TWI593798B - 三維細胞培養裝置與其應用 - Google Patents

Description

三維細胞培養裝置與其應用

本揭露是有關於一種培養裝置，且特別是有關於一種三維細胞組織培養裝置與其應用。

對於藥物的療效和臨床使用的安全性，人們始終在尋求更有效的篩選測試方案，能夠更快速簡便地預測或評估藥物的療效，並同時能夠確認藥物使用的安全性。不論是人體測試或動物活體測試，都有倫理上的考量，因此限制良多。在此狀況下，所謂單一晶片類器官(organ-on-a-chip)的概念應運而生，其或可視為試管內(in vitro)試驗後到人類活體(in vivo)測試前的過渡轉換的活體外(ex vivo)試驗。此種模式乃是利用較高層級的生物組織來進行測驗，不只能呈現生物物理擬態還能兼顧生理完整性和其前後順序關係。以肝組織器官之藥物生物分佈(drug disposition)作為例子，其組織和外源性化學物質間的生理先後順序序列包括攝取過程、代謝過程和清除過程。所以藥物評估之重點是不僅要重建不 同功能域(functional domains)、保持功能完整性，更要注意藥物生物分佈動態方式整個過程的協同效應。

將二維細胞培養成較複雜的生物組織模型過程中，最大的挑戰是肝細胞會快速地喪失肝細胞功能和組織特徵。藥品誘發肝損傷(Drug-induced liver injury,DILI)可能潛伏相當時間，其臨床發作可遲至暴露於藥物後5天至長達28天以上。反觀傳統肝細胞的二維培養只能維持其原始特徵幾天，並隨著時間的推移就快速喪失系統性生理完整性，並無法達到充分評估之功能。

因此，許多不同方案也相繼推出，希望能解決傳統細胞二維培養的不足之處。

欲使細胞於離體狀況下具生理性，其關鍵在於使細胞再重組並形成三維結構完整性。有方案提出採用支架(scaffold)用作細胞固著之基礎以創造出三維結構。使用支架的優點包括物理微環境設計的多樣化選擇、可用材料豐富性，並可搭配MEMS技術等。然而，在肝臟系統，由於肝功能特殊之性質考量，細胞外構造的生化環境亦應謹慎考量，肝功能特殊性質包括：(1)高代謝能力：肝代謝90%的外源化學物，可能會與緊密接觸人工支架之化學物交聯反應，而有不良影響；(2)細胞外基質(extracellular matrix,ECM)之動態平衡(homeostasis)：肝臟之細胞外基質的動態平衡主要被位於肝竇面積和肝索之間的星狀細胞所調控。肝星狀細胞(HSC)主要負責ECM和脂質貯積的動態平衡。不受控制和糾結的細胞外基質會導致病理狀態；與(3)細胞外基質組織的方向性：無方向性的ECM可導致病理狀態，已證明肝纖維化病人中的ECM無序排列會導致肝功能受損；肝臟細胞之該些特性均不利於支架應 用。此外，其它挑戰包括：(4)肝細胞多面體表面和細胞外基質的複雜質地的屏蔽效果、(5)細胞間大量運輸/交換不足與(6)生化定量分析能力不佳等，也同樣不利於支架之使用。

相對於支架，另一種方案乃是採共培養(co-culture)，利用多種不同類型細胞間的相互作用來建立區域性的生化環境。肝細胞可形成為具15毫米側邊的細胞立方體並具有索帶結構。但其亦有相當限制，關於形成細胞群能否依其生理相關的肝功能採立體分佈以達到擬組織器官之水平，仍須多方考量。

本揭露提供一種生物材料培養裝置，包括儲存區與細胞組織培養區。其中該儲存區包括至少一液體儲存槽與多個第一通道連通至該液體儲存槽，該液體儲存槽儲存培養液。其中該細胞組織培養區位於該儲存區的下方，該儲存區與該細胞組織培養區彼此固定相連接。該細胞組織培養區包括多角形下凹的至少一培養池以及與該培養池相連通的多個液體入口區，其中該些液體入口區透過該些第一通道與該液體儲存槽相連通，該培養液從該液體儲存槽經由該些第一通道流入該些液體入口區中，再流到該培養池中且填滿該培養池。生物材料培養裝置包括至少一第二通道，該第二通道位於該液體儲存槽的下方但不與液體儲存槽相連通、位於該培養池上方並與該培養池相連通，其中與該培養池相連通的該第二通道從該培養池中吸取該培養液而從一排出口排出該培養液。

在實施例中，該儲存區更包括間隔區位於該液體儲存槽下方，該些第一通道與至少該第二通道位於該間隔區中，而該儲存區與該細胞組織培養區透過該間隔區固定相連接。

在一實施例中，該培養池為六角形下凹的培養池，而六個分離開的該些液體入口區各自位於六角形的該培養池的一角落。該些液體入口區為下凹池，其透過配置在六角形該培養池各角落的閘口與該培養池連通。

