dispositivo microfluídico comprende cada equivalente de órgano solo una vez, siguiendo el principio de un equivalente de órgano individual por dispositivo microfluídico (o por sistema microfisiológico).
La presente descripción proporciona el uso de un dispositivo microfluídico novedoso descrito en el presente documento en pruebas analíticas, diagnósticos, investigación, validación de objetivos, estudios de toxicidad, ingeniería de tejidos, fabricación de tejidos, cribado de fármacos y/o análisis farmacocinético-farmacodinámico.
La presente descripción permite el funcionamiento de un sistema microfisiológico y establece el denominado perfil ADME basado en el nuevo dispositivo microfluídico proporcionado en el presente documento. Por consiguiente, la presente descripción proporciona un método para el funcionamiento de un sistema microfluídico haciendo uso de los nuevos dispositivos microfluídicos descritos en el presente documento, y además proporciona un ensayo de ADME (absorción, distribución, metabolismo, excreción) que comprende los nuevos dispositivos microfluídicos proporcionados por la presente descripción. En el presente documento se describe además un ensayo de ADMET (absorción, distribución, metabolismo, excreción, toxicidad) que comprende los nuevos dispositivos microfluídicos descritos en el presente documento.
Específicamente en el procedimiento de descubrimiento de fármacos, el perfil (o cribado) de ADME in vitro proporciona una base para seleccionar nuevas entidades moleculares y compuestos candidatos que tienen un metabolismo de fármaco, farmacocinética o perfiles de seguridad deseables, que son necesarios para la selección de candidatos a fármacos y el desarrollo clínico y preclínico en fase tardía. El perfil (o propiedades) de ADME(T) de un fármaco (sustancia de ensayo) permite al desarrollador del fármaco comprender los datos de seguridad y eficacia necesarios para la aprobación regulatoria.
En el método de funcionamiento de un sistema microfisiológico, el tiempo de cultivo puede durar semanas o incluso meses, permitiendo el modelado de enfermedades y la exposición a sustancias en dosis repetidas.
La presente descripción proporciona un método para realizar un perfil de ADME (absorción, distribución, metabolismo, excreción) haciendo uso del nuevo dispositivo microfluídico proporcionado por la presente descripción. La presente descripción también proporciona un método para realizar un perfil de ADMET (absorción, distribución, metabolismo, excreción, toxicidad) haciendo uso del nuevo dispositivo microfluídico descrito en el presente documento. Se describe además en el presente documento un método para generar un perfil de ADME, o un perfil de ADMET de un fármaco (de ensayo) que comprende realizar un cribado de ADME o un cribado de ADMET, respectivamente, usando el nuevo dispositivo microfluídico proporcionado por la presente descripción.
El método de funcionamiento de un sistema microfisiológico como se describe en el presente documento preferiblemente comprende añadir selectivamente una solución de nutrientes al sistema microfisiológico a través del compartimento de cultivo celular que comprende el equivalente de tubo gastrointestinal, preferiblemente el equivalente de intestino, más preferiblemente el equivalente de intestino delgado. El equivalente de órgano comprende preferiblemente tejido que comprende células epiteliales del tubo gastrointestinal, preferiblemente de intestino, incluso más preferiblemente del intestino delgado. Con el fin de reflejar las condiciones fisiológicas in vivo, la presente descripción preferiblemente hace funcionar el sistema microfisiológico añadiendo selectivamente la solución de nutrientes al sistema microfisiológico a través del compartimento de cultivo celular que comprende el equivalente de tubo gastrointestinal, preferiblemente el equivalente de intestino, más preferiblemente el equivalente de intestino delgado.
En varias realizaciones, se añade selectivamente una solución de nutrientes al sistema microfisiológico a través del compartimento de cultivo celular que comprende el equivalente de piel y/o el equivalente de aparato respiratorio, más específicamente el equivalente de pulmón.
Como se describe en el presente documento, una solución de nutrientes comprende específicamente sustancias (nutrientes) que son esenciales para que las células o el cuerpo crezcan o se recuperen (que incluyen aminoácidos, sales (electrolitos) y glucosa) y calorías en forma de carbohidratos. Específicamente, una solución de nutrientes como se describe en el presente documento es una solución de nutrientes para la proliferación celular. Como se describe en el presente documento, las expresiones "solución de nutrientes" y "medio de cultivo celular" se pueden usar indistintamente en el presente documento.
Se ha descubierto sorprendentemente que los nuevos chips microfluídicos proporcionados en el presente documento pueden implementar la homeostasis en el sistema microfisiológico. Esto se mostró por los niveles constantes de glucosa y LDH (Fig. 3). Una concentración de glucosa constante sugiere un consumo constante y una regulación activa de la glucosa disponible. Los niveles de glucosa han alcanzado niveles iguales en todos los compartimentos. Además, se ha descubierto sorprendentemente que la alimentación selectiva a través del equivalente de intestino (de forma apical a través del equivalente de intestino) era suficiente para suministrar tanto al circuito de "sangre" como al circuito de "orina". Además, la actividad de LDH se ha mostrado bastante constante a lo largo de los experimentos. En comparación con la glucosa, los niveles de LDH son diferentes en cada compartimento. La función de barrera del equivalente de intestino y el equivalente renal se muestra por las diferentes concentraciones de LDH en los tres "compartimentos" (es decir, circuito de sangre -> depósito de medio 1; circuito de orina -> depósito de medio 2; y compartimento de intestino). Las barreras, por tanto, diferencian entre las sustancias que cruzan. La penetración activa o pasiva de la glucosa, mientras que se retienen otras sustancias, indica interacciones prácticas entre subconjuntos del sistema de chips.
