BR112020012381B1 - Dispositivo microfluídico, uso do dispositivo microfluídico, método de operação de um sistema microfisiológico, método de detecção de um analito em um sistema microfisiológico fazendo uso do dispositivo microfluídico, método de simulação de homeostase, método de cultura e/ou manutenção celular, kit para operação de um sistema microfisiológico e ensaio de absorção, distribuição, metabolismo, excreção, ou um ensaio de absorção, distribuição, metabolismo, excreção, toxicidade - Google Patents

Abstract

A presente revelação se refere a novos dispositivos microfluídicos e seu uso para operação de sistemas microfisiológicos. Os novos dispositivos microfluídicos são particularmente úteis para a análise farmacocinética/farmacodinâmica no contexto de criação de perfil de ADME(T). A presente revelação provê novos dispositivos microfluídicos compreendendo um primeiro circuito "sanguíneo" com um ou mais compartimentos para cultura celular, e um segundo circuito "urinário" compreendendo uma filtração renal e unidade de reabsorção, em que ambos os circuitos são conectados entre si por meio da unidade de filtração e da unidade de reabsorção. A presente revelação provê ainda métodos, kits e ensaios que implementam os novos dispositivos microfluídicos.

Description

CAMPO DA TÉCNICA

[001] A presente revelação se refere a novos dispositivos microfluídicos e seu uso para a operação de sistemas microfisiológicos. Os novos dispositivos microfluídicos são particularmente úteis para a análise farmacocinética/farmacodinâmica no contexto de criação de perfil de ADME(T). A presente revelação provê novos dispositivos microfluídicos compreendendo um primeiro circuito “sanguíneo” com um ou mais compartimentos para cultura celular, e um segundo circuito “urinário” compreendendo uma filtração renal e unidade de reabsorção, em que ambos os circuitos são conectados entre si por meio da unidade de filtração e da unidade de reabsorção. A presente revelação provê ainda métodos, kits e ensaios que implementam os novos dispositivos microfluídicos.

HISTÓRICO DA TÉCNICA

[002] Os dispositivos microfluídicos são capazes de simular a biologia humana in vitro na menor escala biologicamente aceitável. Em contraste com as culturas celulares e teciduais convencionais (estáticas), os sistemas microfisiológicos aplicam fluxo de fluido dinâmico para a nutrição fisiológica dos tecidos como um fator para simulação da função do órgão com uso mínimo de células e tecidos humanos. A tecnologia de microplaquetas de múltiplos órgãos é de interesse particular à indústria farmacêutica em termos de desenvolvimento medicamentoso e teste de toxicidade. Os modelos de múltiplos órgãos em uma microplaqueta podem potencializar o entendimento fundamental dos processos biológicos complexos e são considerados por ocasionar testes mais rápidos, precisos, econômicos e clinicamente relevantes de medicamentos, bem como cosméticos. Portanto, há reconhecimento crescente na técnica de que o teste in vitro que usa sistemas microfisiológicos implementados em dispositivos microfluídicos pode ser mais eficaz e também mais confiável que o teste in vivo.

[003] Há necessidade na técnica de novos sistemas microfluídicos de múltiplos órgãos que suportem condições fisiológicas para manutenção de microambientes estáveis durante um longo período, e que possibilitem a simulação da interação fisiológica de dois ou mais modelos que simulem a funcionalidade do órgão. A presente revelação aborda esta necessidade ao prover novos dispositivos microfluídicos, que são especificamente caracterizados por um circuito sanguíneo e um circuito urinário que estabelecem um sistema microfisiológico homeostático.

[004] Sakolish and Mahler (RSC Adv. , 2017, 7, 4216-4225) descrevem o layout das barreiras de filtração renal dos glomérulos e túbulos em um dispositivo microfluídico que é especificamente usado na cultura de células renais humanas. Giobbe et al. (Nat. Methods, 2015, 12(7), 637-640) descrevem a diferenciação funcional de células-tronco humanas pluripotentes em uma microplaqueta. Zhang et al. (Future Sci. OA, 2017, 3(2), FS0197) descrevem as culturas de células-tronco e a diferenciação em dispositivos microfluídicos para o órgão em uma microplaqueta.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005] O novo dispositivo microfluídico provido pela presente revelação permite, entre outros, simular interações fisiológicas de duas ou mais funcionalidades do órgão dentro de um sistema para possibilitar a geração de dados a partir de um sistema microfisiológico homeostático. O sistema microfisiológico estabelecido com o novo dispositivo microfluídico suporta condições fisiológicas para a manutenção de microambientes estáveis em um sistema que simule a interação e diafonia de diversos modelos que simulam a funcionalidade do órgão.

[006] O novo dispositivo microfluídico provido pela presente revelação possibilita a simulação da diafonia entre órgãos humanos, vias de ADME e circuitos regulatórios sistêmicos entre os modelos orgânicos, conforme demonstrado pelo presente documento. Em particular, o novo dispositivo microfluídico provê um sistema microfisiológico com um microambiente estável, particularmente adequado para o estabelecimento de ensaio para análise farmacocinética/farmacodinâmica no contexto de criação de perfil de ADME(T).

[007] Os novos dispositivos microfluídicos providos pela presente revelação proveem ainda engenharia organoide ou tecidual com sistemas microfisiológicos in vitro que usam células precursoras específicas ao órgão derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) ou organoides específicos ao órgão derivados de iPSC.

[008] Em particular, a presente revelação provê: [1] Um dispositivo microfluídico que compreende um primeiro circuito com um ou mais compartimentos para cultura celular e um segundo circuito que compreende uma unidade de filtração e uma unidade de reabsorção, em que ambos os circuitos são conectados entre si por meio da unidade de filtração e da unidade de reabsorção. [2] O dispositivo microfluídico de [1] , em que a unidade de filtração compreende uma barreira de filtração que permite a passagem de forma seletiva de moléculas do primeiro circuito para o segundo circuito com base no tamanho e carga das moléculas. [3] O dispositivo microfluídico de [2] , em que a barreira de filtração é uma barreira mecânica ou biológica, preferencialmente uma barreira biológica que compreende podócitos. [4] O dispositivo microfluídico de qualquer um entre [1] a [3], em que a unidade de reabsorção compreende uma barreira que permite a reabsorção de fluidos do segundo circuito para o primeiro circuito. [5] O dispositivo microfluídico de [4] , em que a barreira de reabsorção é uma barreira biológica, preferencialmente em que a barreira biológica compreende células do túbulo renal. [6] O dispositivo microfluídico de qualquer um entre [1] a [5], em que pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito compreende um equivalente de órgão que simule a função hepática, e pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito compreende um equivalente de órgão que simule a função intestinal. [7] Uso do dispositivo microfluídico de qualquer um entre [1] a [6] no teste analítico, diagnóstico, pesquisa, validação alvo, estudos de toxicidade, engenharia tecidual, manufatura tecidual, triagem de droga e/ou análise farmacocinética/farmacodinâmica. [8] Um método de operação de um sistema microfisiológico que faz uso do dispositivo microfluídico de qualquer um entre [1] a [6]. [9] O método de [8] compreendendo ainda adição de forma seletiva de uma solução nutriente ao sistema microfisiológico por meio do compartimento para cultura celular compreendendo equivalente de órgão ou tecido compreendendo células epiteliais do trato gastrointestinal e que simulem a função intestinal. [10] Um método de detecção de um analito em um sistema microfisiológico que faz uso do dispositivo microfluídico de qualquer um entre [1] a [6], em que o método compreende a adição de uma amostra teste a um compartimento para cultura celular do primeiro circuito, preferencialmente em que o compartimento para cultura celular compreende um tecido compreendendo células epiteliais do trato gastrointestinal, pele ou trato respiratório. [11] Um método de simulação de homeostase compreendendo operação de um sistema microfisiológico compreendendo um primeiro circuito com um ou mais compartimentos para cultura celular e um segundo circuito compreendendo uma unidade de filtração e uma unidade de reabsorção, em que ambos os circuitos são conectados entre si por meio da unidade de filtração e da unidade de reabsorção. [12] O método de [11] compreendendo a adição de forma seletiva de uma solução nutriente ao sistema microfisiológico por meio de um compartimento para cultura celular compreendendo células epiteliais do trato gastrointestinal, pele ou trato respiratório, preferencialmente em que as células epiteliais são células epiteliais do trato gastrointestinal, preferencialmente do intestino delgado. [13] Um método de cultura e/ou manutenção de células compreendendo cultura do dispositivo microfluídico, de acordo com quaisquer itens [1] a [6] com células. [14] Um kit para a operação de um sistema microfisiológico compreendendo o dispositivo microfluídico, de acordo com quaisquer itens [1] a [6], e instruções de uso. [15] Um ensaio de ADME (absorção, distribuição, metabolismo, excreção) , ou um ensaio de ADMET (absorção, distribuição, metabolismo, excreção, toxicidade), compreendendo o dispositivo microfluídico, de acordo com quaisquer itens [1] a [6].

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[009] Figura 1: mostra uma pegada de microplaqueta de ADME-N exemplar (parte superior) e vista isométrica em camadas separadas (parte inferior). A vista isométrica exemplifica o posicionamento de uma membrana entre os dois circuitos (circuito sanguíneo e circuito urinário). ADME-N = microplaqueta de ADME e equivalente neuronal.

[0010] Figura 2: mostra o desenho experimental das microplaquetas iPSC e microplaquetas teciduais primárias. RPTECs = linhagem de células epiteliais proximais renais. iPSC = células-tronco pluripotentes induzidas. 2A: Desenho dos Experimentos 1.1 e 1.2, 2B: Desenhos do Experimento 2.

[0011] Figura 3: mostra as medições da concentração de glicose e atividade de LDH. 3A: medições da concentração de glicose e atividade de LDH do Experimento 1.1 (microplaquetas iPSC); 3B: medições da concentração de glicose e atividade de LDH do Experimento 1.2 (Microplaquetas teciduais primárias). As medições foram realizadas diariamente no compartimento apical do equivalente intestinal, no reservatório do meio “sanguíneo” (para o circuito sanguíneo), e no reservatório do meio “urinário” (para o circuito urinário).

[0012] Figura 4: mostra o equivalente renal tubular da microplaqueta de ADME-N totalmente cultivado com RPTECs humanas (Experimento 1.1, dia 7). A: imagem do campo claro (BF) no dia 7 de cultura. B-D: coloração imunohistológica de RPTECs no dia 14 (Experimento 1.2) B: núcleo corado com DAP I (4’,6-Diamidin-2-fenilindol); C: membranas celulares coradas com NaK-ATPase; D: citoesqueleto corado com citoqueratina 8/18. RPTECs = células epiteliais renais proximais.

[0013] Figura 5: mostra medições da concentração de aspartato transaminase (AST) no circuito “sanguíneo” no reservatório de meio 1, e no circuito “urinário” no reservatório de meio 2.

[0014] Figura 6: mostra o exame imunohistológico exemplar de um equivalente intestinal de iPSC com células endoteliais primárias no dia 7 da cultura de microplaqueta de ADME-N (Experimento 1.1). A: núcleo corado com DAPI; B: células endoteliais primárias coradas para CD31; C: organoides intestinais de iPSC corados para NaK-ATPase. D: núcleo corado com DAPI; E: organoides intestinais de iPSC corados para Cyp3A4; F: fibroblastos derivados de iPSC corados para vimentina.

[0015] Figura 7: mostra o exame imunohistológico exemplar de equivalentes hepáticos primários (InSphero) cultivados durante duas semanas na microplaqueta de ADME-N (Experimento 1.2). A: núcleo corado com DAPI; B: albumina; C: Cyp3A4.

[0016] Figura 8: mostra o exame imunohistológico exemplar de equivalente hepático derivado de iPSC cultivado durante três semanas na microplaqueta de ADME-N (Experimento 2). A: núcleo corado com DAPI; B: fibroblastos iPSC corados para vimentina; C: citoesqueleto de hepatócitos corados com Citoqueratina 8/18, D: núcleo corado com DAPI; E: junções curtas coradas com ZO-1; F: albumina.

[0017] Figura 9: mostra o exame imunohistológico exemplar de equivalentes neuronais de iPSC cultivados durante duas semanas na microplaqueta de ADME-N (Experimento 1.2). A: núcleo corado com DAPI; B: células neuronais coradas com b Tubulina III; C: células endoteliais primárias coradas com vWF (Fator de von Willebrand); D: imagem de campo claro de esferoides neuronais sobre o hidrogel impresso incluindo células endoteliais.

[0018] Figure 10: mostra a medição da concentração de LDH no compartimento apical do equivalente intestinal, no circuito sanguíneo no reservatório de meio 1 e no circuito urinário no reservatório de meio 2 (Experimento 2). A função de barreira do equivalente intestinal e do equivalente renal é mostrada por diferentes concentrações de LDH em todos os três compartimentos.

[0019] Figura 11: mostra o alongamento das células edoteliais derivadas de iPSC nos canais da microplaqueta de múltiplos órgãos. Alta expressão do marcador endotelial CD31 no dia 8 da cultura de microplaqueta.