在一實施例中，該培養池為圓形下凹的培養池，而該些液體入口區彼此分離開而環繞圓形的該培養池邊緣分佈排列。該些液體入口區為下凹池，其透過配置在圓形該培養池邊緣的閘口與該培養池連通。

在一實施例中，該液體儲存槽具有一容積為1~5毫升。

在一實施例中，該儲存區的材質為透明玻璃材料或具生物相容性的透明塑膠材料，而該細胞組織培養區的材質為透明玻璃材料或具生物相容性的透明塑膠材料。

在一實施例中，該儲存區更包括蓋合於該液體儲存槽上的一上蓋。

在一實施例中，該儲存區更包括至少一抽取管連接至至少一該第二通道，從該培養池中吸取該培養液而從該抽取管排出該培養液。

在一實施例中，該生物材料培養裝置更包括一泵浦連接至該液體排出口，搭配該泵浦抽取，透過與該培養池相連通的至少該第二通道從該培養池中吸取該培養液而從該液體排出口排出該培養液。

在實施例中，該生物材料培養裝置為一肝細胞組織培養裝置，其更包括培養於該培養池中的肝細胞，其中該肝細胞組織培養裝置作為活體外(ex vivo)肝模型，用以進行藥物毒性測試、藥物動力學分析、藥效學分析或藥物代謝分析。

為讓本揭露的上述特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉實施例，並配合所附圖式作詳細說明如下。

10、20、40‧‧‧肝細胞組織培養裝置

100、100A‧‧‧儲存區

100B‧‧‧間隔區

102‧‧‧液體儲存槽

103‧‧‧培養液

104‧‧‧第一通道

105‧‧‧上蓋

106‧‧‧第二通道

108‧‧‧液體排出口

109‧‧‧抽取管

110‧‧‧細胞培養區

112‧‧‧培養池

114‧‧‧液體入口區

114a‧‧‧閘口

114b‧‧‧圓弧形端

118‧‧‧固定機制

200‧‧‧泵浦

300‧‧‧樣品處理抽驗單元

以所附圖式做為參考讓本揭露更明顯易懂，納入並構成本說明書的一部份。圖式與所附描述用來說明本揭露的實施例，以陳述本揭露概念。

圖1A是依據本揭露一實施例的肝細胞組織培養裝置的分解立體示意圖。

圖1B是依據本揭露一實施例的肝細胞組織培養裝置的剖面示意圖。

圖2是依據本揭露另一實施例的肝細胞組織培養裝置的立體示意圖。

圖3是依據本揭露又一實施例的肝細胞組織培養裝置的細胞組織培養區部分立體示意圖。

圖4是依據本揭露又一實施例的肝細胞組織培養裝置的分解立體示意圖。

圖5是細胞組織染色後經歷不同時間染料在細胞組織內分佈情形的顯微鏡照片。

圖6A-6B是三維培養的肝組織培養於不同時間的電子顯微鏡照片。

圖7A-7B是三維培養的肝組織培養的三維光學重建圖。

圖8A是肝細胞二維培養後呈現出星狀細胞顯微鏡照片。

圖8B是肝細胞三維培養後呈現肝組織三維光學重建圖。

圖9是施加或沒施加乙醯胺酚的肝組織染色後的顯微鏡照片。

圖10顯示二維培養與三維培養的肝細胞組織的乙醯胺酚毒性試驗結果。

圖11顯示乙醯胺酚誘導肝毒性與流量分佈之對應關係。

本揭露提供一種生物材料培養裝置，主要是提供一種肝細胞組織培養裝置。利用此生物培養裝置與其所培養得到的生物材料來提供活體外(ex vivo)試驗模型，特別是肝細胞組織培養裝置與其所培養得到的類組織(tissue constructs)或類器官(organoid)組織，可以作為活體外肝功能試驗模型。

要建立一個更為理想的活體外(ex vivo)肝模型，其特點包括能夠提供或達到：(1)結構層級和生理先後順序序列；(2)分子、細胞和組織微環境異質性(heterogeneity)：在活的組織器官中微環境常常是異質性相當大(差異相當大)的，如其分子梯度(molecular gradient)與傳統二維培養皿差異很大。此外，肝臟組織 器官的細胞成分也是不同且多樣化的；以及(3)協同較大體積的多個細胞群。

基本上，本揭露的活體外三維肝臟組織模型可用於進行轉譯醫學研究(translational research)實驗或測試，包括藥物開發實驗如肝毒性試驗、代謝物試驗、藥物動力學(PK)分析、藥效學(PD)分析、肝臟相關疾病模型或病理研究等。