Por consiguiente, la presente descripción proporciona un método para imitar la homeostasis que comprende hacer funcionar un sistema microfisiológico que comprende un primer circuito con uno o más compartimentos de cultivo celular y un segundo circuito que comprende una unidad de filtración y una unidad de reabsorción, en donde ambos circuitos están conectados entre sí a través del unidad de filtración y la unidad de reabsorción. De acuerdo con las realizaciones (preferidas) descritas en otra parte en el presente documento con respecto al nuevo dispositivo microfluídico, la unidad de filtración comprendida por el segundo circuito del sistema microfisiológico comprende preferiblemente una barrera de filtración que permite el paso selectivamente de moléculas desde el primer circuito al segundo circuito en función del tamaño y la carga de las moléculas. Más preferiblemente, la barrera de filtración es una barrera biológica, incluso más preferiblemente en donde la barrera biológica comprende podocitos.
También de acuerdo con las realizaciones (preferidas) descritas en otra parte en el presente documento con respecto al nuevo dispositivo microfluídico, la unidad de reabsorción comprendida por el segundo circuito del sistema microfisiológico comprende preferiblemente una barrera que permite la reabsorción de fluido desde el segundo circuito
al primer circuito. Más preferiblemente, la barrera de reabsorción es una barrera biológica, incluso más preferiblemente en donde la barrera biológica comprende células del túbulo renal.
En varias realizaciones del nuevo método de imitación de la homeostasis, se añade selectivamente una solución de nutrientes al sistema microfisiológico a través del compartimento de cultivo celular (del primer circuito) que comprende el equivalente de tubo gastrointestinal, más específicamente el equivalente de intestino, incluso más específicamente el equivalente de intestino delgado. En diversas realizaciones, el equivalente de órgano comprende células epiteliales, o tejido que comprende células epiteliales, del tubo gastrointestinal, preferiblemente del intestino, incluso más preferiblemente del intestino delgado.
Las realizaciones (preferidas) descritas en el presente documento en relación con el nuevo dispositivo microfluídico se aplican igualmente al nuevo método de imitación de la homeostasis que comprende hacer funcionar un sistema microfisiológico como se describe en el presente documento. Por lo tanto, las realizaciones (preferidas) descritas en otra parte en el presente documento en relación con el nuevo dispositivo microfluídico también son realizaciones preferidas en relación con el nuevo método de imitar la homeostasis que comprende hacer funcionar un sistema microfisiológico. Más específicamente, las realizaciones (preferidas) descritas en otra parte en el presente documento en relación con el nuevo dispositivo microfluídico son también realizaciones preferidas del sistema microfisiológico comprendido por el nuevo método de imitación de la homeostasis.
La presente descripción proporciona además un método para detectar un analito en un sistema microfisiológico haciendo uso de un nuevo dispositivo microfluídico descrito en el presente documento, en donde el método comprende añadir una muestra de ensayo en un compartimento de cultivo celular del primer circuito, preferiblemente en donde dicho compartimento de cultivo celular comprende un equivalente de órgano seleccionado de cualquiera de equivalente de tubo gastrointestinal, más específicamente equivalente de intestino, equivalente de piel y/o equivalente de aparato respiratorio, más específicamente equivalente de pulmón. El equivalente de órgano comprende preferiblemente tejido que comprende células epiteliales del tubo gastrointestinal, la piel o el aparato respiratorio. En realizaciones preferidas, se añade una muestra de ensayo a un compartimento de cultivo celular que comprende el equivalente de tubo gastrointestinal, más específicamente el equivalente de intestino. Más preferiblemente, la muestra de ensayo se añade selectivamente al compartimento de cultivo celular que comprende el equivalente de tubo gastrointestinal, específicamente el equivalente de intestino, más específicamente el equivalente de intestino delgado.
En diversas realizaciones, se añade selectivamente una muestra de ensayo al sistema microfisiológico a través del compartimento de cultivo celular que comprende el equivalente de piel y/o el equivalente de aparato respiratorio, más específicamente el equivalente de pulmón.
En varias otras realizaciones, se añade selectivamente una muestra de ensayo al sistema microfisiológico a través de una cavidad diferente de los compartimentos de cultivo celular que comprenden los equivalentes de órganos. Dicha cavidad puede ser el "depósito de medio" del circuito de sangre y/o del circuito de orina. Como se describe en otra parte en el presente documento, dicho "depósito de medio" está destinado a ser un "depósito de muestreo" o "cámara/compartimento de muestreo" que sirve exclusivamente para tomar una muestra o líquido sobrenadante de cultivo del sistema microfluídico, y/o que está destinado a ser un "depósito de muestra" o "cámara/compartimento de muestra" que sirve exclusivamente para añadir una muestra de ensayo al sistema microfluídico.
En diversas realizaciones, la muestra de ensayo es una muestra de ensayo líquida, que se añade preferiblemente al sistema microfisiológico a través del compartimento de cultivo celular que comprende el equivalente de tubo gastrointestinal, específicamente el equivalente de intestino, más específicamente el equivalente de intestino delgado. En varias realizaciones, la muestra de ensayo es un producto cosmético o de consumo, que incluye una crema, que se añade preferiblemente al sistema microfisiológico a través del compartimento de cultivo celular que comprende el equivalente de piel.