[0020] Figura 12: mostra uma vista esquemática transversal de uma microplaqueta de ADME da presente revelação. A = Administração, D = Distribuição, M = Metabolismo, E = Excreção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0021] O novo dispositivo microfluídico provido pela presente revelação permite simular interações fisiológicas de duas ou mais funcionalidades de órgãos em um sistema para possibilitar a geração de dados a partir de um sistema microfisiológico homeostático. O sistema microfisiológico estabelecido com o dispositivo microfluídico suporta condições fisiológicas obrigatórias para manter os microambientes estáveis em um sistema que simula a interação e diafonia de diversos modelos que simulam a funcionalidade do órgão. A Figura 1 mostra uma pegada de microplaqueta de ADME-N (ADME + equivalente neuronal) exemplar (parte superior) e vista isométrica sobre camadas separadas (parte inferior). A vista isométrica exemplifica o posicionamento de uma membrana entre os dois circuitos (circuito sanguíneo e circuito urinário). A Fig. 12 mostra uma vista esquemática transversal parcial de uma microplaqueta de ADME da presente revelação.

[0022] A Fig. 2 mostra o desenho experimental das microplaquetas de iPSC e microplaquetas teciduais primárias. Os conjuntos de microplaquetas foram cultivados durante 7, 14 e 21 dias. Nos endpoints, as amostras celulares foram coletadas para exames imunohistológicos, qPCR e sequenciamento de RNA. O sobrenadantes foram analisados quanto ao seu teor de glicose, lactato, LDH (lactato desidrogenase), albumina, ureia, ALT (alanina aminotransferase) e AST (aspartato transaminase). Os controles das culturas estáticas do ditos equivalentes de órgãos foram coletados nos dias 0, 7 e 14.

[0023] Os novos dispositivos microfluídicos providos pela presente revelação proveem especificamente engenharia organoide e tecidual com sistemas microfisiológicos in vitro que usam células precursoras específicas ao órgão derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC)ou organoides específicos ao órgão derivados de iPSC. A presente revelação também demonstra que a tensão de cisalhamento promove alongamento das células endoteliais derivadas de iPSC nos canais da microplaqueta de múltiplos órgãos (Fig. 11).

[0024] O novo dispositivo microfluídico provido pela presente revelação possibilita a simulação de diafonia entre órgãos humanos, vias de ADME e circuitos regulatórios sistêmicos entre os modelos de órgãos, como demonstrado pelo presente documento. Em particular, o novo dispositivo microfluídico provê um sistema microfisiológico com um microambiente estável, particularmente adequado para estabelecimento de ensaio para análise farmacocinética/farmacodinâmica no contexto de criação de perfil de ADME(T). Demonstrou-se que o novo dispositivo microfluídico provido pela presente revelação estabelece e mantém estabilidade homeostática do sistema microfisiológico, conforme evidenciado pelas medições de glicose e LDH representadas nas Figuras 3 e 10.

[0025] Os compartimentos glomerular e tubular (unidade de filtração e unidade de reabsorção) podem ser realizados com uma combinação de uma membrana de policarbonato e uma camada rígida de células renais (Fig. 4). O primeiro implementa uma barreira técnica para filtrar os constituintes médios de peso molecular grande e retardar sua difusão. O último reabsorve as substâncias e causa o acúmulo de gradientes de concentração entre os circuitos “sanguíneo” e “urinário”. Este gradiente é visível não apenas para LDH, mas também para aspartato transaminase (AST, Fig. 5) . Ambas as suas concentrações distintamente diferentes demonstram a função da membrana renal da nova microplaqueta microfluídica de ADME provida pela presente revelação. O AST origina-se do equivalente hepático, pois é uma enzima intracelular encontrada nos hepatócitos. Todos os equivalentes de órgãos foram avaliados de forma imunohistoquímica para se determinar a identidade, funcionalidade e viabilidade (Figs. 6 a 9).

[0026] A análise metabólica revelou o estabelecimento de uma homeostase reproduzível entre todos os equivalentes de órgãos. A presente revelação possibilita a demonstração de polarização celular, reorganização, função de barreira e tráfego observado in vivo. A realização de um microambiente estável no novo dispositivo microfluídico combinando um primeiro circuito com um ou mais compartimentos para cultura celular e um segundo circuito compreendendo uma unidade de filtração e reabsorção sobrepondo-se ao primeiro circuito nas unidades renais abre possibilidades para o teste de dose repetida, por exemplo, no desenvolvimento de drogas.

[0027] A presente revelação provê um novo dispositivo microfluídico compreendendo um primeiro circuito com um ou mais compartimentos para cultura celular, e um segundo circuito compreendendo uma unidade de filtração e uma unidade de reabsorção, em que ambos os circuitos são conectados entre si por meio da unidade de filtração e da unidade de reabsorção. A Figura 1 mostra um layout exemplar de um novo dispositivo microfluídico compreendendo dois circuitos (denominados “circuito sanguíneo” e “circuito urinário”) contendo cavidades para a incorporação dos seguintes equivalentes de órgãos: intestino, fígado, rim (segregado em glomérulo e túbulo) e tecido neuronal. Os três primeiros tecidos são usados para realizar o assim denominado perfil de ADME (adsorção, distribuição, metabolismo, excreção). O último é um tecido adicional que suplementa aquele perfil. A microplaqueta é, portanto, denominada microplaqueta de ADME-N (ADME + equivalente/tecido neuronal). Um compartimento reservatório em cada circuito permite a amostragem de sobrenadantes (“reservatórios de meio 1 e 2”). O meio é perfundido através da rede microfluídica por duas microbombas pneumáticas incorporadas - uma para cada circuito. Os circuitos se sobrepõem nos dois compartimentos da unidade renal e são separados por uma membrana porosa feita de policarbonato.

[0028] Em comparação aos sistemas de órgãos únicos/microplaquetas, o sistema microfisiológico/microplaqueta microfluídica da presente revelação pode ser considerado como um sistema de múltiplos órgãos/microplaqueta dado que o dispositivo microfluídico compreende dois circuitos e, assim, compreende pelo menos dois compartimentos para cultura celular, com um deles localizado no primeiro circuito, e o outro sendo uma das unidades do segundo circuito que simula a função renal, em particular a unidade de reabsorção.

[0029] Em diversas realizações, o novo dispositivo microfluídico pode ser considerado como compreendendo um primeiro circuito com um ou mais compartimentos para cultura celular, e um segundo circuito compreendendo uma unidade de filtração e uma unidade de reabsorção, em que ambos os circuitos se sobrepõem na unidade de filtração e na unidade de reabsorção. Em diversas realizações preferidas, as partes que se sobrepõem dos dois circuitos (ou as partes que conectam ambos os circuitos entre si) são separadas por uma membrana porosa. Estas partes que se sobrepõem/conectam significam especificamente a unidade de filtração e a unidade de reabsorção.

[0030] Em diversas realizações, a dita membrana porosa que separa as partes que se sobrepõem/conectam os dois circuitos é uma membrana porosa sintética ou biológica. Em diversas realizações, a dita membrana porosa pode ser feita de qualquer um entre colágeno, fibrina, matriz extracelular (inclusive matriz de órgão descelularizado), ou misturas destes, sem se limitar a estes. Em diversas realizações, a membrana porosa apresenta as mesmas propriedades da pastilha Transwell . Em diversas realizações, a membrana porosa e reabsorvível pelas células. Em diversas outras realizações, a membrana porosa é feita de policarbonato. Em diversas outras realizações, a membrana porosa é uma membrana porosa feita de poli(dimetilsiloxano) (PDMS).

[0031] A unidade de filtração e a unidade de reabsorção são compartimentos separados para cultura celular para incorporação de células renais, em particular um equivalente glomerular renal (unidade de filtração) e um equivalente tubular renal (unidade de reabsorção).

[0032] Conforme descrito pelo presente, os termos “compartimento(s) para cultura celular” e “câmara(s) para cultura celular” ou “cavidade(s) para cultura celular” podem ser usados aqui de forma intercambiável. Um compartimento para cultura celular, de acordo com a presente revelação, é um compartimento, câmara ou cavidade particularmente adequado para cultura celular e tecidual conforme usado e descrito no contexto da presente revelação. Em diversas realizações, o compartimento para cultura celular compreende uma lâmina em formato de placa de poços, em particular placas para cultura celular de (micro)poço (ou multipoços) em quaisquer dos formatos de 6, 12, 24, 48, 96 e 384 poços. As realizações preferidas abrangem multipoços no formato de 24, 48, 96 ou 384 poços. Os multipoços podem ser feitos de uma variedade de materiais, enquanto os materiais mais comuns sejam poliestireno e polipropileno, que podem ser usados em diversas realizações da presente revelação. Em diversas outras realizações, o compartimento para cultura celular é uma pastilha Transwell® (microfluídica), preferencialmente uma pastilha Transwell (microfluídica) feita de policarbonato (PC), poliéster (PE) , politetrafluoretileno revestido com colágeno (PTFE) ou PET (polietileno tereftalato). Conforme descrito pelo presente, um compartimento para cultura celular usado no contexto da presente revelação pode ser descrito por ter uma membrana porosa (superfície) para cultura e crescimento celular/tecidual.

[0033] Conforme descrito pelo presente, uma membrana porosa significa especificamente, entre outros, uma membrana que possui uma estrutura porosa que pode ser usada não apenas para filtração, medição e/ou separação de moléculas químicas e/ou biológicas, mas também como uma superfície para cultura e crescimento celular ou tecidual. A membrana porosa de um compartimento para cultura celular, conforme usado no contexto da presente revelação, serve especificamente para estabelecer uma conexão fluida entre o equivalente do órgão compreendido pelo compartimento para cultura celular e a rede microfluídica. Assim, em diversas realizações, a membrana porosa de um compartimento para cultura celular, conforme descrito pelo presente, é disposta de modo que o equivalente de órgão (células/tecido) posicionado sobre a superfície da membrana porosa esteja em conexão fluida com os canais microfluídicos do dispositivo microfluídico. Em diversas realizações, a membrana porosa pode ser cultivada com células em ambos os lados da membrana. Preferencialmente, as células endoteliais são cultivadas no lado inferior da membrana porosa.

[0034] No geral, através dos processos de manufatura, os tamanhos de poro podem ser adaptados de alguns nanômetros a micrômetros, possibilitando, assim, a filtração, medição e separação das moléculas químicas e biológicas alvo, e também o fluxo fluídico entre o equivalente de órgãos nos compartimentos para cultura celular e a rede de canal microfluídico. Em diversas realizações, a membrana porosa é uma membrana porosa como descrita acima. Portanto, a membrana porosa pode ser uma membrana porosa sintética ou biológica. Em diversas realizações, a dita membrana porosa pode ser feita de qualquer um entre colágeno, fibrina ou matriz extracelular (inclusive matriz de órgãos descelularizados) sem se limitar a estes. Em diversas realizações, a membrana porosa apresenta as mesmas propriedades de uma pastilha Transwell . Em diversas realizações, a membrana porosa e reabsorvível pelas células. Em diversas outras realizações, a membrana porosa é feita de policarbonato. Em diversas outras realizações preferidas, a membrana porosa é uma membrana porosa feita de poli(dimetilsiloxano) (PDMS).

[0035] Conforme descrito pelo presente, o termo “primeiro circuito” significa especificamente um sistema circulatório que simule um sistema circulatório sanguíneo mamífero, mais especificamente que simule o sistema circulatório sanguíneo humano. Conforme descrito ainda pelo presente, os termos “primeiro circuito” e “equivalente de circuito sanguíneo” ou “circuito sanguíneo biomimético” podem ser usados pelo presente de forma intercambiável. Do mesmo modo, conforme descrito pelo presente, o termo “segundo circuito” significa especificamente um sistema circulatório que simule um sistema urinário mamífero, mais especificamente que simule o sistema urinário humano. Conforme descrito ainda pelo presente, os termos “segundo circuito” e “equivalente de circuito urinário” ou “circuito urinário biomimético” podem ser usados pelo presente de forma intercambiável.

[0036] A filtração renal inclui a filtração passive e ativa, com o glomérulo atuando como uma barreira de filtração passiva evitando que proteínas séricas de peso molecular grande adentrem o nefrônio. Assim, estas proteínas séricas de peso molecular grande continuam circulando na corrente sanguínea. Conforme descrito pelo presente, a unidade de filtração do novo dispositivo microfluídico aqui revelado compreende uma barreira de filtração que permite de forma seletiva a passagem de moléculas do primeiro circuito (“circuito sanguíneo”) para o segundo circuito (“circuito urinário”) com base no tamanho e carga das moléculas, simulando, assim, a barreira de filtração seletiva de glomérulo.

[0037] Em diversas realizações da presente revelação, a barreira de filtração compreendida pela unidade de filtração é estabelecida pela membrana porosa que separa a unidade de filtração (e a unidade de reabsorção) do circuito sanguíneo (separando as partes que se sobrepõem dos dois circuitos). Portanto, de acordo com estas realizações, a barreira de filtração pode ser considerada uma barreira de filtração mecânica (porosa). Especificamente, a barreira de filtração mecânica (porosa) simula a barreira de filtração glomerular. Assim, em diversas realizações, a barreira de filtração pode ser estabelecida ainda por um compartimento de cultura celular que possui uma membrana porosa. em realizações preferidas, a barreira de filtração mecânica possui um tamanho de poro de aproximadamente 8 nm, mas pode possuir um tamanho de poro < 8 nm. De acordo com outras realizações preferidas, a barreira de filtração mecânica possui um tamanho de poro que estabelece um limite superior de aproximadamente 69 kDa para as proteínas séricas adentraram o segundo circuito (urinário). Em diversas realizações, a barreira de filtração mecânica possui um tamanho de poro que estabelece um limite para a albumina, preferencialmente albumina sérica (ou albumina do sangue), adentrar o segundo circuito (urinário).