活體外(ex vivo)肝細胞組織培養之微環境設計：培養裝置的設計原則要搭配生物物理和生物化學的觀點來達到活體外的生理完整性。本案假設建立分子異質性(亦即要在在三維空間內建立井然有序、具方向結構的組織)之要素包括生物物理、結構層級(structural hierachy)和極化與流量操縱。針對完整的生化細胞外微環境，例如：介質(medium)和細胞外基質成分、異質細胞群在三維空間之方向和在空間分佈等均需要審慎考慮並整合到設計中。

在此以本揭露實施例作為參考以便於更完整陳述本揭露概念，並配合所附圖式作詳細說明如下。在圖式與描述中所用的相同參考數字符號是指相同或相似元件。

圖1A是依據本揭露一實施例的肝細胞組織培養裝置的分解立體示意圖。圖1B是依據本揭露一實施例的肝細胞組織培養裝置的剖面示意圖。圖1A是肝細胞組織培養裝置的分解圖，但省略固定連接機制與上蓋。圖1B是肝細胞組織培養裝置的組合後的剖面圖，包括連接機制與上蓋。參照圖1A-1B，本實施例的肝細 胞組織培養裝置10包含至少一儲存區100，該儲存區100包括液體儲存槽102與多個第一通道104連通至該液體儲存槽，其中該液體儲存槽102用以承裝儲存一培養液103。當然除了承載培養液103，此領域者亦可理解藥物、標記物或反應試劑可以添加在培養液中，透過培養液之流動而遞送至培養細胞組織中，以利於後續進行檢測或觀察生化代謝、毒性、動力學反應等等。

該儲存區100例如可為一透明圓柱狀體，其中央下凹部分作為液體儲存槽102，從上方俯視，可見多個孔洞就是多個第一通道104的開口，培養液103從該些孔洞流入到該些第一通道104中再往下方的細胞培養區110流動。該液體儲存槽102具有一容積為1~5毫升，而其深度視容積或面積設計變動。儲存區100的材質較佳為透明材料如玻璃材料或具生物相容性的塑膠材料(例如聚乙烯材料或聚碳酸酯材料)，以方便進行細胞觀察或取像。

參照圖1B，該儲存區100更可包括一上蓋105設置於該液體儲存槽102上方並蓋住該液體儲存槽102，以為避免外界環境的污染物(如細菌、孢子、落塵等)落入儲存槽中而污染培養液。該上蓋105較佳為透明蓋片，材質較佳為透明材料如玻璃材料或具生物相容性的塑膠材料(例如聚乙烯或聚碳酸酯)，其材質可與儲存區100的材質相同或不同。該上蓋105與該液體儲存槽102之間更可搭配O型環(未圖示)來幫助達到密封的效果。

參照圖1A-1B，本實施例的肝細胞組織培養裝置10更包含至少一細胞組織培養區110，位於該儲存區100的下方，其中該 細胞組織培養區110包括一多邊形(多角形)下凹的培養池112以及與該下凹的培養池112相連通的多個液體入口區114，其中下凹的培養池112是作為肝細胞組織培養井。該細胞組織培養區110例如可為一透明圓柱狀體，從上方俯視，其中央下凹六角形部分為細胞培養池112。該細胞培養區110的材質較佳為透明材料如玻璃材料或具生物相容性的塑膠材料(例如聚乙烯材料或聚碳酸酯材料)，以方便進行細胞組織觀察或取像，其材質可與儲存區100的材質相同或不同。。此一實施例中該培養池112例如為下凹正六角形池，其具有一邊長為3~10厘米，而深度約為80~300微米(如180微米)，其容積視面積設計而定。該些液體入口區114各位於多角形的培養池112的一角落。本實施例中以六角形培養池112為例，具有六個分離開來的液體入口區114各自連接至培養池112的六個角落；但本揭露之結構不限於正六角形，培養池的形狀可為任意多邊形，而液體入口區設置於多邊形的角落，因此液體入口區之個數可視培養池之形狀而調整。如圖1A所示，液體入口區114為下凹的圓弧形池，其圓弧半徑尺寸為0.5~3厘米，液體入口區114為下凹池，而其形狀設計不限於圓弧形，可為任意多邊形或任意弧形，只要能將培養液導進培養池中即可。此實施例中以圓弧形池為例，而閘口114a寬度約為100~500微米(如250微米)，其圓弧形端114b配置於外側，而弧尖端的閘口114a與培養池112連通並配置在六角形培養池112的各角落。

前述肝細胞組織培養裝置之細胞組織培養區或儲存區基本上各為一完整整體結構，但也可由多塊或多片結構所拼成。端視各區所使用之材質可以採用不同技術來製造，包括針對尺寸較小極為精細之構造，可使用例如微影蝕刻、濕蝕刻、雷射鑽孔、電子束加工等技術來製造；同樣也可以利用射出成型、微型模鑄、微機械製造、放電加工等技術來製造。