El método de detección de un analito según la presente descripción puede comprender tomar una muestra de un "depósito de medio" del circuito de sangre y/o del circuito de orina. Como se describe en otra parte en el presente documento, dicho "depósito de medio" puede estar destinado a ser un "depósito de muestreo" o "cámara/compartimento de muestreo" que sirve para tomar una muestra o líquido sobrenadante de cultivo del sistema microfluídico, y/o que puede estar destinado a ser un "depósito de muestra" o "cámara/compartimento de muestra" que sirve para añadir una muestra de ensayo al sistema microfluídico, pero que no sirve como compartimento de cultivo celular para un equivalente de órgano.
El método de detección de un analito según la presente descripción puede comprender además analizar la muestra tomada del sistema microfluídico a través de una cámara de muestreo para detectar la presencia de metabolitos, preferiblemente metabolitos tóxicos. El método de detección de un analito según la presente descripción permite específicamente detectar metabolitos de fármacos añadidos como muestras de ensayo al sistema microfisiológico.
El método de detección de un analito según la presente descripción puede comprender además detectar un analito en el flujo de fluido del primer circuito y/o el segundo circuito.
En realizaciones preferidas del método de detección de un analito, se añade o se deposita una muestra de ensayo en un compartimento de cultivo celular del primer circuito, que es el mismo o diferente del compartimento de cultivo celular
al que se añade una solución de nutrientes.
También se describe en el presente documento un método de cultivo y/o mantenimiento de células que comprende sembrar un nuevo dispositivo microfluídico descrito en el presente documento con células.
Se describe además también en el presente documento un kit para hacer funcionar un sistema microfisiológico que comprende un nuevo dispositivo microfluídico descrito e instrucciones de uso.
El dispositivo microfluídico proporcionado por la presente descripción puede tener la forma de una placa o un chip. Las placas habitualmente se basan en las dimensiones de la placa de microvaloración y usan flujo microfluídico pasivo basado en la gravedad o bombeo sobre placa. Los chips del tamaño de portaobjetos de microscopio y otros formatos pueden funcionar mediante un flujo microfluídico activo o pasivo, emulando así la tensión de cizalladura a velocidades fisiológicas intracapilares o intersticiales. En caso de un flujo microfluídico activo, se pueden usar microbombas externas o en chip. Preferiblemente, el dispositivo microfluídico proporcionado por la presente descripción está en forma de un chip.
En varias realizaciones del nuevo dispositivo microfluídico o del nuevo sistema microfisiológico descrito en el presente documento, el primer circuito comprende uno o más canales microfluídicos que están revestidos con células endoteliales. Como se describe en otra parte del presente documento, la presente descripción demuestra que la tensión de cizalladura promueve el alargamiento de las células endoteliales derivadas de iPSC en los canales del chip de multiórganos (Fig. 11).
En varias realizaciones, el nuevo dispositivo microfluídico o el nuevo sistema microfisiológico comprende una microbomba, preferiblemente una microbomba peristáltica. En varias realizaciones, uno de los dos circuitos (primer y segundo circuito) puede tener una microbomba (es decir, "microbomba del circuito de sangre" o "microbomba del circuito de orina"). En realizaciones preferidas, cada uno de los dos circuitos (primer y segundo circuito) tiene su propia microbomba (es decir, "microbomba del circuito de sangre" y "microbomba del circuito de orina"). Las microbombas son preferiblemente microbombas "en chip", de acuerdo con la realización preferida de que el nuevo dispositivo microfluídico o el sistema microfisiológico novedoso es un sistema de canales cerrado.
Como se describe en el presente documento, los nuevos métodos proporcionados en el presente documento pueden abarcar una etapa de depositar y/o cultivar un equivalente de órgano, preferiblemente un tejido que comprende células (epiteliales) o células derivadas de iPSC (epiteliales) del órgano respectivo, en un compartimento de cultivo celular del primer circuito.
En varias realizaciones, el equivalente de intestino puede comprender (además) fibroblastos, en particular fibroblastos derivados de iPSC. Preferiblemente, el equivalente de intestino es un equivalente de intestino derivado de iPSC que comprende además fibroblastos, en particular fibroblastos derivados de iPSC. Más preferiblemente, el equivalente de intestino es un equivalente derivado de iPSC formado por una capa de una matriz extracelular, que está cubierta por fibroblastos, en particular fibroblastos derivados de iPSC. La capa de una matriz extracelular es preferiblemente una capa basada en gel de una matriz extracelular. Incluso más preferiblemente, el equivalente de intestino es un organoide de células intestinales derivadas de iPSC. Preferiblemente, el equivalente de intestino es un equivalente derivado de iPSC, preferiblemente un organoide de células intestinales derivadas de iPSC, formado por una capa de un extracto de matriz extracelular similar a la membrana basal (que típicamente se parece al entorno extracelular del tejido), en donde la capa está cubierta por fibroblastos, en particular fibroblastos derivados de iPSC. En varias realizaciones, el extracto de matriz extracelular similar a membrana basal comprende una mezcla de proteínas gelatinosas. Preferiblemente, la matriz extracelular similar a membrana basal es la matriz de membrana basal Matrigel® (Corning).