[0038] Em diversas outras realizações da presente revelação, a barreira de filtração compreendida pela unidade de filtração é uma barreira de filtração biológica. Preferencialmente, a barreira de filtração biológica é uma barreira que possui aberturas para filtração que estabelecem um limite superior de aproximadamente 69 kDa para as proteínas séricas adentraram o segundo circuito (urinário). Em diversas realizações, a barreira de filtração biológica compreende podócitos (também denominados células epiteliais viscerais). Mais especificamente, a barreira de filtração biológica é uma barreira (de filtração) de podócito que evita que as proteínas do plasma sanguíneo adentrem o segundo circuito (urinário). A barreira de filtração de podócito possui preferencialmente aberturas de filtração que estabelecem um limite superior de aproximadamente 69 kDa para as proteínas séricas adentrarem o segundo circuito (urinário). Em diversas realizações, a barreira de filtração de podócito possui um tamanho de poro que estabelece um limite para a albumina, preferencialmente albumina sérica (ou albumina do sangue), adentrar o segundo circuito (urinário).

[0039] Na fisiologia renal, a reabsorção (ou reabsorção tubular) é o processo pelo qual o nefrônio remove água e solutos do fluido tubular (pré-urina) e os devolve ao sangue circulante. O filtrado glomerular se torna mais concentrado, que é uma das etapas na formação da urina. A reabsorção permite que muitos solutos úteis (principalmente glicose e aminoácidos), sais e água retornem às circulação sanguínea. Conforme descrito pelo presente, a unidade de reabsorção do novo dispositivo microfluídico revelado pelo presente compreende uma barreira que permite a reabsorção de fluidos do segundo circuito (circuito urinário) para o primeiro circuito (circuito sanguíneo). Em diversas realizações da presente revelação, a barreira de reabsorção compreendida pela unidade de reabsorção pode ser uma barreira mecânica (porosa) que simule a barreira de reabsorção. Preferencialmente, a barreira de reabsorção é uma barreira biológica, mais preferencialmente a barreira biológica de reabsorção compreende células do túbulo renal (ou células renais tubulares). Mais especificamente, a barreira biológica de reabsorção é uma barreira de células renais tubulares (reabsorção) que retorna água, sal e solutos (este último incluindo proteínas) para o primeiro circuito (circuito sanguíneo). Conforme descrito pelo presente, a reabsorção pode ser considerada o fluxo do filtrado glomerular da barreira de reabsorção (especificamente das células tubulares) para o primeiro circuito (circuito sanguíneo), permitindo assim a passagem seletiva de determinadas substâncias, em particular água, sal e solutos, de volta ao primeiro circuito (circuito sanguíneo). Em diversas realizações, a célula renal tubular pode ser considerada como célula renal tubular proximal.

[0040] O segundo circuito do novo dispositivo microfluídico revelado pelo presente documento pode compreender um compartimento, que não serve como um compartimento para cultura celular, mas que serve como um compartimento de reservatório (de meio). Preferencialmente, este compartimento de reservatório (de meio) pode servir exclusivamente como um “reservatório de amostragem” ou “câmara/compartimento de amostragem” para coletar amostras do segundo circuito, e/ou que sirva exclusivamente como um “reservatório de amostra” ou “câmara/compartimento de amostra” para adição de uma amostra teste para o segundo circuito do dispositivo microfluídico. Da mesma forma, em realizações preferidas, o segundo circuito compreende nenhum compartimento para cultura celular além dos dois compartimentos/unidades que compõem a unidade de filtração e a unidade de reabsorção, apesar de incluir um compartimento de reservatório (adicional), que serve para coletar amostras (compartimento de amostragem) do segundo circuito, e/ou que serve como um “reservatório de amostra” ou “câmara/compartimento de amostra” para adição de uma amostra teste ao segundo circuito do sistema microfluídico.

[0041] O compartimento de reservatório pode ser usada para adição de uma solução nutriente ao sistema, razão pela qual também é denominado um compartimento de reservatório de meio. Da mesma forma, o compartimento de reservatório pode servir a três funções, amostragem e alimentação e adição das amostras testes, no entanto, não serve como um compartimento para cultura celular que transporta um equivalente de órgão.

[0042] O primeiro circuito do novo dispositivo microfluídico revelado pelo presente pode compreender, da mesma forma, um compartimento, que não serve como um compartimento para cultura celular, mas que serve como um compartimento de reservatório (de meio). Preferencialmente, este compartimento de reservatório (de meio) pode servir exclusivamente para coletar amostras do primeiro circuito. Além disso, este compartimento de reservatório pode ser usado para adição de uma solução nutriente ao sistema, razão pela qual pode ser denominado compartimento de reservatório de meio. Assim, o compartimento de reservatório do primeiro circuito pode servir para ambas as funções, amostragem e alimentação, no entanto, não serve como compartimento para cultura celular que transporta um equivalente de órgão. Assim, em realizações preferidas, o primeiro circuito pode compreender um compartimento de reservatório além do um ou mais compartimentos para cultura celular, o qual serve para coletar amostras (compartimento de amostragem) do primeiro circuito e/ou para adicionar meio (solução nutriente) ao sistema.

[0043] Em realizações preferidas da presente revelação, pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito do novo dispositivo microfluídico compreende uma função hepática que simule um tecido (“equivalente hepático”).

[0044] Em outras realizações preferidas da presente revelação, pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito do novo dispositivo microfluídico compreende um equivalente hepático, e pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito compreende um equivalente intestinal. Esta realização é particularmente útil para realizar a criação de perfil de ADME devido à microplaqueta microfluídica compreender assim equivalentes de órgãos intestinal e hepático (primeiro circuito), e renal (segundo circuito). Conforme descrito pelo presente, o equivalente de órgãos intestinal, hepático e renal pode ser considerado equivalente de órgãos de “ADME”. Em diversas realizações, o novo dispositivo microfluídico pode compreender um ou mais equivalentes de órgãos adicional “não ADME”, que são diferentes dos equivalentes de órgãos de “ADME” intestinal, hepático e renal. Em diversas realizações, estes equivalentes de órgãos adicionais “não ADME” incluem, entre outros, um equivalente neuronal, um equivalente cutâneo ou um equivalente do trato respiratório (preferencialmente equivalente pulmonar).

[0045] Ainda em outras realizações preferidas da presente revelação, pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito do novo dispositivo microfluídico compreende um equivalente hepático, e pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito compreende um equivalente intestinal, e pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito compreende um equivalente neuronal, estabelecendo assim uma microplaqueta de ADME-N.

[0046] Em outras realizações preferidas da presente revelação, pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito do novo dispositivo microfluídico compreende um equivalente hepático, e pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito compreende um equivalente cutâneo. Esta também é útil para realizar a criação de perfil de ADME devido à microplaqueta microfluídica que compreende assim equivalentes de órgãos cutâneo e hepático (primeiro circuito), e renal (segundo circuito). A administração de uma amostra teste (droga teste) é então realizada por meio do equivalente cutâneo. Estas realizações são particularmente úteis para o teste de produtos cosméticos e/ou de consumo, inclusive cremes.

[0047] Em outras realizações preferidas da presente revelação, pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito do novo dispositivo microfluídico compreende um equivalente hepático, e pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito compreende um equivalente de trato respiratório, especificamente um equivalente pulmonar. Esta realização também é útil para realizar a criação de perfil de ADME devido à microplaqueta microfluídica que compreende então equivalentes de órgãos do trato respiratório/pulmonar e hepático (primeiro circuito), e renal (segundo circuito). A administração de uma amostra teste (droga teste) é então realizada por meio do equivalente de trato respiratório/pulmonar. Estas realizações são particularmente úteis para o teste de substâncias, inclusive drogas, pretendidas para aplicação por meio do trato respiratório/pulmão.

[0048] Em diversas outras realizações da presente revelação, pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito do novo dispositivo microfluídico compreende um equivalente hepático, e pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito compreende um equivalente intestinal, e pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito compreende um equivalente cutâneo.

[0049] Em diversas outras realizações da presente revelação, pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito do novo dispositivo microfluídico compreende um equivalente hepático, e pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito compreende um equivalente intestinal, e pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito compreende um equivalente do trato respiratório, preferencialmente pulmonar.

[0050] Ainda em outras realizações da presente revelação, pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito do novo dispositivo microfluídico compreende um equivalente hepático, e pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito compreende um equivalente intestinal, e pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito compreende um equivalente cutâneo, e pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito compreende um equivalente do trato respiratório, preferencialmente pulmonar.

[0051] Ainda em outras realizações da presente revelação, pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito do novo dispositivo microfluídico compreende um equivalente hepático, e pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito compreende um equivalente intestinal, e pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito compreende um equivalente cutâneo, e pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito compreende um equivalente do trato respiratório, preferencialmente pulmonar, e pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito compreende um equivalente neuronal.

[0052] Em diversas realizações da presente revelação, pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito do novo dispositivo microfluídico compreende um equivalente hepático, e pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito compreende um equivalente intestinal, pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito compreende um equivalente neuronal, e pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito compreende um equivalente cutâneo.

[0053] Em diversas realizações da presente revelação, pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito do novo dispositivo microfluídico compreende um equivalente hepático, e pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito compreende um equivalente intestinal, pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito compreende um equivalente neuronal, e pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito compreende um equivalente do trato respiratório, preferencialmente pulmonar.

[0054] Os equivalentes de órgãos preferidos incluem equivalente renal, equivalente hepático, equivalente intestinal, preferencialmente equivalente do intestino delgado, equivalente neuronal (cerebral), equivalente do trato respiratório/pulmonar, e equivalente cutâneo. No caso de equivalente dos rins (ou renal), o equivalente significa especificamente um equivalente do glomérulo e túbulo. mais especificamente, estes equivalentes de glomérulo e túbulo são dispostos em umidades separadas (unidade de filtração e unidade de reabsorção, respectivamente) do segundo circuito do novo dispositivo microfluídico provido pelo presente.

[0055] Conforme descrito pelo presente, um “compartimento para cultura celular” compreende ou contém um equivalente de órgão, que abrange células e tecidos que simulam a função do órgão. Portanto, em diversas realizações, os termos “equivalente de órgão” e “células/tecidos que simulam a função do órgão” podem ser usados de forma intercambiável aqui.

[0056] Em diversas realizações, um equivalente de órgão ou um tecido que simule a função de um órgão é um tecido de órgão primário, por exemplo, um tecido hepático primário ou um tecido intestinal primário. Preferencialmente, o tecido de órgão primário compreende células epiteliais do respectivo órgão, ou seja, células epiteliais, por exemplo, do trato gastrointestinal, da pele ou do trato respiratório.

[0057] Em diversas realizações, um tecido que simule a função de um órgão pode ser um tecido compreendendo células epiteliais do respectivo órgão, ou seja, células epiteliais, por exemplo, do trato gastrointestinal, da pele ou do trato respiratório. Em diversas outras realizações, um tecido que simule a função de um órgão pode ser um tecido compreendendo células e uma linhagem celular, inclusive células obteníveis de uma linhagem celular comercialmente disponível.

[0058] Em diversas outras realizações, um tecido que simule a função de um órgão é um tecido compreendendo células derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Especificamente, as células podem ser derivadas o ou seja, diferenciadas) de uma iPSC de um único doador o ou seja, uma e a mesma), que, por sua vez, foi obtida oou seja, reprogramada) de um único tipo de célula somática. Por exemplo, as células podem ser derivadas o ou seja, diferenciadas) de uma única iPSC o ou seja, uma e a mesma), que foi obtida oou seja, reprogramada) de, por exemplo, uma célula cutânea somática, leucócitos, célula renal, adipócitos ou similares.

[0059] Conforme descrito em outra parte do presente documento, as células ou tecido que simule a função de um órgão incluem organoides e esferoides. Portanto, em diversas realizações, um equivalente de órgão significa especificamente um organoide ou esferoide de uma determinada funcionalidade de órgão, por exemplo, um organoide de células intestinais ou hepatócitos, ou um esferoide de células intestinais ou hepatócitos.

[0060] As células, tecidos e/ou órgãos do dispositivo microfluídico provido pela presente revelação podem ser modeladas em uma complexidade bidimensional (2D) , tridimensional (3D) ou organotípica. 2D significa a suspensão de culturas de célula monocamada, ao passo que 3D inclui, por exemplo, culturas multicamadas de diferente geometria, inclusive, por exemplo, organoides e esferoides. Organotípico diferente do 3D ao capturar características adicionais da arquitetura do órgão in vivo.