如圖1A所示，該些液體入口區114與該些第一通道104相連通，第一通道104之一端開口連通至該液體儲存槽102而另一端開口連通至液體入口區114。參見圖1A，所示之垂直虛線乃用以表示該些第一通道104之位置乃各自對應於該些液體入口區114，基本上該些第一通道104之開口位置各自位於該些液體入口區114內的區域上方。圖1A中虛線箭頭代表液體流向，利用重力作用或泵浦抽取作用使該培養液103從上方的該液體儲存槽102經由該些第一通道104流入到該些液體入口區114中，再從該些液體入口區114朝向位於中央的該下凹的培養池112中流動，慢慢填入該下凹的培養池112中，以供肝細胞組織培養之用。

參照圖1B，肝細胞組織培養裝置10還包括固定機制118，該固定機制118乃是在該儲存區100與該細胞組織培養區110組合後用於固鎖住兩者之固著結構；固定機制118可包括螺絲、卡榫、膠黏、拴扣或扣鎖等結構，不限於此實施例所述內容。該固定機制118除了固著該細胞組織培養區110與該儲存區100，也可用以固定該儲存區100與該上蓋105。

參照圖1A-1B，本實施例的肝細胞組織培養裝置10之該儲存區100更包含至少一第二通道106，其配置於該液體儲存槽102的中央下方、位於該下凹的培養池112上方與該下凹的培養池112相連通。參照圖1B，第二通道106一端開口連通至培養池112的中央而另一端開口於該儲存區100的側邊，此開口也就是液體排出口108。液體排出口108更可外接一泵浦200，搭配泵浦抽取便於排除培養液103，透過與該下凹的培養池112相連通的第二通道106從該下凹的培養池112中吸取該培養液103而從液體排出口108排出該培養液103(圖1A中虛線箭頭代表液體流向)。此外，透過泵浦200抽取之培養液103可再傳送至樣品處理抽驗單元300，針對抽取液體作進一步之處理，進一步處理包括過濾(細胞碎片或雜質)、取樣、添加試劑(藥品、染劑、螢光標記物或小分子化學物等)等等，以利於後續檢測或循環回收之用，圖1A中的虛線箭頭表示液體流向，從樣品處理抽驗單元300回收處理過的培養液可以滴回該液體儲存槽102，循環使用。

樣品可以通過使用螢光共軛顯微鏡、紅外分光光度計，紫外線分光光度計，氣相色譜/質譜儀，高效液相層析法和其他檢測裝置技術來進行分析，主要可用以檢驗液體中特定成分、氣體、代謝物、細胞活性指標、感染和代謝的其他指標等。樣品檢測可以針對培養細胞組織本身、其培養液或兩者。且樣品測量可以針對特定培養時間或培養時間週期檢測。

通過培養裝置整體液體的流動需要呈現一個近乎連續的模式，不論是否有循環回收，基本上液體從液體儲存槽下流至培養池，並搭配泵浦從液體排出口抽取，其間液體的流動應該是連續的，而流速範圍可以為5~200微升/分鐘。通過培養裝置液體的流速可以視所培養細胞組織的細胞代謝需要來調整決定。通過培養細胞區的流體流速可以是固定的或可調變的，例如可能會在培養或試驗的特定期間，將流速減慢，使培養液之化合物充分反應或轉化，以便進行測定。

本實施例中的肝細胞組織培養裝置可用以培養從正常肝臟或病理肝組織所切片或分離的部份肝組織所包含的多種類型細胞。實施例中舉肝細胞(正常肝實質細胞)為培養細胞組織之例子，但本案培養裝置可以用於培養正常的動物(包括人類)細胞或動物腫瘤細胞，來源為經由組織切片、活體切離或細胞培養而得。所提供的培養液應當視所培養的細胞或組織而調整，提供生長分化所需基本營養素(糖類，氨基酸)和細胞成長因子或賀爾蒙等，可由商業來源購買或自行調配而成。

圖2是依據本揭露另一實施例的肝細胞組織培養裝置的立體示意圖，圖2所示乃是組合後的肝細胞組織培養裝置，細胞組織培養區110中的各構造如培養池112、液體入口區114與第一、第二通道等僅以虛線繪示表之，並省略上蓋以利描述。根據本揭露另一實施例，本實施例的肝細胞組織培養裝置20同樣包含至少一儲存區100與至少一細胞組織培養區110，與前述實施例較為不同 的設計是在於該儲存區100包括液體儲存槽102、多個第一通道104連通至該液體儲存槽以及至少一第二通道106。其中，第二通道106配置於該液體儲存槽102的中央下方、位於該下凹的培養池112上方，第二通道106之一端開口與該下凹的培養池112相連通，而另一端開口直接與抽取管109密合連通，抽取管109長度可貫穿過液體儲存槽102，而可外接一泵浦200便於排除培養池112中的培養液103，液體儲存槽102中的培養液103完全與該第二通道106及抽取管109隔離，意即液體儲存槽102中的培養液103不會滲漏至第二通道106或抽取管109中而被排出。圖2中虛線箭頭代表液體流向，搭配泵浦抽取，從該下凹的培養池112中吸取該培養液103，培養液103經由與該下凹的培養池112相連通的第二通道106、再通過從液體儲存槽102中央穿出的該抽取管109而排出該培養液103。