En varias realizaciones, el equivalente de intestino, que preferiblemente es un organoide de células intestinales derivadas de iPSC, se incorpora o se inserta en la matriz extracelular mencionada anteriormente.
En varias realizaciones, el equivalente de intestino, que preferiblemente es un organoide de células intestinales derivadas de iPSC, comprende una capa (cerrada) de células endoteliales, que incluye células endoteliales primarias microvasculares o derivadas de iPSC (se prefieren estas últimas), en el lado basolateral del compartimento de cultivo celular. En diversas realizaciones, el equivalente de intestino, que preferiblemente es un organoide de células intestinales derivadas de iPSC, comprende una capa (cerrada) de células endoteliales derivadas de iPSC en el lado basolateral del compartimento de cultivo celular.
En varias realizaciones, el equivalente de intestino puede comprender (además) fibroblastos y células endoteliales, en particular fibroblastos derivados de iPSC y células endoteliales derivadas de iPSC, como se ha descrito antes. Por consiguiente, en diversas realizaciones, el equivalente de intestino es un equivalente de intestino derivado de iPSC formado por una capa de una matriz extracelular, que está cubierta por fibroblastos, en particular fibroblastos derivados de iPSC, y en donde el equivalente de intestino comprende además otra capa de células endoteliales, preferiblemente células endoteliales microvasculares primarias, en el lado basolateral del compartimento de cultivo celular. Alternativamente, en varias realizaciones, el equivalente de intestino es un equivalente de intestino derivado de iPSC formado por una capa de una matriz extracelular, que está cubierta por fibroblastos, en particular fibroblastos derivados de iPSC, y en donde el equivalente de intestino comprende además otra capa de células endoteliales derivadas de
iPSC en el lado basolateral del compartimento de cultivo celular.
En varias realizaciones, el equivalente de intestino se incorpora o se inserta en la matriz extracelular mencionada anteriormente.
Además, como se ha descrito antes, el equivalente de intestino derivado de iPSC preferiblemente es un organoide de células intestinales derivadas de iPSC. Además, la capa de la matriz extracelular es preferiblemente una capa basada en gel de una matriz extracelular, más preferiblemente una capa de un extracto de matriz extracelular similar a membrana basal (que típicamente se parece al entorno extracelular del tejido). El extracto de matriz extracelular similar a membrana basal puede comprender una mezcla de proteínas gelatinosas. Preferiblemente, la matriz extracelular similar a membrana basal es la matriz de membrana basal Matrigel® (Corning).
En varias realizaciones, el equivalente neuronal puede comprender (además) células endoteliales, en particular células endoteliales derivadas de iPSC. Preferiblemente, el equivalente neuronal es un equivalente derivado de iPSC que comprende además células endoteliales, en particular células endoteliales derivadas de iPSC. Más preferiblemente, las células endoteliales, en particular las células endoteliales derivadas de iPSC, están presentes en el lado basolateral del equivalente neuronal del compartimento de cultivo celular que comprende el equivalente neuronal. Alternativamente, el equivalente neuronal es un equivalente neuronal derivado de iPSC que comprende además células endoteliales derivadas de iPSC bioimpresas (y por lo tanto presentes) bajo el equivalente neuronal. Preferiblemente, el equivalente neuronal derivado de iPSC comprende esferoides u organoides de células neuronales derivadas de iPSC, y las células endoteliales derivadas de iPSC se bioimprimen (y por lo tanto están presentes) bajo el esferoide u organoide neuronal de células neuronales derivadas de iPSC. Preferiblemente, el equivalente neuronal derivado de iPSC comprende esferoides u organoides de células neuronales derivadas de iPSC, que se incorporan o se insertan en una capa de una matriz extracelular. Preferiblemente, las células endoteliales derivadas de iPSC están bioimpresas (y por lo tanto presentes) en la matriz extracelular debajo (basolateral) de los esferoides neuronales u organoides de células neuronales derivadas de iPSC. Como se ha descrito antes, la matriz extracelular es preferiblemente una matriz de gel extracelular, más preferiblemente un extracto de matriz extracelular similar a membrana basal (que típicamente se parece al entorno extracelular del tejido). El extracto de matriz extracelular similar a membrana basal puede comprender una mezcla de proteínas gelatinosas. Preferiblemente, la matriz extracelular similar a membrana basal es la matriz de membrana basal Matrigel® (Corning).
Las células endoteliales bioimpresas debajo de los esferoides u organoides neuronales, o sembradas en el lado basolateral del equivalente neuronal, en particular en el lado basolateral del compartimento de cultivo celular que comprende el equivalente neuronal, se parecen a la barrera hematoencefálica y su estanqueidad se ha mostrado por una TEER de 20-78 Q x cm2 después de dos semanas de cultivo en chip. La resistencia eléctrica transepitelial/transendotelial (TEER) es una técnica cuantitativa ampliamente aceptada para medir la integridad de la dinámica de la unión estrecha en modelos de cultivo celular de capas de células endoteliales y epiteliales. TEER es un fuerte indicador de la integridad de las barreras celulares antes de que se evalúen, por ejemplo, para el transporte de fármacos o productos químicos. Las mediciones de TEER se pueden realizar en tiempo real sin dañar las células y, en general, se basan en la medición de la resistencia óhmica o la medición de la impedancia en un amplio espectro de frecuencias. Las mediciones para varios tipos de células se han descrito con sistemas de medición disponibles en el mercado y también con implementaciones microfluídicas adaptadas. Algunos de los modelos de barrera que se han caracterizado ampliamente usando TEER incluyen los modelos de barrera hematoencefálica (BBB), de tubo gastrointestinal (GI) y pulmonar.