[0061] Em diversas realizações, um compartimento para cultura celular compreendendo um equivalente de órgão é um compartimento para cultura celular que compreende um organoide. Conforme descrito pelo presente, o termo “organoide” pode ser considerado por significar ou representar o menor órgão funcional ou unidade tecidual. publicou-se uma seleção de histologias organoides, todas com funcionalidade relevante e geometria conglomerada altamente variável para 15 órgãos humanos principais por Marx et al. (Marx et al. 2012, Altern Lab Anim 40, 235-257). A revelação deste é explicitamente incorporada pelo presente documento por referência. Conforme descrito ainda pelo presente documento, um organoide de acordo com a presente revelação significa especificamente um organoide de células derivadas de iPSC, no entanto, sem se limitar a estes. Conforme descrito ainda pelo presente documento, um organoide pode ser considerado uma cultura celular/tecidual, que simule a função do órgão. Conforme descrito ainda pelo presente documento, um organoide pode ser tipicamente caracterizado por quaisquer das características a seguir, sem se limitar a: (i) (pelo menos) constructo ou estrutura multicelular tridimensional; (ii) coleção de tipos de célula específica ao órgão; (iii) se gerado a partir de células-tronco (preferencialmente, iPSCs), geralmente recapitula o programa de organogênese de desenvolvimento; (iv) auto-organização (capacidade das células de se autoagrupar e/ou auto-organizar em tecidos).

[0062] Em diversas realizações, os organoides são incorporados em uma matriz extracelular, preferencialmente em uma matriz extracelular de gel, mais preferencialmente em um extrato de matriz extracelular similar à membrana basal (tipicamente reorganização do ambiente extracelular tecidual). Em diversas realizações, o extrato de matriz extracelular (gel) similar à membrana basal compreende uma mistura proteica gelatinosa. Preferencialmente, a mistura proteica gelatinosa é uma mistura de proteína gelatinosa secretada pelas células de sarcoma murino de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Mais preferencialmente, a matriz extracelular (gel) similar à membrana basal e a matriz de membrana basal Matrigel (Corning). Em diversas realizações da presente revelação, a matriz extracelular (gel) é um hidrogel. Em diversas realizações da presente revelação, a matriz extracelular (gel) é um colágeno, agarose, aginato ou hidrogel Matrigel . Em diversas outras realizações, o hidrogel é um hidrogel sintético.

[0063] Em diversas realizações, um compartimento para cultura celular compreendendo um equivalente de órgão é um compartimento para cultura celular que compreende esferoides que simulam a função do órgão. Conforme descrito pelo presente, um esferoide, de acordo com a presente revelação, significa especificamente um esferoide de células derivadas de iPSC, no entanto, sem se limitar a estas. Conforme descrito ainda pelo presente, um esferoide pode ser considerado uma agregação ou autoagrupamento de (grupos esféricos de) células, reorganização atenta de tecidos de órgão in vivo. Um esferoide possui, como um organoide, uma arquitetura estrutural tridimensional. Em comparação aos organoides, considera-se que há uma ordem mais elevada de auto-organização em organoides em oposição às culturas de esferoides. Em diversas realizações, um organoide pode ser considerado uma cultura celular/tecidual que simule a função do órgão.

[0064] Os organoides preferidos incluem organoide renal, organoide hepático, organoide intestinal, preferencialmente organoide do intestino delgado, organoide neuronal (cerebral), organoide do trato respiratório/pulmonar e organoide cutâneo. No caso de um organoide dos rins (ou renal), o organoide significa especificamente um organoide do glomérulo e túbulo. mais especificamente, estes organoides do glomérulo e túbulo são dispostos em unidades separadas (unidade de filtração e unidade de reabsorção, respectivamente) do segundo circuito do novo dispositivo microfluídico provido pelo presente documento.

[0065] Em diversas realizações, a unidade de filtração e a unidade de reabsorção do segundo circuito podem ser consideradas equivalentes dos rins ou renais. Preferencialmente, o equivalente dos rins ou renal significa um organoide dos rins ou renal. Conforme descrito pelo presente, um organoide dos rins ou renal significa preferencialmente organoides de podócitos e células tubulares renais, mais preferencialmente organoides de podócitos derivados de iPSC e células tubulares renais derivadas de iPSC. Da mesma forma, um organoide hepático significa preferencialmente um organoide de hepatócitos, mais preferencialmente organoides de hepatócitos derivados de iPSC. Assim, um organoide do intestino (delgado) significa preferencialmente um organoide de células do intestino (delgado), mais preferencialmente um organoide de células do intestino (delgado) derivadas de iPSC. Da mesma forma, um organoide neuronal significa preferencialmente um organoide de células neuronais, mais preferencialmente um organoide de células neuronais derivadas de iPSC. Assim, o organoide do trato respiratório (preferencialmente pulmão) significa um organoide de células do trato respiratório, preferencialmente células pulmonares, mais preferencialmente células epiteliais pulmonares. Preferencialmente, as células do trato respiratório ou as células pulmonares são células derivadas de iPSC do trato respiratório ou células pulmonares derivadas de iPSC, respectivamente.

[0066] Em diversas realizações da presente revelação, o novo dispositivo microfluídico possui uma disposição de compartimentos para cultura celular em conformidade com o layout mostrado na Fig. 1, no entanto, sem se limitar a estes. por conseguinte, em diversas realizações preferidas, os compartimentos para cultura celular compreendendo o equivalente intestinal e o equivalente hepático são dispostos de modo que o último (“equivalente hepático”) esteja localizado a jusante do primeiro (“equivalente intestinal”) (em conformidade com o layout para o “circuito sanguíneo” representado na Fig. 1, no entanto, sem se limitar a este). Preferencialmente, os compartimentos para cultura celular compreendendo o “equivalente hepático” e o “equivalente intestinal” são dispostos em um microcanal separado, o qual é um ramo da estrutura de microcanal principal (em conformidade com o layout para o “circuito sanguíneo” representado na Fig. 1, no entanto, sem se limitar a este). Preferencialmente, nenhum outro compartimento para cultura celular está localizado entre os compartimentos para cultura celular do equivalente intestinal e do equivalente hepático. Em diversas realizações, o primeiro e segundo circuitos podem compreender uma rede microfluídica ramificada (ou rede ramificada de canais microfluídicos). Em outras realizações preferidas, o novo dispositivo microfluídico possui uma disposição de compartimentos para cultura celular de modo que uma compartimento separado para cultura celular, além dos compartimentos para cultura celular compreendendo o “equivalente hepático” e o “equivalente intestinal” e compreendendo um equivalente de órgão adicional diferente do “equivalente hepático” e do “equivalente intestinal”, seja disposto paralelo aos compartimentos para cultura celular compreendendo o “equivalente hepático” e o “equivalente intestinal”. Mais preferencialmente, este compartimento adicional para cultura celular é disposto em um ramo de microcanal separado disposto paralelo ao ramo de microcanal compreendendo os compartimentos para cultura celular compreendendo o “equivalente hepático” e o “equivalente intestinal” (em conformidade com o layout para o “circuito sanguíneo” representado na Fig. 1, no entanto, sem se limitar a este). Preferencialmente, o compartimento adicional para cultura celular compreendendo um equivalente adicional de órgão diferente do “equivalente hepático” e do “equivalente intestinal” compreende um equivalente neuronal.

[0067] No caso de o dispositivo microfluídico conter um reservatório de meio separado ou reservatório de amostragem, este é preferencialmente disposto na estrutura de microcanal principal, ou seja, não é disposto em uma estrutura de microcanal de ramificação (em conformidade com o layout para o “circuito sanguíneo” representado na Fig. 1, no entanto, sem se limitar a este).

[0068] Além disso, no caso de o dispositivo microfluídico conter uma microbomba, a microbomba é disposta preferencialmente na estrutura de microcanal principal, ou seja, não é disposto em uma estrutura de microcanal de ramificação (em conformidade com o layout para o “circuito sanguíneo” representado na Fig. 1, no entanto, sem se limitar a este).

[0069] Em diversas realizações preferidas, o segundo circuito não mostra uma rede ramificada, mas, ao contrário, é um circuito não ramificado ou sistema de circulação. Os termos “circuito” e “sistema de circulação” podem ser usados de forma intercambiável no presente documento.

[0070] O novo sistema microfisiológico preferencialmente é um sistema de canal fechado. Assim, o primeiro e o segundo circuitos do novo dispositivo microfluídico formam um circuito fechado, mais especificamente um circuito fechado de canais microfluídicos. Mais especificamente, o novo sistema microfisiológico pode ser considerado um sistema microfisiológico autossuportado ou autocontido. O sistema de canal fechado que inclui as duas umidades de função renal (unidade de filtração e unidade de reabsorção) possibilita especificamente a avaliação de toxicidade renal de drogas teste. Em realizações preferidas, o sistema microfisiológico ou dispositivo microfluídico é operado com uma solução líquida que simula sangue e/ou uma solução líquida que simula urina no segundo circuito.

[0071] Em diversos aspectos da presente revelação, pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito do novo dispositivo microfluídico compreende um equivalente hepático derivado de iPSC, e pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito compreende um equivalente intestinal derivado de iPSC, e pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito compreende um equivalente neuronal derivado de iPSC, e o segundo circuito do novo dispositivo microfluídico compreende células epiteliais do túbulo proximal renal (RPTEC), mais especificamente RPTECs cultivadas na unidade de reabsorção. Preferencialmente, o pelo menos um compartimento para cultura celular compreendendo um equivalente intestinal derivado de iPSC compreende organoides de intestinal células derivadas de iPSC. Mais preferencialmente, os organoides de células intestinais derivadas de iPSC são incorporadas em uma matriz extracelular, preferencialmente em uma matriz extracelular de gel, mais preferencialmente em um extrato de matriz extracelular (gel) similar à membrana basal (tipicamente remontando o ambiente extracelular tecidual). Em diversas realizações, o extrato de matriz extracelular (gel) similar à membrana basal compreende uma mistura proteica gelatinosa. Preferencialmente, a matriz extracelular similar à membrana basal é a matriz de membrana basal Matrigel (Corning).

[0072] Em realizações preferidas adicionais, o pelo menos um compartimento para cultura celular compreendendo um equivalente intestinal derivado de iPSC, especificamente organoides de células intestinais derivadas de iPSC, compreende, além disso, fibroblastos e células endoteliais, mais preferencialmente fibroblastos derivados de iPSC e células endoteliais derivadas de iPSC, ou fibroblastos derivados de iPSC e células endoteliais microvasculares primárias. As células endoteliais microvasculares primárias ou células endoteliais derivadas de iPSC são preferencialmente cultivadas no lado basolateral do compartimento para cultura celular.

[0073] Além disso, o pelo menos um compartimento para cultura celular compreendendo um equivalente neuronal derivado de iPSC compreende preferencialmente esferoides neuronais derivados de iPSC. Mais preferencialmente, o pelo menos um compartimento para cultura celular compreendendo um equivalente neuronal derivado de iPSC, especificamente esferoides neuronais derivados de iPSC, compreende uma barreira hematoencefálica bioimpressa. Mais especificamente, o pelo menos um compartimento para cultura celular compreendendo um equivalente neuronal derivado de iPSC, especificamente esferoides neuronais derivados de iPSC, é enriquecido com células endoteliais, preferencialmente células endoteliais derivadas de iPSC, bioimpressas sob os esferoides neuronais.

[0074] Ademais, o pelo menos um compartimento para cultura celular compreendendo um equivalente hepático derivado iPSC compreende preferencialmente esferoides de hepatócitos derivados de iPSC. Mais preferencialmente, o pelo menos um compartimento para cultura celular compreendendo um equivalente hepático derivado de iPSC, especificamente esferoides de hepatócitos derivados de iPSC, compreende ainda fibroblastos, preferencialmente fibroblastos derivados de iPSC. Em realizações preferidas, o equivalente hepático derivado de iPSC é alcançado ao colocar esferoides de hepatócitos derivados de iPSC com fibroblastos derivados de iPSC no respectivo compartimento para cultura celular.

[0075] Em diversas realizações, as RPTECs compreendem uma linhagem celular epitelial tubular proximal renal.

[0076] Em diversos aspectos da presente revelação, pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito do novo dispositivo microfluídico compreende tecido hepático primário, e pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito compreende um tecido intestinal primário, preferencialmente um tecido de intestino delgado primário, e pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito compreende um equivalente neuronal derivado de iPSC, e o segundo circuito do novo dispositivo microfluídico compreende células epiteliais tubulares proximais renais (RPTECs), mais especificamente as RPTECs cultivadas na unidade de reabsorção. Em diversas realizações, o tecido hepático primário compreende hepatócitos (humanos) primários. o tecido hepático primário pode ser um modelo hepático comercialmente disponível, por exemplo, o 3D InSight™ Human Liver Microtissues XL, InSphero. Em diversas realizações, o tecido hepático primário ou modelo hepático pode compreender 50 esferoides, cada um contendo 3.000 hepatócitos primários. Além disso, em realizações preferidas, o tecido intestinal primário compreende células endoteliais epiteliais intestinais derivada de célula (humana) primária, e mais preferencialmente compreende ainda fibroblastos (humanos). O tecido intestinal primário pode ser um modelo intestinal comercialmente disponível, por exemplo, o modelo tecidual 3D EpiIntestinal (MatTek Corporation).

[0077] Além disso, o pelo menos um compartimento para cultura celular compreendendo um equivalente neuronal derivado de iPSC compreende preferencialmente esferoides neuronais derivados de iPSC. Mais preferencialmente, o pelo menos um compartimento para cultura celular compreendendo um equivalente neuronal derivado de iPSC, especificamente esferoides neuronais derivados de iPSC, compreende uma barreira hematoencefálica bioimpressa. Mais especificamente, o pelo menos um compartimento para cultura celular compreendendo um equivalente neuronal derivado de iPSC, especificamente esferoides neuronais derivados de iPSC, é enriquecido com células endoteliais, preferencialmente células endoteliais derivadas de iPSC, que são bioimpressas sob os esferoides neuronais.