圖3是依據本揭露又一實施例的肝細胞組織培養裝置的 細胞培養區部分立體示意圖。此處之敘述省略了與前述實施例相似之處，主要針對此實施例中細胞組織培養區較為不同的設計來描述，參照圖3，本實施例的肝細胞組織培養裝置之細胞組織培養區110中包括一圓形下凹的培養池112以及與該下凹的培養池112相連通的多個液體入口區114，其中培養池112例如為下凹圓形池用以培養肝細胞組織，其具有一半徑尺寸為2~12厘米，而深度約為80~300微米(如180微米)。類似於前述實施例，液體入口區114為下凹的圓弧形池，液體入口區114為下凹池，而其形狀設計不限於圓弧形，可為任意多邊形或任意弧形，只要能將培養液導 進培養池中即可。此實施例中以圓弧形池為例，其具有一圓弧半徑尺寸為0.5~3厘米，而閘口114a寬度約為100~500微米(如250微米)，其圓弧形端114b配置於外側，而弧尖端的閘口114a與培養池112連通，該些液體入口區114乃等距配置在圓形培養池112的周圍，培養液從六個方向流入中心圓形培養池112中。此實施例中，該些液體入口區114之個數為六個，但本揭露之液體入口區之個數不限於此，可視流體動力設計需求而調整。

圖4是依據本揭露又一實施例的肝細胞組織培養裝置的分解立體示意圖。本實施例的肝細胞組織培養裝置40包含儲存區100A、間隔區100B與細胞組織培養區110。其中，該儲存區100A包括液體儲存槽102之槽體(在此例子該儲存區為中空結構，無槽底，但當儲存區與間隔區結合時才會形成出液體儲存槽102)與上蓋105。其中該液體儲存槽102用以承裝儲存一培養液103。該儲存區100A的材質較佳為透明材料如玻璃材料或具生物相容性的塑膠材料(例如聚乙烯材料)，該上蓋105較佳為透明蓋片，其材質可與儲存區100A的材質相同或不同。該上蓋105蓋合於該液體儲存槽102之上，並搭配設置O型環(未圖示)，於該上蓋105與該液體儲存槽102之間，來幫助達到密封的效果。該儲存區100A更包括固定機制118。該細胞組織培養區110中包括一多角形下凹的培養池112以及與該下凹的培養池112相連通的多個液體入口區114。

如圖4所示，此實施例中肝細胞組織培養裝置40與前述實施例之主要差異在於：具有位於儲存區100A與細胞組織培養區 110之間的該間隔區100B，該間隔區100B包括多個第一通道104連通儲存區100A之該液體儲存槽102以及下方細胞組織培養區110之液體入口區114。該間隔區包括第二通道106，其配置於該液體儲存槽102的中央下方、位於該下凹的培養池112上方而其一端與該下凹的培養池112相連通。參照圖4，第二通道106一端開口連通至培養池112的中央而另一端開口於該間隔區100B的側邊，此開口也就是液體排出口108。該間隔區100B同樣包括固定機制118。組合後，儲存區100A、間隔區100B與細胞組織培養區110透過固定機制118疊合固定，而構成肝細胞組織培養裝置40。

本實施例的肝細胞組織培養裝置40之儲存區100A與間隔區100B其實可視為前述實施例之儲存區100分為上下兩塊，也就是說，儲存區100A例如可為一透明圓柱狀體，其中空部分作為液體儲存槽102之槽體；該間隔區100B例如可為一透明圓柱狀體，其中空孔洞即為第一通道104。儲存區100A、間隔區100B與細胞組織培養區110組合後，培養液從液體儲存槽102透過第一通道104往下流入該細胞組織培養區110之下凹的液體入口區114，再朝向位於中央的培養池112流動。

要模仿肝臟微環境動態狀況，本案肝細胞組織培養裝置可包括六角形或多角形培養池(亦即肝細胞組織培養井)，其角落各自連接至分離開來的液體入口區，液體入口區會接收從液體存儲槽流過來的培養液體並供給培養液體至多角形培養容器，而多角形培養容器中央部份可連結至液體出口(或搭配泵浦抽取)便 於排除培養液體。液體存儲槽配置在多角形培養容器的上方，液體存儲槽與各個分離的液體入口區連通而提供培養液體至液體入口區。由於高度差加上泵浦抽取所造成的壓差，可使培養液體從上方的液體存儲槽朝多個液體入口區流動，從各角落之液體入口區朝向多角形培養容器流動並於中央處匯聚，再由六角形培養容器中央的液體出口流出。實施例中以六角形培養池為例，從上方的液體存儲槽朝六個液體入口區流動，再從六個角落之液體入口區朝向六角形培養容器流動並於中央處匯聚，形成所謂之徑向流(radial flow)，亦即由周邊向內流動之方向，此即在模仿肝臟中肝小葉(lobules)之血液循環流動方向，以進一步模擬肝微環境以及肝臟和身體循環系統之間的循環流動。