En varias realizaciones de la presente descripción, las células endoteliales bioimpresas debajo de los esferoides u organoides neuronales, o sembradas en el lado basolateral del equivalente neuronal, en particular en el lado basolateral del compartimento de cultivo celular que comprende el equivalente neuronal, muestran una TEER de 20 78 Q x cm2, específicamente después de dos semanas de cultivo en chip.
En varias realizaciones de la presente descripción, las células del equivalente intestinal se caracterizan por la expresión de marcadores específicos de células epiteliales intestinales, que incluyen, incluyendo sacarasa-isomaltasa, el transportador de oligopéptidos intestinales SLC15A1/transportador de péptidos 1 (PEPT1) y la enzima metabolizadora principal CYP3A4.
En varias realizaciones de la presente descripción, las células del equivalente intestinal y/o del equivalente de hígado se caracterizan por la expresión de marcadores específicos que incluyen la enzima metabolizadora principal CYP3A4.
En varias realizaciones de la presente descripción, las células del equivalente de hígado se caracterizan por la expresión de marcadores específicos que incluyen la citoqueratina 8/18.
En varias realizaciones de la presente descripción, el equivalente de hígado se caracteriza por la expresión de la proteína ZO-1 de unión estrecha.
En varias realizaciones de la presente descripción, las células del equivalente neuronal se caracterizan por la expresión de marcadores específicos que incluyen la beta-tubulina III.
En varias realizaciones de la presente descripción, las células endoteliales (primarias) se caracterizan por la expresión
de CD31 y/o el factor de von-Willebrand (vWF).
En varias realizaciones de la presente descripción, los fibroblastos (derivados de iPSC) se caracterizan por la expresión de vimentina.
Como se describe en el presente documento, cualquier tipo de células usadas y descritas en la presente descripción se pueden derivar a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Específicamente, las células se pueden derivar (es decir, diferenciar) de una sola (es decir, una y la misma) iPSC donadora, que a su vez se ha obtenido (es decir, reprogramado) a partir de un solo tipo de célula somática. Por ejemplo, las células se pueden derivar (es decir, diferenciar) de una sola (es decir, una y la misma) iPSC, que se ha obtenido (es decir, reprogramado) de, p.ej., una célula somática de la piel, glóbulo blanco, célula renal, adipocitos o similares. Por lo tanto, en la medida en que las células no estén ya identificadas como células derivadas de iPSC, las células usadas y descritas en la presente descripción pueden ser células derivadas de iPSC de acuerdo con diversas realizaciones, preferiblemente células derivadas de iPSC que se han diferenciado de una sola (es decir, una y la misma) iPSC donadora, que se ha obtenido (es decir, reprogramado) a partir de un solo tipo de célula somática.
Como se describe en el presente documento, la referencia al "intestino" significa, según realizaciones preferidas, referencia al "intestino delgado". Por ejemplo, la referencia a "equivalente de intestino" o "células del intestino" significa según realizaciones preferidas referencia a "equivalente de intestino delgado" o "células del intestino delgado", respectivamente.
Como se describe en el presente documento, la referencia a "células" abarca la referencia a "células de mamífero", mientras que se prefiere la referencia a "células humanas". Por ejemplo, la referencia a "células endoteliales" abarca la referencia a "células endoteliales de mamífero", mientras que se prefiere la referencia a "células endoteliales humanas".
Como se describe además en el presente documento, la referencia a "tejido" abarca la referencia a "tejido de mamífero", mientras que se prefiere la referencia a "tejido humano". Por ejemplo, la referencia a "tejido hepático" abarca la referencia a "tejido de hígado de mamífero", mientras que se prefiere la referencia a "tejido de hígado humano".
Como se describe además en el presente documento, en varias realizaciones, el término "tejido" se puede considerar un "cultivo tisular".
Además, como se describe en el presente documento, "cultivar células" significa preferiblemente "cultivo fluídico de células".
En varias realizaciones, la presente descripción abarca la tensión de cizalladura fluídica (o fluida), específicamente la tensión de cizalladura fluídica (o fluida) fisiológicamente relevante.
EJEMPLOS
Diseño de chip del chip de ADME-N
Se obtuvo el diseño de un chip que tiene limitaciones, reducido gradualmente desde la fisiología humana. Se consideran los datos dimensionales y las características del flujo. El diseño comprende dos circuitos (denominados "sangre" y "orina") que contienen cavidades para la incorporación de los siguientes equivalentes de órganos: intestino, hígado, riñón (segregado en glomérulo y túbulo) y tejido neuronal (Fig. 1). Los tres primeros tejidos se usan para lograr el llamado perfil de ADME (adsorción, distribución, metabolismo, excreción). El último es un tejido adicional que complementa ese perfil. Por lo tanto, el chip se denomina chip de ADME-N. Un compartimento de depósito en cada circuito permite el muestreo de los líquidos sobrenadantes (depósito de medio 1 y 2). El medio se perfunde a través de la red microfluídica mediante dos microbombas neumáticas incorporadas, una para cada circuito. Los circuitos se solapan en los dos compartimentos de riñones y están separados por una membrana porosa hecha de policarbonato.