[0078] Em diversas realizações, as RPTECs compreende uma linhagem celular epitelial tubular proximal renal.

[0079] Em diversos aspectos da presente revelação, pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito do novo dispositivo microfluídico compreende um equivalente hepático derivado de iPSC, e pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito compreende um equivalente intestinal derivado de iPSC, e pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito compreende um equivalente neuronal derivado de iPSC, e o segundo circuito do novo dispositivo microfluídico compreende um equivalente renal derivado de iPSC. Preferencialmente, o pelo menos um compartimento para cultura celular compreendendo um equivalente intestinal derivado de iPSC compreende organoides de células intestinais derivadas de iPSC. Mais preferencialmente, os organoides de células intestinais derivadas de iPSC são incorporados em uma matriz extracelular, preferencialmente em uma matriz extracelular em gel, mais preferencialmente em um extrato de matriz extracelular (gel) similar à membrana basal (remontando tipicamente o ambiente extracelular tecidual). Em diversas realizações, o extrato de matriz extracelular (gel) similar à membrana basal compreende uma mistura proteica gelatinosa. Preferencialmente, a matriz extracelular similar à membrana basal é a matriz de membrana basal Matrigel (Corning).

[0080] Em realizações preferidas adicionais, o pelo menos um compartimento para cultura celular compreendendo um equivalente intestinal derivado de iPSC, especificamente organoides de células intestinais derivadas de iPSC, compreende ainda fibroblastos e células endoteliais, mais preferencialmente fibroblastos derivados de iPSC e células endoteliais derivadas de iPSC, ou fibroblastos derivados de iPSC e células endoteliais microvasculares primárias. As células endoteliais microvasculares primárias ou células endoteliais derivadas de iPSC são cultivadas preferencialmente no lado basolateral do compartimento para cultura celular.

[0081] Além disso, o pelo menos um compartimento para cultura celular compreendendo um equivalente neuronal derivado de iPSC compreende preferencialmente esferoides neuronais derivados de iPSC. Mais preferencialmente, o pelo menos um compartimento para cultura celular compreendendo um equivalente neuronal derivado de iPSC, especificamente esferoides neuronais derivados de iPSC, compreende uma barreira hematoencefálica bioimpressa. Mais especificamente, o pelo menos um compartimento para cultura celular compreendendo um equivalente neuronal derivado de iPSC, especificamente esferoides neuronais derivados de iPSC, é enriquecido com células endoteliais, preferencialmente células endoteliais derivadas de iPSC, cultivadas no lado basolateral do compartimento para cultura celular.

[0082] Ademais, o pelo menos um compartimento para cultura celular compreendendo um equivalente hepático derivado de iPSC compreende preferencialmente esferoides de hepatócitos derivados de iPSC. Mais preferencialmente, o pelo menos um compartimento para cultura celular compreendendo um equivalente hepático derivado de iPSC, especificamente esferoides de hepatócitos derivados de iPSC, compreende ainda fibroblastos, preferencialmente fibroblastos derivados de iPSC. Em realizações preferidas, o equivalente hepático derivado de iPSC é alcançado ao colocar esferoides de hepatócitos derivados de iPSC com fibroblastos derivados de iPSC no respectivo compartimento para cultura celular.

[0083] Em diversos aspectos da presente revelação, pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito do novo dispositivo microfluídico compreende tecido hepático primário, e pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito compreende um tecido intestinal primário, preferencialmente um tecido primário do intestinal delgado, e pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito compreende um tecido neuronal primário, e o segundo circuito do novo dispositivo microfluídico compreende um tecido renal primário, preferencialmente um tecido renal primário na unidade de reabsorção, mais preferencialmente um tecido tubular primário (célula epitelial) na unidade de reabsorção, e um tecido glomerular primário na unidade de filtração. Preferencialmente, o tecido renal primário compreende células epiteliais renais, mais especificamente células epiteliais tubulares proximais renais (RPTECs), em que as células epiteliais renais ou RPTECs podem ser cultivadas na unidade de reabsorção, e o tecido glomerular primário compreende podócitos, que pode ser cultivado na unidade de filtração. Em diversas realizações, o tecido hepático primário compreende hepatócitos primários (humanos). O tecido hepático primário pode ser um modelo hepático comercialmente disponível, por exemplo, o 3D InSight™ Human Liver Microtissues XL, InSphero. Além disso, em realizações preferidas, o tecido intestinal primário compreende células endoteliais e epiteliais intestinais derivadas de célula primária (humana), e mais preferencialmente compreende ainda fibroblastos (humanos). O tecido intestinal primário pode ser um modelo intestinal comercialmente disponível, por exemplo, o modelo tecidual 3D EpiIntestinal® (MatTek Corporation).

[0084] Além disso, o tecido neuronal primário preferencialmente compreende células neuronais primárias. Ainda em realizações preferidas adicionais, o pelo menos um compartimento para cultura celular compreendendo o tecido neuronal primário, especificamente células neuronais primárias, compreende ainda uma barreira hematoencefálica bioimpressa. Mais especificamente, o pelo menos um compartimento para cultura celular compreendendo o tecido neuronal primário, especificamente células neuronais primárias, é enriquecido com células endoteliais, que podem ser cultivadas no lado basolateral do compartimento para cultura celular, ou são bioimpressos sob os esferoides neuronais.

[0085] Em diversos aspectos da presente revelação, pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito do novo dispositivo microfluídico compreende um organoide hepático, e pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito compreende um organoide intestinal, preferencialmente um organoide do intestino delgado, e o segundo circuito do novo dispositivo microfluídico compreende um organoide renal na unidade de reabsorção e/ou na unidade de filtração. Em diversas realizações, pelo menos um compartimento adicional para cultura celular do primeiro circuito compreende ainda um organoide adicional, que é diferente do organoide hepático, do organoide intestinal (inclusive o organoide do intestino delgado) e do organoide renal. Este organoide adicional pode ser considerado um organoide “não ADME”, enquanto o organoide hepático, o organoide intestinal (inclusive o organoide de intestino delgado) e o organoide renal podem ser considerados organoides “ADME”. Em diversas realizações, este organoide adicional (não ADME) pode ser qualquer entre um organoide neuronal, um organoide cutâneo ou um organoide do trato respiratório (preferencialmente pulmonar). Em diversas realizações, pelo menos dois compartimentos adicionais para cultura celular do primeiro circuito compreendem ainda dois organoides “não ADME” adicionais (um organoide por compartimento adicional para cultura celular), que são diferentes do organoide hepático, do organoide intestinal (inclusive o organoide de intestino delgado) e do organoide renal. Em diversas realizações, os dois organoides (não ADME) adicionais podem ser selecionado a partir de qualquer um entre um organoide neuronal, um organoide cutâneo e/ou um organoide de trato respiratório (preferencialmente pulmonar). Ainda em outras realizações, pelo menos três compartimentos adicionais para cultura celular do primeiro circuito compreendem ainda três organoides “não ADME” adicionais (um organoide por compartimento adicional para cultura celular). Em diversas realizações, os três organoides “não ADME” adicionais são um organoide neuronal, um organoide cutâneo e/ou um organoide do trato respiratório (preferencialmente pulmonar). Preferencialmente, os organoides são organoides de células de órgão derivado de iPSC. Especificamente, o organoide hepático é preferencialmente um organoide de hepatócitos derivados de iPSC, e o organoide intestinal é preferencialmente um organoide de células intestinais derivadas de iPSC, mais preferencialmente um organoide de células do intestino delgado derivadas de iPSC, e o organoide neuronal é preferencialmente um organoide de células neuronais derivadas de iPSC, e o organoide renal é preferencialmente um organoide de células renais derivadas de iPSC.

[0086] Em diversos aspectos da presente revelação, pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito do novo dispositivo microfluídico compreende um esferoide hepático, e pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito compreende um esferoide intestinal, preferencialmente um esferoide do intestino delgado, e o segundo circuito do novo dispositivo microfluídico compreende um esferoide renal na unidade de reabsorção e/ou na unidade de filtração. Em diversas realizações, pelo menos um compartimento adicional de para cultura do primeiro circuito compreende ainda um esferoide adicional, o qual é diferente do esferoide hepático, do esferoide intestinal (inclusive o esferoide de intestino delgado) e do esferoide renal. Este esferoide adicional pode ser considerado esferoide “não ADME”, enquanto o esferoide hepático, o esferoide intestinal (inclusive o esferoide do intestino delgado) e o esferoide renal podem ser considerados esferoides “ADME”. Em diversas realizações, este esferoide (não ADME) adicional pode ser qualquer um entre um esferoide neuronal, um esferoide cutâneo e/ou um esferoide do trato respiratório (preferencialmente pulmonar). Em diversas realizações, pelo menos dois compartimentos adicionais para cultura celular do primeiro circuito compreende ainda dois esferoides “não ADME” adicionais (um esferoide por compartimento adicional para cultura celular), que são diferentes do esferoide hepático, do esferoide intestinal (inclusive o esferoide do intestino delgado) e do esferoide renal. Em diversas realizações, os dois esferoides (não ADME) adicionais podem ser selecionados a partir de qualquer um entre um esferoide neuronal, um esferoide cutâneo e/ou um esferoide do trato respiratório (preferencialmente pulmonar). Ainda em outras realizações, pelo menos três compartimentos adicionais para cultura celular do primeiro circuito compreende ainda três esferoides “não ADME” adicionais (um esferoide por compartimento adicional para cultura celular). Em diversas realizações, os três esferoides “não ADME” adicionais são um esferoide neuronal, um esferoide cutâneo e/ou um esferoide do trato respiratório (preferencialmente pulmonar). Preferencialmente, os esferoides são esferoides de células de órgão derivado de iPSC. Especificamente, o esferoide hepático é preferencialmente um esferoide de hepatócitos derivados de iPSC, e o esferoide intestinal é preferencialmente um esferoide de células intestinais derivadas de iPSC, mais preferencialmente um esferoide de células do intestino delgado derivadas de iPSC, e o esferoide neuronal é preferencialmente é um esferoide de células neuronais derivadas de iPSC, e o esferoide renal é preferencialmente um esferoide de células renais derivadas de iPSC.

[0087] Em diversas realizações, um compartimento para cultura celular pode compreender um ou mais equivalentes de órgãos, por exemplo, um equivalente neuronal ao longo ou em combinação com um equivalente intestinal. Em diversas outras realizações, cada compartimento para cultura celular (ou um único compartimento para cultura celular) pode compreender apenas um equivalente de órgão, seguindo o princípio de um equivalente de órgão individual por compartimento para cultura celular. Por outro lado, se, por exemplo, pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do primeiro circuito do novo dispositivo microfluídico compreende um equivalente hepático, isto significa que pode haver dois compartimentos para cultura celular do primeiro circuito, cada um compreendendo um equivalente hepático. No entanto, em realizações preferidas, o novo dispositivo microfluídico compreende cada equivalente de órgão apenas uma vez, seguindo o princípio de um equivalente de órgão individual por dispositivo microfluídico (ou por sistema microfisiológico).

[0088] A presente revelação provê o uso de um novo dispositivo microfluídico descrito pelo presente documento no teste analítico, diagnóstico, pesquisa, validação alvo, estudos de toxicidade, engenharia tecidual, manufatura tecidual, triagem de droga e/ou análise farmacocinética/farmacodinâmica.

[0089] A presente revelação possibilita a operação de um sistema microfisiológico e estabelece a assim denominada criação de perfil de ADME com base no novo dispositivo microfluídico provido pelo presente documento. Da mesma forma, a presente revelação provê um método de operação de um sistema microfisiológico que faz uso dos novos dispositivos microfluídicos descritos pelo presente documento, e provê ainda um ensaio de ADME (absorção, distribuição, metabolismo, excreção) compreendendo os novos dispositivos microfluídicos providos pela presente revelação. Ainda descrito no presente documento, encontra-se um ensaio de ADMET (absorção, distribuição, metabolismo, excreção, toxicidade) compreendendo os novos dispositivos microfluídicos descritos pelo presente documento.

[0090] Especificamente no processo de descoberta de medicamento, a criação de perfil de ADME in vitro (ou triagem) provê uma base para a seleção de novas entidades moleculares e faz com que os compostos que possuem perfis desejáveis de metabolismo medicamentoso, farmacocinética ou de segurança, que são necessários para a seleção de candidato medicamentoso e desenvolvimento pré-clínico e clínico de estágio tardio. O perfil (ou propriedades) de ADME(T) de uma droga (substância teste) permite que o desenvolvedor da droga compreende os dados de segurança e eficácia para aprovação regulatória.

[0091] No método de operação de um sistema microfisiológico, o tempo de cultura pode durar semanas ou mesmo meses, possibilitando o modelamento da doença e exposição da substância a dose repetida.

[0092] A presente revelação provê um método de realização da criação de perfil de ADME (absorção, distribuição, metabolismo, excreção) que faz uso do novo dispositivo microfluídico provido pela presente revelação. A presente revelação também provê um método de realização de uma criação de perfil de ADMET (absorção, distribuição, metabolismo, excreção, toxicidade) que faz uso do novo dispositivo microfluídico descrito pelo presente documento. Também descrito pelo presente documento, encontra-se um método de geração de um perfil de ADME, ou um perfil de ADMET de uma droga (teste) compreendendo a realização de uma triagem de ADME ou triagem de ADMET, respectivamente, usando o novo dispositivo microfluídico provido pela presente revelação.