本實施例中的肝細胞組織培養裝置可用以培養從正常肝臟或病理肝組織所切片或分離的部份肝組織所包含的各種細胞。因本實施例中的肝細胞組織培養裝置引進徑向流(由周邊向內流動方向)以模仿肝臟中肝小葉(lobules)之血液循環流動方向，模擬肝微環境，本實施例中的肝細胞組織培養裝置能夠成功地形成多層肝實質細胞(parenchymal liver cells,PLCs)堆積，形成類組織(tissue constructs)或類器官(organoid)組織。本實施例中的肝細胞組織培養裝置所培養獲得的類組織或類器官組織並未喪失其原始功能，可使用於測試篩選標的化合物的毒性或用以檢測其動力學。

基本上，培養裝置較佳為透明的，以便利直接肉眼或儀器於原位(in-situ)觀察組織重塑和藥物動力學反應。培養裝置內的流體循環方向或流量分佈(流場輪廓)可能會對於培養組織之分佈造成影響。動物器官形成的基礎是細胞的分裂與分化，而有理論提出特定分子之濃度梯度可以指揮細胞的分裂與分化朝不同方向發展，最終形成器官發育需要的不同種類的細胞。

從流體入口到出口之流場輪廓可能會導致梯度輪廓(gradient profile)產生，本揭露可以利用微粒子影像測速法(Micro-PIV)測量循環的液體介質。為了觀察化生物反應和流量的分佈，可利用核酸染料碘化丙啶(propidine iodide,PI)作為生物指標來追踪細胞組織內之流體分佈，利用流式細胞儀分析染料在細胞組織內的分布情形。碘化丙啶穿透細胞膜進入細胞後會將細胞核染色為紅色。圖5是細胞組織從染色後經歷不同時間觀察染料在細胞組織內分佈情形的顯微鏡照片。照片中之箭頭代表流體流動方向，據觀察，染料滲透細胞組織之滲透速率推算為約500微米/小時。

流體引致的類器官(organoid)組織形態發展(morphogenesis)(肝組織重塑微結構分析)

肝組織器官培養(liver organotypic culture,LOC)於第3天、第7天與第14天固定、收取並用電子顯微鏡分析。在肝組織器官培養第3天，觀察到多層肝實質細胞(PLC)堆疊為胰島狀微結構。繼續灌注培養，參見圖6A，於第7天堆疊的PLC進一步分化發 育並具有方向性地形成肝壁狀微結構，其中更觀察到絲狀(silky)細胞外基質。參見圖6B，培養於第14天更進一步整合為腔室狀結構，其中更觀察到有窗孔(fenestrated)的窗狀微結構。

由實施例可得知，本揭露所描述之生物材料培養裝置可用以製作生物材料(例如：肝細胞組織)，將從正常或病理組織的細胞置入所述生物材料培養裝置的培養池中並提供適合的培養液，培養一段時間(如培養1~14天或7~10天，端視培養組織或材料而定)後而得到類組織(tissue constructs)或類器官(organoid)組織，而培養所得到的該類組織或該類器官組織可進一步作為生物材料。以肝細胞組織培養為例，經由本揭露所描述之肝細胞組織培養裝置培養後，所得到的類組織或類器官組織包括多層肝實質細胞，其堆疊為胰島狀微結構、肝壁狀微結構或整合為腔室狀結構。

結構和功能的極化(polarization)評估

F-肌動蛋白(F-actin)是一種外質(cortex)細胞骨架，對於維持細胞的三維結構極為重要。剛分離的PLC一直至培養後2~3天都沒有觀察到F-肌動蛋白極化現象。利用螢光染劑(bisbenzimide,Hoechst 33258)對於肝組織器官培養(LOC)進行雙重染色，參見圖7A-7B，培養第7天後F-肌動蛋白(於圖中以綠色呈現)極化至細胞邊緣形成整體細胞網絡組織結構。經由3D光學重建技術，F-肌動蛋白的分佈描繪出明顯的結構極化性。相較於MC組中F-肌動蛋白僅是分散型態，LOC組中基質與LOC接觸角大 於75度而F-肌動蛋白極化至細胞邊緣外質而形成整體細胞網絡組織結構。