Compartimento de intestino
El equivalente de intestino se obtuvo colocando un inserto de cultivo celular de pie de 24 pocillos en la cavidad respectiva (compartimento de cultivo celular). El inserto contenía un modelo intestinal disponible en el mercado (Epilntestinal®, MatTek) u organoides de células intestinales derivadas de iPSC insertados en Matrigel que también contenía fibroblastos derivados de iPSC y células endoteliales derivadas de iPSC. En el modelo de equivalente intestinal derivado de iPSC, se sembraron células endoteliales microvasculares primarias o células endoteliales derivadas de iPSC en el lado basolateral del inserto de cultivo celular de pie de 24 pocillos. El lado apical del inserto se usó para la alimentación diaria de una solución de nutrientes (Nutriflex® peri, B.Braun). En total, el lado apical contenía un líquido sobrenadante de 250 pl.
Compartimento neuronal
El equivalente neuronal con barrera hematoencefálica consistía en un inserto de cultivo celular colgante de 96 pocillos que contenía esferoides neuronales derivados de iPSC enriquecidos con células endoteliales derivadas de iPSC
sembradas en el lado basolateral del inserto de cultivo celular colgante de 96 pocilios o bioimpresas debajo de los esferoides neuronales. El lado apical del inserto contenía un volumen de 75 gl.
Compartimento de hígado
El equivalente de hígado se logró colocando modelos de hígado disponibles en el mercado (Microtissues XL de hígado humano 3D InSight™, InSphero) o esferoides de hepatocitos derivados de iPSC con fibroblastos derivados de iPSC en la cavidad respectiva. De los primeros, se colocaron 50 esferoides en un chip, cada uno de los cuales contenía 3.000 hepatocitos primarios. De los últimos, se colocaron 20 esferoides en un chip, cada uno de los cuales contenía 50.000 células.
Compartimento de riñón (renal)
Los compartimentos de riñón se sembraron con una línea celular epitelial del túbulo proximal renal (RPTEC) o con células renales derivadas de iPSC.
Los protocolos de diferenciación usados para las células derivadas de iPSC se adaptaron de diferentes artículos citados en la Tabla 1.
Tabla 1: Lista de células derivadas de iPSC. Los protocolos de diferenciación se adaptaron de los artículos citados.
Tipos de células derivadas de iPSC Referencia
Hepatocitos Szkolnicka et al., 2014
Fibroblastos/MSC Zou et al., 2013
Organoides intestinales Kauffman et al., 2015
Equivalente renal Morizane et al., 2017
Esferoides neuronales Rigamonti et al., 2016
Células endoteliales de BBB Lippmann et al., 2012
Células endoteliales Harding et al., 2017
El circuito de "sangre" tenía un volumen total de aproximadamente 1,37 ml (sin incluir los volúmenes apicales). El circuito de "orina" tenía un volumen total de aproximadamente 0,58 ml. Inicialmente, el chip contenía medio con glucosa y suero. Todos los días, se tomaron muestras tanto de los depósitos de medio como del lado apical del equivalente de intestino. Los volúmenes tomados se reemplazaron con medio exento de glucosa para el depósito de medio de "sangre" y medio exento de glucosa y de suero para el depósito de medio de "orina". Al compartimiento intestinal se le dio una solución Nutriflex® peri rica en glucosa. De esta manera, se suministró diariamente al sistema 1,0 mg de glucosa solo a través del equivalente de intestino.
Se cultivaron conjuntos de chips durante 7, 14 y 21 días (Fig. 2). En los puntos finales, se tomaron muestras celulares para exámenes inmunohistológicos, qPCR y secuenciación de ARN. Se analizaron en los líquidos sobrenadantes el contenido de glucosa, lactato, LDH, albúmina, urea, ALT y AST. Los controles de cultivos estáticos de los equivalentes de órganos dados se tomaron los días 0, 7 y 14.
Experimento 1.1: Chips de iPSC - 3 chips
• Equivalente de hígado de iPSC
• Equivalente de intestino de iPSC
• Equivalente neuronal de iPSC con barrera hematoencefálica impresa
• Riñón de RPTEC
Compartimento intestinal
El inserto del equivalente de intestino contiene organoides de células intestinales derivadas de iPSC insertados en Matrigel que también contiene fibroblastos derivados de iPSC y células endoteliales derivadas de iPSC. En el modelo de equivalente intestinal derivado de iPSC, se siembran células endoteliales microvasculares primarias o células endoteliales derivadas de iPSC en el lado basolateral del inserto de cultivo celular de pie de 24 pocillos.
Compartimento neuronal
El equivalente neuronal con barrera hematoencefálica consiste en un inserto de cultivo celular que contiene esferoides
neuronales derivados de iPSC enriquecidos con células endoteliales derivadas de iPSC bioimpresas bajo los esferoides neuronales.
Compartimento de hígado
El equivalente de hígado se logra poniendo esferoides de hepatocitos derivados de iPSC con fibroblastos derivados de iPSC en la cavidad respectiva. Se ponen 20 esferoides sobre un chip, cada uno de los cuales contiene 50.000 células (relación de hepatocitos:fibroblastos 24:1).