[0093] O método de operação de um sistema microfisiológico, conforme descrito pelo presente documento, compreende preferencialmente a adição de forma seletiva de uma solução nutriente ao sistema microfisiológico por meio do compartimento para cultura celular compreendendo o equivalente do trato gastrointestinal, preferencialmente o equivalente intestinal, mais preferencialmente o equivalente do intestino delgado. O equivalente de órgão compreende preferencialmente tecido compreendendo células epiteliais do trato gastrointestinal, preferencialmente do intestino, ainda mais preferencialmente do intestino delgado. Para espelhar as condições fisiológicas in vivo, a presente revelação é preferencialmente a operação do sistema microfisiológico com adição de forma seletiva da solução nutriente ao sistema microfisiológico por meio do compartimento para cultura celular compreendendo o equivalente do trato gastrointestinal, preferencialmente o equivalente intestinal, mais preferencialmente o equivalente do intestino delgado.

[0094] Em diversas realizações, adiciona-se de forma seletiva uma solução nutriente ao sistema microfisiológico por meio do compartimento para cultura celular compreendendo o equivalente cutâneo e/ou equivalente de trato respiratório, mais especificamente equivalente pulmonar.

[0095] Conforme descrito pelo presente, uma solução nutriente compreende especificamente substâncias (nutrientes) que são essenciais para crescimento ou recuperação de as células ou um corpo (inclusive aminoácidos, sais (eletrólitos) e glicose), e calorias na forma de carboidratos. Especificamente, uma solução nutriente, conforme descrito pelo presente documento, é uma solução nutriente para proliferação celular. Conforme descrito pelo presente documento, os termos “solução nutriente” e “meio de cultura celular” podem ser usados aqui de forma intercambiável.

[0096] Surpreendentemente, verificou-se que as novas microplaquetas microfluídicas providas pelo presente podem estabelecer a homeostase no sistema microfisiológico. Isto foi demonstrado pelos níveis constantes de glicose e LDH (Fig. 3). Uma concentração constante de glicose sugere consumo constante e uma regulação ativa da glicose disponível. Os níveis de glicose foram atingidos em todos os compartimentos. Surpreendentemente, verificou-se ainda que a alimentação de forma seletiva através do equivalente intestinal (apicalmente através do equivalente intestinal) foi suficiente para fornecer o circuito “sanguíneo” e o circuito “urinário”. Além disso, a atividade de LDH demonstrou-se bastante constante durante os experimentos. Comparados à glicose, os níveis de LDH são diferentes em cada compartimento. A função de barreira do equivalente intestinal e do equivalente renal é mostrada pelas diferentes concentrações de LDH em todos os três “compartimentos” o ou seja, circuito sanguíneo -> reservatório de meio 1 ; urine circuito -> reservatório de meio 2; e compartimento intestinal). Assim, as barreiras diferenciam-se entre as substâncias de cruzamento. A penetração ativa ou passiva de glicose, embora mantenha outras substâncias, indica interações práticas entre os subconjuntos do sistema de microplaqueta.

[0097] Da mesma forma, a presente revelação provê um método de simulação de homeostase compreendendo a operação de um sistema microfisiológico compreendendo um primeiro circuito com um ou mais compartimentos para cultura celular e um segundo circuito compreendendo uma unidade de filtração e uma unidade de reabsorção, em que ambos os circuitos são conectados entre si por meio da unidade de filtração e da unidade de reabsorção. Em conformidade com as realizações (preferidas) descritas em outra parte do presente documento em relação ao novo dispositivo microfluídico, a unidade de filtração compreendida pelo segundo circuito do sistema microfisiológico compreende preferencialmente uma barreira de filtração que permite seletivamente a passagem de moléculas do primeiro circuito para o segundo circuito com base no tamanho e carga das moléculas. Mais preferencialmente, a barreira de filtração é uma barreira biológica, ainda mais preferencialmente em que a barreira biológica compreende podócitos.

[0098] Também em conformidade com as realizações (preferidas) descritas em outra parte do presente documento em relação ao novo dispositivo microfluídico, a unidade de reabsorção compreendida pelo segundo circuito do sistema microfisiológico compreende preferencialmente uma barreira que permite a reabsorção de fluido do segundo circuito para o primeiro circuito. Mais preferencialmente, a barreira de reabsorção é uma barreira biológica, ainda mais preferencialmente em que a barreira biológica compreende células do túbulo renal.

[0099] Em diversas realizações do novo método de simulação de homeostase, adiciona-se de forma seletiva uma solução nutriente ao sistema microfisiológico por meio do compartimento para cultura celular (do primeiro circuito) compreendendo o equivalente do trato gastrointestinal, mais especificamente o equivalente intestinal, ainda mais especificamente o equivalente de intestino delgado. Em diversas realizações, o equivalente de órgão compreende células epiteliais, ou tecido compreendendo células epiteliais, do trato gastrointestinal, preferencialmente do intestino, ainda mais preferencialmente do intestino delgado.

[00100] As realizações (preferidas) descritas pelo presente documento em relação ao novo dispositivo microfluídico aplicam-se também ao novo método de simulação de homeostase compreendendo um sistema microfisiológico conforme descrito pelo presente. Portanto, as realizações (preferidas) descritas em outra parte do presente documento em relação ao novo dispositivo microfluídico são também realizações preferidas em relação ao novo novel método de simulação de homeostase compreendendo a operação de um sistema microfisiológico. Mais especificamente, as realizações (preferidas) descritas em outra parte do presente documento em relação ao novo dispositivo microfluídico também são realizações preferidas do sistema microfisiológico compreendido pelo novo método de simulação de homeostase.

[00101] A presente revelação provê ainda um método de detecção de um analito em um sistema microfisiológico que faz uso de um novo dispositivo microfluídico descrito pelo presente documento, em que o método compreende a adição de uma amostra teste a um compartimento para cultura celular do primeiro circuito, preferencialmente em que o dito compartimento para cultura celular compreende um equivalente de órgão selecionado a partir de qualquer um entre o equivalente do trato gastrointestinal, mais especificamente equivalente intestinal, equivalente cutâneo e/ou equivalente de trato respiratório, mais especificamente equivalente pulmonar. O equivalente de órgão compreende preferencialmente tecido compreendendo células epiteliais do trato gastrointestinal, da pele ou do trato respiratório. Em realizações preferidas, adiciona-se uma amostra teste a um compartimento para cultura celular compreendendo o equivalente do trato gastrointestinal, mais especificamente o equivalente intestinal. Mais preferencialmente, a amostra teste é adicionada de forma seletiva ao compartimento para cultura celular compreendendo o equivalente do trato gastrointestinal, especificamente o equivalente intestinal, mais especificamente o equivalente do intestino delgado.

[00102] Em diversas realizações, adiciona-se de forma seletiva uma amostra teste ao sistema microfisiológico por meio do compartimento para cultura celular compreendendo o equivalente cutâneo e/ou equivalente de trato respiratório, mais especificamente equivalente pulmonar.

[00103] Em diversas outras realizações, adiciona-se de forma seletiva uma amostra teste ao sistema microfisiológico por meio de uma cavidade diferente dos compartimentos para cultura celular compreendendo o equivalente de órgãos. esta cavidade pode ser o “reservatório de meio” do circuito sanguíneo e/ou do circuito urinário. Conforme descrito em outra parte do presente documento, este “reservatório de meio” destina-se a ser um “reservatório de amostragem” ou “câmara/compartimento de amostragem”, que serve exclusivamente para coletar uma amostra ou sobrenadante da cultura do sistema microfluídico, e/ou que destina-se a ser um “reservatório de amostra” ou “câmara/compartimento de amostra” que serve exclusivamente para adicionar uma amostra teste ao sistema microfluídico.

[00104] Em diversas realizações, a amostra teste é uma amostra teste líquida, que é adicionada preferencialmente ao sistema microfisiológico por meio do compartimento para cultura celular compreendendo o equivalente de trato gastrointestinal, especificamente o equivalente intestinal, mais especificamente o equivalente de intestino delgado. Em diversas realizações, a amostra teste é um cosmético ou produto de consumo, inclusive um creme, que é adicionado preferencialmente ao sistema microfisiológico por meio do compartimento para cultura celular compreendendo o equivalente cutâneo.

[00105] O método de detecção de um analito, de acordo com a presente revelação, pode compreender a coleta de uma amostra de um “reservatório de meio” do circuito sanguíneo e/ou do circuito urinário. Conforme descrito em outra parte do presente documento, este “reservatório de meio” pode destinar-se a ser um “reservatório de amostragem” ou “câmara/compartimento de amostragem”, que serve para coletar uma amostra ou sobrenadante de cultura do sistema microfluídico, e/ou que pode destinar-se a ser um “reservatório de amostra” ou “câmara/compartimento de amostra”, que serve para adicionar uma amostra teste ao sistema microfluídico, mas que não serve como um compartimento para cultura celular para um equivalente de órgão.

[00106] O método de detecção de um analito, de acordo com a presente revelação, pode compreender ainda a análise da amostra coletada do sistema microfluídico por meio de uma câmara de amostragem quanto à presença de metabólitos, preferencialmente metabólitos tóxicos. O método de detecção de analito, de acordo com a presente revelação, permite especificamente a detecção de metabólitos de drogas adicionadas como amostras testes ao sistema microfisiológico.

[00107] O método de detecção de um analito, de acordo com a presente revelação, pode compreender ainda a detecção de analito no fluxo fluido do primeiro circuito e/ou do segundo circuito.

[00108] Em realizações preferidas do método de detecção de um analito, uma amostra teste é adicionada ou depositada em um compartimento para cultura celular do primeiro circuito, que é igual ou diferente do compartimento para cultura celular ao qual a solução nutriente é adicionada.

[00109] Revela-se ainda pelo presente documento um método de cultura e/ou manutenção de células compreendendo a cultura de um novo dispositivo microfluídico descrito pelo presente documento com células.

[00110] Revela-se ainda pelo presente documento um kit para operação de um sistema microfisiológico compreendendo um novo dispositivo microfluídico descrito, e instrução de uso.

[00111] O dispositivo microfluídico provido pela presente revelação pode estar na forma de uma plaqueta ou microplaqueta. As plaquetas geralmente são baseadas nas dimensões da plaqueta de microtitulação e uso passivo, fluxo microfluídico baseado em gravidade ou bombeamento embarcado ativo. As microplaquetas de dimensão de lâmina microscópica e demais formatos podem ser operadas por um fluxo microfluídico ativo ou passivo, simulando assim a tensão de cisalhamento a taxas intracapilares ou intersticiais fisiológicas. No caso de um fluxo microfluídico ativo, as microbombas dentro e fora da microplaqueta podem ser usadas. Preferencialmente, o dispositivo microfluídico provido pela presente revelação encontra-se na forma de uma microplaqueta.

[00112] Em diversas realizações do novo dispositivo microfluídico ou do novo sistema microfisiológico revelado pelo presente documento, o primeiro circuito compreende um ou mais canais microfluídicos que estão alinhados com as células endoteliais. Conforme descrito em outra parte do presente documento, a presente revelação demonstra que a tensão de cisalhamento promove o alongamento de células endoteliais derivadas de iPSC nos canais da microplaqueta de múltiplos órgãos (Fig. 11).

[00113] Em diversas realizações, o novo dispositivo microfluídico ou o novo sistema microfisiológico compreende uma microbomba, preferencialmente uma microbomba peristáltica. Em diversas realizações, um dos dois circuitos (primeiro e segundo circuito) pode ter uma microbomba (ou seja, “microbomba do circuito sanguíneo” ou “microbomba circuito urinário”). Em realizações preferidas, cada um dos dois circuitos (primeiro e segundo circuito) possui sua própria microbomba o ou seja, “microbomba do circuito sanguíneo” e “microbomba do circuito urinário”). As microbombas são preferencialmente microbombas “na microplaqueta”, em conformidade com a realização preferida, de que o novo dispositivo microfluídico ou o novo sistema microfisiológico é um sistema de canal fechado.

[00114] Conforme descrito pelo presente, os novos métodos providos aqui podem abranger uma etapa de depósito e/ou cultura de um equivalente de órgão, preferencialmente um tecido compreendendo células (epiteliais) ou células (epiteliais) derivadas de iPSC do respectivo órgão, em um compartimento para cultura celular do primeiro circuito.

[00115] Em diversas realizações, o equivalente intestinal pode compreender (ainda) fibroblastos, em particular fibroblastos derivados de iPSC. Preferencialmente, o equivalente intestinal é um equivalente intestinal derivado de iPSC compreendendo ainda fibroblastos, em particular fibroblastos derivados de iPSC. Mais preferencialmente, o equivalente intestinal é um equivalente derivado de iPSC formado por uma camada de uma matriz extracelular, a qual é coberta por fibroblastos, em particular fibroblastos derivados de iPSC. A camada de uma matriz extracelular é preferencialmente uma camada à base de gel de uma matriz extracelular. Ainda mais preferencialmente, o equivalente intestinal é um organoide de células intestinais derivadas de iPSC. Preferencialmente, o equivalente intestinal é um equivalente derivado de iPSC, preferencialmente um organoide de células intestinais derivadas de iPSC, formado por uma camada de um extrato de matriz extracelular similar à membrana basal (remontando tipicamente o ambiente extracelular tecidual), em que a camada é coberta por fibroblastos, em particular fibroblastos derivados de iPSC. Em diversas realizações, o extrato de matriz extracelular similar à membrana basal compreende uma mistura proteica gelatinosa. Preferencialmente, a matriz extracelular similar à membrana basal é uma matriz de membrana basal Matrigel (Corning).