多重耐藥蛋白2(multi-drug resistance protein 2,MRP-2)是一種功能運載體(transporter)存在於肝細胞中的極化細胞膜(也稱之為膽微管(bile canaliculus))。參見圖7A-7B，培養第7天，經由雙重染色可同時觀察到MRP-2(於圖中以紅色呈現)與F-肌動蛋白(於圖中以綠色呈現)於膽微管網絡組織之空間分佈，圖中藍色部份為染劑。在灌注組中MRP-2之極化分佈呈現為狹長分岔的網絡組織。MRP-2網絡組織的長度超過260微米(比肝小葉更長)。利用光學切片技術在30微米厚度的LOC以每一微米切片再重組建立立體形狀。其中MRP-2網絡組織極化且夾在兩個相鄰肝小索之間，而F-肌動蛋白呈現於肝小索另一側外質。MRP-2網絡組織之空間分佈位置是與循環介質分開來的，這與肝臟組織之狀況類似。

在無凝膠微環境下共培養和維持細胞表型(phenotype)實驗

原肝星狀細胞(hepatic stella cells,HSC)對於培養的微環境極為敏感。神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)分別是靜止的HSC和活化的HSC的特異性標記物，可作為細胞表型轉化的指標。參見圖8A，MC組在培養的第7天，肝星狀細胞自發性被活化並且伴隨GFAP消失和α-SMA表現提升(α-SMA在圖中以綠色呈現)。參見圖8B，在LOC組，其GFAP陽性細 胞的分佈(GFAP在圖中以紅色呈現)與肝臟中的立體分佈相似。部份分佈於肝細胞堆間隙位置，部份沿LTC架構的邊緣部分分佈。由此可見，在無需支架輔助情況下，本案在人工微環境下培養組織結構確實具有立體分佈之異質性PLC。

肝特異性功能評估

藥物毒性試驗：探討乙醯胺酚(acetaminophen,APAP)誘導的肝毒性之動力學，利用碘化丙啶(PI)作為追蹤劑來顯示類器官組織肝毒性的狀況。參見圖9，可見相較於未施用APAP使用之肝細胞(圖9左邊)，施用1200毫克/升的肝細胞死亡或受傷而呈現紅色(圖9右邊)。

添加不同劑量的APAP而與細胞組織培養數天，檢視本案之培養裝置是否可作為活體外(ex vivo)肝組織模型，用以進行藥物長期/短期毒性測試。以剛分離的PLC(分離後4小時內)所得到APAP誘導肝毒性的實驗劑量範圍數據作為控制組，以MTT試驗來測量細胞的活性，而剛分離的PLC所得之ED50估計為1000毫克/升。參見圖10，二維培養(標記為2D)的MC組在培養第7天幾乎檢測不到APAP誘導的肝毒性。MC組對於APAP誘導的肝毒性反應遲鈍，據推測應是因為CYP活性大大降低所造成的。因此，MC組在剛開始和培養第7天對於APAP不同的反應顯示出使用MC模型之侷限，特別是顯示出應用活體外(ex vivo)模型來預測較長期的藥物暴露研究之缺陷。三維(標記為3D)培養的肝組織器官培養(LOC) 第7天分別施用不同劑量的APAP並連續灌流24小時，確實觀察到其對於APAP誘導的肝毒性反應。

應用前述實施例之培養裝置，肝組織培養(LTCs)分別施加100毫克/升、1000毫克/升和1750毫克/升的乙醯胺酚。在乙醯胺酚濃度1750毫克/升的劑量(為剛分離PLC的致死劑量)下，發現相當多量的PI陽性細胞分佈於整個LTC。而當劑量減低至乙醯氨基酚濃度1000毫克/升時，發現PI陽性細胞呈現緯向分佈方式，類似於動物試驗中於大鼠肝組織學發現之緯向效應(zonal effect)，而且於1000毫克/升APAP劑量下的細胞存活率與剛分離PLC的ED50非常相似。參見圖11，實驗中APAP誘導肝毒性的異質分佈(heterogeneous distribution)對應於設計中流量分佈，這顯示出LTC之生化相關的肝代謝活性梯度。

由實施例可得知，本揭露所描述之生物材料培養裝置可用以進一步用於進行藥物毒性試驗，其方法包括先提供前述的生物材料培養裝置，將從正常或病理組織的細胞(例如：肝細胞組織)置入所述生物材料培養裝置的培養池中並提供適合的培養液，培養一段時間(如培養1~14天或7~10天，端視培養組織或材料而定)後得到類組織或類器官組織，並單一添加或連續添加特定藥物至培養所得到的該類組織或該類器官組織中，觀察該類組織或該類器官組織之變化，以分析該藥物對於該類組織或該類器官組織的毒性。由於生物材料培養裝置可以是透明裝置，故可直接以肉眼觀察該類組織或該類器官組織之變化，例如利用碘化 丙啶作為追蹤劑，以其顏色變化來觀察該類組織或該類器官組織之活力，而顯示其對於該藥物毒性的反應。