Compartimento de riñón (renal)
Los compartimentos renales se siembran con una línea de células epiteliales del túbulo proximal renal (RPTEC). Experimento 1.2: Chips de tejido primario - 10 chips
• Tejido hepático primario
• Intestino delgado primario
• Equivalente neuronal de iPSC con barrera hematoencefálica impresa
• Riñón de RPTEC
Compartimento de intestino
El inserto del equivalente de intestino contiene un modelo intestinal disponible en el mercado (Epilntestinal®, MatTek). Compartimento neuronal
El equivalente neuronal con barrera hematoencefálica consiste en un inserto de cultivo celular que contiene esferoides neuronales derivados de iPSC enriquecidos con células endoteliales derivadas de iPSC bioimpresas bajo los esferoides neuronales.
Compartimento de hígado
El equivalente de hígado se logra poniendo modelos de hígado disponibles en el mercado (Microtissues XL de hígado humano 3D InSight™, InSphero) en la cavidad respectiva. Se ponen 50 esferoides sobre un chip, cada uno de los cuales contiene 3.000 hepatocitos primarios.
Compartimento de riñón (renal)
Los compartimentos renales se siembran con una línea de células epiteliales del túbulo proximal renal (RPTEC). Experimento 2: Chips de iPSC - 21 chips
• Equivalente de hígado de iPSC
• Equivalente de intestino de iPSC
• Equivalente neuronal de iPSC con barrera hematoencefálica
• Equivalente renal de iPSC
Compartimento intestinal
El inserto del equivalente de intestino contiene organoides de células intestinales derivadas de iPSC insertados en Matrigel que también contiene fibroblastos derivados de iPSC y células endoteliales derivadas de iPSC. En el modelo de equivalente intestinal derivado de iPSC, se siembran células endoteliales microvasculares primarias o células endoteliales derivadas de iPSC en el lado basolateral del inserto de cultivo celular de pie de 24 pocillos.
Compartimento neuronal
El equivalente neuronal con barrera hematoencefálica consiste en un inserto de cultivo celular que contiene esferoides neuronales derivados de iPSC enriquecidos con células endoteliales derivadas de iPSC sembradas en el lado basolateral del inserto de cultivo celular.
Compartimento de hígado
El equivalente de hígado se logra poniendo esferoides de hepatocitos derivados de iPSC con fibroblastos derivados de iPSC en la cavidad respectiva. Se ponen 20 esferoides sobre un chip, cada uno de los cuales contiene 50.000 células (relación de hepatocitos:fibroblastos 24:1).
Compartimento de riñón (renal)
Los compartimentos renales se siembran con células renales derivadas de iPSC.
Resultados
Los chips eran homeostáticos. Esto se mostró por los niveles constantes de glucosa y LDH (Fig. 3). Una concentración de glucosa constante sugería el consumo constante y una regulación activa de la glucosa disponible. Los niveles de glucosa han alcanzado niveles iguales en todos los compartimentos. La alimentación sólo de forma apical a través del equivalente intestinal era suficiente para el suministro tanto al circuito de "sangre" como de "orina". Además, la actividad de LDH se ha mostrado bastante constante a lo largo de los experimentos. En comparación con la glucosa, los niveles de LDH son diferentes en cada compartimento. La función de barrera del equivalente intestinal y del equivalente renal se muestra por diferentes concentraciones de LDH en los tres compartimentos (es decir, circuito de sangre -> depósito de medio 1; circuito de orina -> depósito de medio 2; y compartimento intestinal). Por lo tanto, las barreras diferencian entre las sustancias que cruzan. La penetración activa o pasiva de la glucosa, a la vez que retiene otras sustancias, indica interacciones prácticas entre subconjuntos del sistema de chip.
Los compartimentos glomerular y tubular se lograron con una combinación de una membrana de policarbonato y una capa estrecha de células renales (Fig. 4). La primera implementa una barrera técnica para filtrar constituyentes grandes del medio y retarda su difusión. La última reabsorbe sustancias y produce la acumulación de gradientes de concentración a través del circuito de "sangre" y "orina". Este gradiente es visible no solo para la LDH sino también para la aspartato transaminasa (AST, Fig. 5). Ambas concentraciones claramente diferentes demuestran la función de la membrana renal del chip de ADME-N. La AST solo puede originarse a partir del equivalente de hígado, ya que es una enzima intracelular que se encuentra en hepatocitos y células musculares.
Se realizó la evaluación inmunohistoquímica de todos los equivalentes de órganos para determinar la identidad, funcionalidad y viabilidad (Fig. 6-9). El equivalente de intestino derivado de iPSC se formó mediante una capa de Matrigel cubierta con fibroblastos derivados de iPSC. Los organoides intestinales que encierran un lumen se incorporaron al gel (Fig. 6). Las células intestinales derivadas de iPSC expresaban NaK-ATPasa y Cyp3A4. En el Experimento 1.2, una capa cerrada de células endoteliales microvasculares primarias estaba, además, formando otra capa en el lado basolateral del inserto de cultivo celular.
El equivalente de hígado primario mostró marcadores funcionales al final de su periodo de cultivo de dos semanas (Fig. 7). Además, para el equivalente de hígado derivado de iPSC, los marcadores funcionales se confirmaron después de tres semanas de cultivo en el chip de ADME-N (Fig. 8).