[00116] Em diversas realizações, o equivalente intestinal, que é preferencialmente um organoide de células intestinais derivadas de iPSC, é incorporado ou integrado na matriz extracelular supracitada.

[00117] Em diversas realizações, o equivalente intestinal, que é preferencialmente um organoide de células intestinais derivadas de iPSC, compreende uma camada (fechada) de células endoteliais, inclusive células endoteliais derivadas de iPSC ou microvasculares primárias (as primeiras sendo preferidas), no lado basolateral do compartimento para cultura celular. Em diversas realizações, o equivalente intestinal, que é preferencialmente um organoide de células intestinais derivadas de iPSC, compreende uma camada (fechada) de células endoteliais derivadas de iPSC no lado basolateral do compartimento para cultura celular.

[00118] Em diversas realizações, o equivalente intestinal pode compreender (ainda) fibroblastos e células endoteliais, em particular fibroblastos derivados de iPSC e células endoteliais derivadas de iPSC, conforme descrito acima. Da mesma forma, em diversas realizações, o equivalente intestinal é um equivalente intestinal derivado de iPSC formado por uma camada de uma matriz extracelular, a qual é coberta por fibroblastos, em particular fibroblastos derivados de iPSC, e em que o equivalente intestinal compreende ainda outra camada de células endoteliais, preferencialmente células endoteliais microvasculares primárias, no lado basolateral do compartimento para cultura celular. Alternativamente, em diversas realizações, o equivalente intestinal é um equivalente intestinal derivado de iPSC formado por uma camada de uma matriz extracelular, a qual é coberta por fibroblastos, em particular fibroblastos derivados de iPSC, e em que o equivalente intestinal compreende ainda outra camada de células endoteliais derivadas de iPSC no lado basolateral do compartimento para cultura celular.

[00119] Em diversas realizações, o equivalente intestinal é incorporado ou integrado à matriz extracelular supracitada.

[00120] Além disso, conforme descrito acima, o equivalente intestinal derivado de iPSC é preferencialmente um organoide de células intestinais derivadas de iPSC. Também, a camada da matriz extracelular é preferencialmente uma camada à base de gel de uma matriz extracelular, mais preferencialmente uma camada de um extrato de matriz extracelular similar à membrana basal (remontando tipicamente o ambiente extracelular tecidual). O extrato de matriz extracelular similar à membrana basal pode compreender uma mistura proteica gelatinosa. Preferencialmente, a matriz extracelular similar membrana basal é a matriz de membrana basal Matrigel (Corning).

[00121] Em diversas realizações, o equivalente neuronal pode compreender (ainda) células endoteliais, em particular células endoteliais derivadas de iPSC. Preferencialmente, o equivalente neuronal é um equivalente derivado de iPSC compreendendo ainda células endoteliais, em particular células endoteliais derivadas de iPSC. Mais preferencialmente, as células endoteliais, em particular células endoteliais derivadas de iPSC, estão presentes no lado basolateral do equivalente neuronal do compartimento para cultura celular compreendendo o equivalente neuronal. Alternativamente, o equivalente neuronal é um equivalente neuronal derivado de iPSC compreendendo ainda células endoteliais derivadas de iPSC bioimpressas (e, assim, presentes) sob o equivalente neuronal. Preferencialmente, o equivalente neuronal derivado de iPSC compreende esferoides ou organoides de células neuronais derivadas de iPSC, e as células endoteliais derivadas de iPSC são bioimpressas (e, assim, presentes) sob o esferoide neuronal ou organoide de células neuronais derivadas de iPSC. Preferencialmente, o equivalente neuronal derivado de iPSC compreende esferoides ou organoides de células neuronais derivadas de iPSC, que são incorporadas ou integradas em uma camada de uma matriz extracelular. Preferencialmente, as células endoteliais derivadas de iPSC são bioimpressas (e, assim, presentes) na matriz extracelular sob os esferoides neuronais (basolaterais) ou organoides de células neuronais derivadas de iPSC. Conforme descrito acima, a matriz extracelular é preferencialmente uma matriz extracelular de gel, mais preferencialmente um extrato de matriz extracelular similar à membrana basal (remontando tipicamente o ambiente extracelular tecidual). O extrato de matriz extracelular similar à membrana basal pode compreender uma mistura proteica gelatinosa. Preferencialmente, a matriz extracelular similar à membrana basal é a matriz de membrana basal Matrigel  (Corning).

[00122] As células endoteliais bioimpressas sob os esferoides neuronais ou organoides, ou cultivadas no lado basolateral do equivalente neuronal, em particular no lado basolateral do compartimento para cultura celular compreendendo o equivalente neuronal, remontam a barreira hematoencefálica, e sua estanqueidade foi demonstrada por um TEER de 20 a 78 Ω x cm2 após duas semanas de cultivo em microplaqueta. A resistência elétrica transepitelial/transendotelial (TEER) é uma técnica quantitativa amplamente aceita para medir a integridade de dinâmicas de junção estrita em modelos de cultura celular de camadas de célula endotelial e epitelial. TEER é um forte indicador da integridade das barreiras celulares antes que sejam avaliadas, por exemplo, quanto ao transporte de drogas ou produtos químicos. As medições de TEER podem ser realizadas em tempo real sem danos à célula e geralmente são baseadas na resistência ôhmica medida ou impedância medida entre um amplo espectro de frequências. As medições para diversos tipos de célula foram relatadas com sistemas de medição comercialmente disponíveis e também com implementações microfluídicas personalizadas. Alguns dos modelos de barreira que foram amplamente caracterizados usando TEER incluem os modelos de barreira hematoencefálica (BBB), gastrointestinal (GI) e pulmonar.

[00123] Em diversas realizações da presente revelação, as células endoteliais bioimpressas sob os esferoides neuronais ou organoides, ou cultivadas no lado basolateral do equivalente neuronal, em particular no lado basolateral do compartimento para cultura celular compreendendo o equivalente neuronal, mostraram um TEER de 2 0 a 78 Ωx cm2, especificamente após duas semanas de cultivo em microplaqueta.

[00124] Em diversas realizações da presente revelação, as células do equivalente intestinal são caracterizadas pela expressão de marcadores específicos de células epiteliais intestinais, inclusive sacarase- isomaltase, o transportador de oligopeptídeo intestinal SLC15A1/transportador de peptídeo 1 (PEPT1), e a principal enzima metabolizante CYP3A4.

[00125] Em diversas realizações da presente revelação, as células do equivalente intestinal e/ou do equivalente hepático são caracterizadas pela expressão de marcadores específicos que incluem a principal enzima metabolizante CYP3A4.

[00126] Em diversas realizações da presente revelação, as células do equivalente hepático são caracterizadas pela expressão de marcadores específicos que incluem citoqueratina 8/18.

[00127] Em diversas realizações da presente revelação, o equivalente hepático é caracterizado pela expressão da proteína de junção estreita ZO-1.

[00128] Em diversas realizações da presente revelação, as células do equivalente neuronal são caracterizadas pela expressão de marcadores específicos que incluem beta-tubulina III.

[00129] Em diversas realizações da presente revelação, as células endoteliais (primárias) são caracterizadas pela expressão de CD31 e/ou Fator de von- Willebrand (vWF).

[00130] Em diversas realizações da presente revelação, os fibroblastos (derivados de iPSC) são caracterizado pela expressão de vimentina.

[00131] Conforme descrito pelo presente, qualquer tipo de células usadas e descritas na presente revelação pode ser derivado de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Especificamente, as células podem ser derivadas o ou seja, diferenciadas) de uma iPSC de doador único o ou seja, um e o mesmo), que, por sua vez, foi obtida oou seja, reprogramada) de um único tipo de célula somática. Por exemplo, as células podem ser derivadas oou seja, diferenciadas) de uma iPSC única o ou seja, uma e a mesma) , que foi obtida (ou seja, reprogramada) a partir de, por exemplo, um célula somática cutânea, de leucócitos, célula renal, adipócitos ou similares. Portanto, na medida em que as células não são identificadas como células derivadas de iPSC, as células usadas e descritas na presente revelação podem ser células derivadas de iPSC, de acordo com as diversas realizações, preferencialmente células derivadas de iPSC que foram diferenciadas de uma iPSC de doador único (ou seja, um e mesmo), que foi obtida (ou seja, reprogramada) de um único tipo de célula somática.

[00132] Conforme descrito pelo presente, a referência a “intestino” significa, de acordo com as realizações preferidas, referência ao “intestino delgado”. Por exemplo, a referência a “equivalente intestinal” ou “células do intestino" significa, de acordo com as realizações preferidas, referência ao “equivalente de intestino delgado” ou “células do intestino delgado”, respectivamente.

[00133] Conforme descrito pelo presente, a referência a “células” abrange a referência a “células de mamíferos”, enquanto prefere-se a referência a “células humanas”. Por exemplo, a referência a “células endoteliais” abrange a referência a “células endoteliais de mamíferos”, enquanto prefere-se a referência a “células endoteliais humanas”.

[00134] Conforme descrito ainda pelo presente documento, a referência a “tecido” abrange a referência a “tecido de mamífero”, enquanto prefere-se a referência a “tecido humano”. Por exemplo, a referência a “tecido hepático” abrange a referência a “tecido hepático de mamífero”, enquanto prefere-se a referência a “tecido hepático humano”.

[00135] Como descrito ainda pelo presente, em diversas realizações, o termo “tecido” pode ser considerado uma “cultura tecidual”.

[00136] Além disso, conforme descrito pelo presente, as “células de cultura” significam preferencialmente “a cultura fluídica de células”.

[00137] Em diversas realizações, a presente revelação abrange tensão de cisalhamento fluídica (ou de fluido), especificamente tensão de cisalhamento fluídica (ou de fluido) fisiologicamente relevante.

EXEMPLOS Desenho de microplaqueta de Microplaqueta de ADME-N

[00138] Realiza-se um desenho de microplaqueta tendo restrições reduzidas a partir da fisiologia humana. São considerados os dados dimensionais, bem como características de fluxo. O layout compreende dois circuitos (denominados “sanguíneo” e “urinário”) contendo cavidades para a incorporação dos seguintes equivalentes de órgãos: tecido intestinal, hepático, renal (segregado em glomérulo e túbulo) e neuronal (Fig. 1) . Os três primeiros tecidos são usados para realizar o assim denominado perfil de ADME (adsorção, distribuição, metabolismo, excreção). O último é um tecido adicional que complemente aquele perfil. Assim, a microplaqueta é denominada microplaqueta de ADME-N. um compartimento de reservatório em cada circuito permite a amostragem de sobrenadantes (reservatório de meio 1 e 2). O meio é perfundido através da rede microfluídica por duas microbombas pneumáticas incorporadas - uma para cada circuito. Os circuitos se sobrepõem nos dois compartimentos renais e são separados por uma membrana porosa feita de policarbonato.

Compartimento intestinal

[00139] O equivalente intestinal foi realizado colocando-se uma pastilha de cultura celular 24 poços verticais na respectiva cavidade (compartimento para cultura celular). A pastilha contida em cada modelo intestinal comercialmente disponível intestinal (EpiIntestinal®, MatTek) ou organoides de células intestinais derivadas de iPSC incorporados no Matrigel contendo também fibroblastos derivados de iPSC e células endoteliais derivadas de iPSC. No modelo de equivalente intestinal derivado de iPSC, as células endoteliais microvasculares primárias ou células endoteliais derivadas de iPSC foram cultivadas no lado basolateral da pastilha de cultura celular de 24 poços verticais. O lado apical da pastilha foi usado para a alimentação diária e uma solução nutritiva (Nutriflex® peri, B .Braun). No total, o lado apical conteve um sobrenadante de 250 L.

Compartimento neuronal

[00140] O equivalente neuronal com barreira hematoencefálica consistiu em uma pastilha de cultura celular de 96 poços suspensos contendo esferoides neuronais derivados de iPSC enriquecidos com células endoteliais derivadas de iPSC cultivadas no lado basolateral da pastilha de cultura celular de 96 poços suspensos ou bioimpressas sob os esferoides neuronais. O lado apical da pastilha continha um volume de 75 pL.

Compartimento hepático

[00141] O equivalente hepático foi realizado ao colocar-se os modelos hepáticos comercialmente disponível (3D InSight™ Human Liver Microtissues XL, InSphero) ou esferoides de hepatócitos derivados de iPSC com fibroblastos derivados de iPSC na respectiva cavidade. Do primeiro, 50 esferoides foram colocados em uma microplaqueta, cada um contendo 3.000 hepatócitos primários. Do último, 20 esferoides foram colocados em uma microplaqueta, cada um contendo 50.000 células.

Compartimento dos rins ^rena^^)

[00142] Os compartimentos renais foram cultivados com uma linhagem celular epitelial tubular proximal renal (RPTECs) ou com células renais derivadas de iPSC.

[00143] Os protocolos de diferenciação usados para as células derivadas de iPSC foram adaptados de diferentes artigos listados na Tabela 1. Tabela 1: Lista de células derivadas de iPSC. Os protocolos de diferenciação foram adaptados dos artigos listados.

[00144] O circuito “sanguíneo” apresentou um volume geral de aproximadamente 1,37 mL (não incluindo os volumes apicais). O circuito “urinário” apresentou um volume geral de aproximadamente 0,58 mL. Inicialmente, a microplaqueta continha meio com glicose e soro. Todos os dias as amostras eram coletadas de ambos os reservatórios de meio e do lado apical do equivalente intestinal. Os volumes coletados eram substituídos por meio sem glicose para o reservatório de meio “sanguíneo” e meio sem glicose e soro para o reservatório de meio “urinário”. Ao compartimento intestinal, forneceu-se uma solução rica em glicose Nutriflex® peri. Desta forma, alimentou-se diariamente 1,0 mg de glicose ao sistema apenas através do equivalente intestinal.

[00145] Os conjuntos de microplaquetas foram cultivados durante 7, 14 e 21 dias (Fig. 2) . Nos endpoints, as amostras celulares foram coletadas para exames imunohistológicos, qPCR e sequenciamento de RNA. Os sobrenadantes foram analisados quanto ao seu teor de glicose, lactato, LDH, albumina, ureia, ALT e AST. Os controles dos cultivos estáticos dos dados equivalente de órgãos foram coletados nos dias 0, 7 e 14. Experimento 1.1: Microplaquetas de iPSC - 3 microplaquetas • Equivalente hepático de iPSC • Equivalente intestinal de iPSC • Equivalente neuronal de iPSC com barreira hematoencefálica impressa • RPTECs renais

Compartimento intestinal

[00146] A pastilha do equivalente intestinal contém organoides de células intestinais derivadas de iPSC incorporadas em Matrigel contendo também fibroblastos derivados de iPSC e células endoteliais derivadas de iPSC. No modelo de equivalente intestinal derivado de iPSC, as células endoteliais microvasculares primárias ou células endoteliais derivadas de iPSC são cultivadas no lado basolateral da pastilha de cultura celular de 24 poços verticais.

Compartimento neuronal

[00147] O equivalente neuronal com barreira hematoencefálica consiste em uma pastilha de cultura celular contendo esferoides neuronais derivados de iPSC enriquecidos com células endoteliais derivadas de iPSC bioimpressas sob os esferoides neuronais.

Compartimento hepático

[00148] O equivalente hepático é realizado colocando-se esferoides de hepatócitos derivados de iPSC com fibroblastos derivados de iPSC na respectiva cavidade. Colocam-se 20 esferoides sobre uma microplaqueta, cada um contendo 50.000 células (proporção de 24:1 hepatócitos:fibroblastos).

Compartimento dos rins (renal)

[00149] Os compartimentos renais são cultivados com uma linhagem celular epitelial tubular proximal renal (RPTECs). Experimento 1.2: Microplaquetas Teciduais Primárias - 10 microplaquetas • Tecido hepático primário • Intestino delgado primário • Equivalente neuronal de iPSC com barreira hematoencefálica impressa • RPTECs renais

Compartimento intestinal

[00150] A pastilha do equivalente intestinal contém um modelo intestinal comercialmente disponível (Epilntestinal®, MatTek).

Compartimento neuronal

[00151] O equivalente neuronal com barreira hematoencefálica consiste em uma pastilha de cultura celular contendo esferoides neuronais derivados de iPSC enriquecidos com células endoteliais derivadas de iPSC bioimpressas sob os esferoides neuronais.

Compartimento hepático

[00152] O equivalente hepático é realizado colocando-se os modelos hepáticos comercialmente disponível (3D InSight™ Human Liver Microtissues XL, InSphero) na respectiva cavidade. Colocam-se 50 esferoides sobre uma microplaqueta, cada um contendo 3.000 hepatócitos primários. Compartimento dos rins (renal) • Equivalente hepático de iPSC • Equivalente intestinal de iPSC • Equivalente neuronal de iPSC com barreira hematoencefálica • Equivalente renal de iPSC

Compartimento intestinal

[00153] A pastilha do equivalente intestinal contém organoides de células intestinais derivadas de iPSC incorporadas no Matrigel contendo também fibroblastos derivados de iPSC e células endoteliais derivadas de iPSC. No modelo de equivalente intestinal derivado de iPSC, as células endoteliais microvasculares primárias ou as células endoteliais derivadas de iPSC são cultivadas no lado basolateral da pastilha de cultura celular de 24 poços verticais.

Compartimento neuronal

[00154] O equivalente neuronal com barreira hematoencefálica consiste em uma pastilha de cultura celular contendo esferoides neuronais derivados de iPSC enriquecidos com células endoteliais derivadas de iPSC cultivadas no lado basolateral da pastilha de cultura celular.

Compartimento hepático

[00155] O equivalente hepático é realizado colocando-se esferoides de hepatócitos derivados de iPSC com fibroblastos derivados de iPSC na respectiva cavidade. Colocam-se 20 esferoides sobre uma microplaqueta, cada um contendo 50.000 células (proporção de 24:1 de hepatócitos:fibroblastos).

Compartimento dos rins (renal)

[00156] Os compartimentos renais são cultivados com células renais derivadas de iPSC.

Resultados

[00157] As microplaquetas foram homeostáticas. Isto foi mostrado pelos níveis constantes de glicose e LDH (Fig. 3). Um concentração constante de glicose sugeriu consumo constante e uma regulação ativa da glicose disponível. Os níveis de glicose atingiram níveis iguais em todos os compartimentos. A alimentação apenas de forma apical através do equivalente intestinal foi suficiente para abastecer os circuitos “sanguíneo” e “urinário”. Além disso, a atividade de LDH demonstrou-se bastante constante durante os experimentos. Em comparação à glicose, os níveis de LDH são diferentes em cada compartimento. A função da barreira do equivalente intestinal e do equivalente renal é mostrada por diferentes concentrações de LDH em todos os três compartimentos (ou seja, circuito sanguíneo -> reservatório de meio 1 ; circuito urinário -> reservatório de meio 2; e compartimento intestinal). Portanto, as barreiras se diferenciam entre as substâncias de cruzamento. A penetração ativa ou passiva de glicose, apesar de reter outras substâncias, indica interações práticas entre os subconjuntos do sistema de microplaqueta.

[00158] Os compartimentos glomerular e tubular foram realizados com uma combinação de membrana de policarbonato e uma camada rígida de células renais (Fig. 4). A primeira implementa uma barreira técnica para filtrar os constituintes do meio maior e retardar sua difusão. A última reabsorve as substâncias e causa a captação de gradientes de concentração entre os circuitos “sanguíneo” “urinário”. Este gradiente é visível não apenas para LDH, mas também para aspartato transaminase (AST, Fig. 5). Suas concentrações distintamente diferentes demonstram a função da membrana renal da microplaqueta de ADME-N. O AST só pode se originar a partir do equivalente hepático, já que é um enzima intracelular encontrada em hepatócitos e células musculares.

[00159] Todos os equivalentes de órgãos foram avaliados de forma imunohistológica para determinar-se a identidade, funcionalidade e viabilidade (Figs. 6 a 9). O equivalente intestinal derivado de iPSC foi formado por uma camada de Matrigel coberta com fibroblastos derivados de iPSC. Os organoides intestinais envolvendo o lúmen foram incorporados no gel (Fig. 6). As células intestinais derivadas de iPSC expressaram NaK-ATPase e Cyp3A4. No Experimento 1.2, uma camada fechada de células endoteliais microvasculares primárias estava formando ainda outra camada sobre o lado basolateral da pastilha de cultura celular.

[00160] O equivalente hepático primário mostrou marcadores funcionais no término de seu período de cultivo de duas semanas de duração (Fig. 7). Além disso, para o equivalente hepático derivado de iPSC, os marcadores funcionais foram confirmados após três semanas de cultivo na microplaqueta de ADME-N (Fig. 8).

[00161] O equivalente neuronal derivado de iPSC expressou marcadores funcionais para β-tubulina III no término de seu período de cultivo de duas semanas de duração (Fig. 9). As células endoteliais impressas no hidrogel mostrou expressão de vWF após as duas semanas de cultivo de microplaqueta (Experimento 1.2). A estanqueidade da barreira sanguínea foi mostrada pelos valores de TEER de 20 a 78 Q x cm2 após duas semanas de cultivo de microplaqueta (Experimento 2) . Lista de referências citadas na Tabela 1: 1. Szkolnicka, D., Farnworth, S. L., Lucendo- villarin, B. & Hay, D. C. Deriving Functional Hepatocytes from Pluripotent Stem Cells. 1-12 (2014). doi: 10. 1002/97804701 5 1808.sc01g05s30 2. Zou, L . et at. A simple method for deriving functional MSCs and applied for osteogenesis in 3D scaffolds. Sci. Rep. 3, 2243 (2013). 3. Kauffman, A. L., Ekert, J. E., Gyurdieva, A. V, Rycyzyn, M. A. & Hornby, P. J. Directed differentiation protocols for successful human intestinal organoids derived from multiple induced pluripotent stem cell lines. 2, 1-10 (2015). 4. Morizane, R. & Bonventre, J. V. Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 12, 195-207 (2016).

Claims (15)

1. DISPOSITIVO MICROFLUÍDICO, caracterizado por compreender um circuito sanguíneo com um ou mais compartimentos para cultura celular e um circuito urinário compreendendo uma unidade de filtração e uma unidade de reabsorção, em que ambos os circuitos são conectados entre si por meio da unidade de filtração e da unidade de reabsorção, e compreendendo ainda um compartimento reservatório além de um ou mais compartimentos de cultura celular, que serve para adicionar solução nutriente ao sistema.

2. DISPOSITIVO MICROFLUÍDICO, de acordo com a reivindicação 1, sendo a unidade de filtração caracterizada por compreender uma barreira de filtração que permite a passagem de forma seletiva das moléculas do circuito sanguíneo para o circuito urinário com base no tamanho e carga das moléculas.

3. DISPOSITIVO MICROFLUÍDICO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela barreira de filtração ser uma barreira mecânica ou biológica, preferencialmente uma barreira biológica que compreende podócitos.

4. DISPOSITIVO MICROFLUÍDICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, sendo a unidade de reabsorção caracterizada por compreender uma barreira que permita a reabsorção de fluidos do circuito urinário para o circuito sanguíneo.

5. DISPOSITIVO MICROFLUÍDICO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela barreira de reabsorção ser uma barreira biológica, preferencialmente em que a barreira biológica compreende células do túbulo renal.

6. DISPOSITIVO MICROFLUÍDICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, sendo pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do circuito sanguíneo caracterizado por compreender um equivalente de órgão que simule a função hepática, e pelo menos um dos compartimentos para cultura celular do circuito sanguíneo compreende um equivalente de órgão que simule a função intestinal.

7. USO DO DISPOSITIVO MICROFLUÍDICO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo uso ocorrer em teste analítico, diagnóstico, pesquisa, validação alvo, estudos de toxicidade, engenharia tecidual, manufatura tecidual, triagem de droga e/ou análise farmacocinética/farmacodinâmica.

8. MÉTODO DE OPERAÇÃO DE UM SISTEMA MICROFISIOLÓGICO, caracterizado por fazer uso do dispositivo microfluídico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por compreender ainda a adição de forma seletiva de uma solução nutriente ao sistema microfisiológico por meio do compartimento para cultura celular compreendendo um equivalente de órgão ou tecido compreendendo células epiteliais do trato gastrointestinal e que simule a função intestinal.

10. MÉTODO DE DETECÇÃO DE UM ANALITO EM UM SISTEMA MICROFISIOLÓGICO FAZENDO USO DO DISPOSITIVO MICROFLUÍDICO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, sendo o método caracterizado por compreender adição de uma amostra teste a um compartimento para cultura celular do circuito sanguíneo, preferencialmente em que o compartimento para cultura celular compreende um tecido compreendendo células epiteliais do trato gastrointestinal, pele ou trato respiratório.

11. MÉTODO DE SIMULAÇÃO DE HOMEOSTASE, caracterizado por compreender a operação de um sistema microfisiológico fazendo uso do dispositivo microfluídico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 compreendendo um circuito sanguíneo com um ou mais compartimentos para cultura celular e um circuito urinário compreendendo uma unidade de filtração e uma unidade de reabsorção, em que ambos os circuitos são conectados entre si por meio da unidade de filtração e da unidade de reabsorção.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por compreender a adição de forma seletiva de uma solução nutriente ao sistema microfisiológico por meio de um compartimento para cultura celular compreendendo células epiteliais do trato gastrointestinal, pele ou trato respiratório, preferencialmente em que as células epiteliais são células epiteliais do trato gastrointestinal, preferencialmente do intestino delgado.

13. MÉTODO DE CULTURA E/OU MANUTENÇÃO CELULAR, caracterizado por compreender cultura do dispositivo microfluídico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, com células.

14. KIT PARA OPERAÇÃO DE UM SISTEMA MICROFISIOLÓGICO, caracterizado por compreender o dispositivo microfluídico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e instruções de uso.

15. ENSAIO DE ADME (ABSORÇÃO, DISTRIBUIÇÃO, METABOLISMO, EXCREÇÃO), OU UM ENSAIO DE ADMET (ABSORÇÃO, DISTRIBUIÇÃO, METABOLISMO, caracterizado por compreender o conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.