El equivalente neuronal derivado de iPSC expresaba marcadores funcionales para la p-tubulina III al final de su periodo de cultivo de dos semanas (Fig. 9). Las células endoteliales impresas en el hidrogel muestran expresión del vWF después de dos semanas de cultivo de chip (Experimento 1.2). La estanqueidad de la barrera sanguínea se mostró por valores de TEER de 20-78 Q x cm2 después de dos semanas de cultivo de chip (Experimento 2).
Lista de referencias citadas en la Tabla 1:
1. Szkolnicka, D., Farnworth, S. L., Lucendo-villarin, B. & Hay, D. C. Deriving Functiona1Hepatocytes from Pluripotent Stem Cells. 1-12 (2014). doi:10.1002/9780470151808.sc01g05s30
2. Zou, L. et al. A simple method for deriving functional MSCs and applied for osteogenesis in 3D scaffolds. Sci. Rep.
3. 2243 (2013).
3. Kauffman, A. L., Ekert, J. E., Gyurdieva, A. V, Rycyzyn, M. A. & Hornby, P. J. Directed differentiation protocols for successful human intestinal organoids derived from multiple induced pluripotent stem cell lines. 2, 1-10 (2015).
4. Morizane, R. & Bonventre, J. V. Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 12, 195-207 (2016).
5. Rigamonti, A. et al. Stem Cell Reports. Stem Cell Reports 6, 993-1008 (2016).
6. Lippmann Ethan S, Azarin Samira M, Kay Jennifer E, Nessler Randy A, Wilson Hannah K, Al-Ahmad Abraham, Palecek Sean P, S. E. V. Human Blood-Brain Barrier Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells. Nat. Biotechnol. 30, 783-791 (2012).
7. Harding, A. et al. Highly Efficient Differentiation of Endothelial Cells from Pluripotent Stem Cells Requires the MAPK and the PI3K Pathways. Stem Cells 35, 909-919 (2017).
Claims (15)
1. Un dispositivo microfluídico que comprende un circuito de sangre con uno o más compartimentos de cultivo celular y un circuito de orina que comprende una unidad de filtración y una unidad de reabsorción, en donde ambos circuitos están conectados entre sí a través de la unidad de filtración y la unidad de reabsorción, y que además comprende un compartimento de depósito además de uno o más compartimentos de cultivo celular, que sirve para añadir solución de nutrientes al sistema.
2. El dispositivo microfluídico de la reivindicación 1, en donde la unidad de filtración comprende una barrera de filtración que permite selectivamente el paso de moléculas desde el circuito de sangre al circuito de orina basándose en el tamaño y la carga de las moléculas.
3. El dispositivo microfluídico de la reivindicación 2, en donde la barrera de filtración es una barrera mecánica o biológica, preferiblemente una barrera biológica que comprende podocitos.
4. El dispositivo microfluídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la unidad de reabsorción comprende una barrera que permite la reabsorción de fluido del circuito de orina al circuito de sangre.
5. El dispositivo microfluídico de la reivindicación 4, en donde la barrera de reabsorción es una barrera biológica, preferiblemente en donde la barrera biológica comprende células del túbulo renal.
6. El dispositivo microfluídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del circuito de sangre comprende un equivalente de órgano que imita la función hepática, y al menos uno de los compartimentos de cultivo celular del circuito de sangre comprende un equivalente de órgano que imita la función intestinal.
7. Uso del dispositivo microfluídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en pruebas analíticas, diagnósticos, investigación, validación de objetivos, estudios de toxicidad, ingeniería de tejidos, fabricación de tejidos, cribado de fármacos y/o análisis farmacocinético-farmacodinámico.
8. Un método de funcionamiento de un sistema microfisiológico que hace uso del dispositivo microfluídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
9. El método de la reivindicación 8, que comprende además añadir selectivamente una solución de nutrientes al sistema microfisiológico a través del compartimento de cultivo celular que comprende un equivalente de órgano o tejido que comprende células epiteliales del tubo gastrointestinal e imita la función intestinal.
10. Un método para detectar un analito en un sistema microfisiológico haciendo uso del dispositivo microfluídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el método comprende añadir una muestra de ensayo a un compartimento de cultivo celular del circuito de sangre, preferiblemente en donde el compartimento de cultivo celular comprende un tejido que comprende células epiteliales del tubo gastrointestinal, la piel o el aparato respiratorio.
11. Un método para imitar la homeostasis que comprende operar un sistema microfisiológico haciendo uso del dispositivo microfluídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 que comprende un circuito de sangre con uno o más compartimentos de cultivo celular y un circuito de orina que comprende una unidad de filtración y una unidad de reabsorción, en donde ambos circuitos están conectados entre sí a través de la unidad de filtración y la unidad de reabsorción.
12. El método de la reivindicación 11, que comprende añadir selectivamente una solución de nutrientes al sistema microfisiológico a través de un compartimento de cultivo celular que comprende células epiteliales del tubo gastrointestinal, la piel o el aparato respiratorio, preferiblemente en donde las células epiteliales son células epiteliales del tubo gastrointestinal, preferiblemente del intestino delgado.
13. Un método de cultivo y/o mantenimiento de células que comprende sembrar el dispositivo microfluídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 con células.
14. Un kit para operar un sistema microfisiológico que comprende el dispositivo microfluídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 e instrucciones de uso.
15. Un ensayo de ADME (absorción, distribución, metabolismo, excreción) o un ensayo de ADMET (absorción, distribución, metabolismo, excreción, toxicidad), que comprende el dispositivo microfluídico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
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