相對於在MC模型單層細胞培養缺乏緯向效應且對於APAP誘導肝毒性反應遲鈍，三維立體培養模型更適用於轉譯醫學研究(translational research)實驗或測試。

因此，本揭露所提供之立體(三維)肝細胞組織培養裝置確實能夠提供具有多層細胞且極化分佈之類組織或類器官組織，相較於單層(二維)細胞培養，更適於作為活體外(ex vivo)肝組織模型來測試藥物，包括進行藥物長期/短期毒性測試、藥物動力學分析、藥效學分析或藥物代謝分析或甚至可作為特定疾病預測模型。

雖然本揭露已以實施例揭露如上，然其並非用以限定本揭露，任何所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本揭露的精神和範圍內，當可作些許的更動與潤飾，故本揭露的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。

10‧‧‧肝細胞組織培養裝置

100‧‧‧儲存區

102‧‧‧液體儲存槽

103‧‧‧培養液

104‧‧‧第一通道

106‧‧‧第二通道

108‧‧‧液體排出口

110‧‧‧細胞組織培養區

112‧‧‧培養池

114‧‧‧液體入口區

114a‧‧‧閘口

114b‧‧‧圓弧形端

200‧‧‧泵浦

300‧‧‧樣品處理抽驗單元

Claims (16)

1. 一種生物材料培養裝置，包括：儲存區，該儲存區包括至少一液體儲存槽、一間隔區位於該液體儲存槽下方與多個第一通道連通至該液體儲存槽，其中該液體儲存槽儲存培養液；細胞組織培養區，位於該儲存區的下方，其中該儲存區與該細胞組織培養區彼此固定相連接，該細胞組織培養區包括多角形下凹的至少一培養池以及與該培養池相連通的多個液體入口區，其中該些液體入口區透過該些第一通道與該液體儲存槽相連通，該培養液從該液體儲存槽經由該些第一通道流入該些液體入口區中，再流到該培養池中；以及至少一第二通道，位於該液體儲存槽的下方、位於該培養池上方與該培養池相連通，其中，該第二通道一端開口連通至該培養池的中央而另一端開口於該間隔區側邊之一排出口，與該培養池相連通的該第二通道從該培養池中吸取該培養液而從該排出口排出該培養液，該些第一通道與至少該第二通道位於該間隔區中，而該儲存區與該細胞組織培養區透過該間隔區固定相連接。
2. 如申請專利範圍第1項所述的生物材料培養裝置，其中該培養池為六角形下凹的培養池，而六個分離開的該些液體入口區各自位於六角形的該培養池的一角落。
3. 如申請專利範圍第2項所述的生物材料培養裝置，其中該些液體入口區為下凹池，其透過配置在六角形該培養池各角落的閘口與該培養池連通。
4. 如申請專利範圍第1項所述的生物材料培養裝置，其中該 培養池為圓形下凹的培養池，而該些液體入口區彼此分離開而環繞圓形的該培養池邊緣分佈排列。
5. 如申請專利範圍第4項所述的生物材料培養裝置，其中該些液體入口區為下凹池，其透過配置在圓形該培養池邊緣的閘口與該培養池連通。
6. 如申請專利範圍第1項所述的生物材料培養裝置，其中該液體儲存槽具有一容積為1~5毫升。
7. 如申請專利範圍第1項所述的生物材料培養裝置，其中該儲存區的材質為透明玻璃材料或具生物相容性的透明塑膠材料，而該細胞組織培養區的材質為透明玻璃材料或具生物相容性的透明塑膠材料。
8. 如申請專利範圍第1項所述的生物材料培養裝置，其中該儲存區更包括蓋合於該液體儲存槽上的一上蓋。
9. 如申請專利範圍第1項所述的生物材料培養裝置，其中該儲存區更包括抽取管連接至至少該第二通道，從該培養池中吸取該培養液而從該排出口排出該培養液。
10. 如申請專利範圍第1項所述的生物材料培養裝置，更包括一泵浦連接至該液體排出口，搭配該泵浦抽取，透過與該培養池相連通的至少該第二通道從該培養池中吸取該培養液而從該液體排出口排出該培養液。
11. 如申請專利範圍第10項所述的生物材料培養裝置，其中該生物材料培養裝置為一肝細胞組織培養裝置，其更包括培養於該培養池中的肝細胞組織，其中該肝細胞組織培養裝置作為活體外(ex vivo)肝組織模型，用以進行藥物毒性測試、藥物動力學分析、 藥效學分析或藥物代謝分析。
12. 一種製作生物材料的方法，其包括提供如申請專利範圍第1項所述的生物材料培養裝置，將從正常或病理組織的細胞置入所述生物材料培養裝置的該培養池中並提供該培養液進行培養，而得到類組織(tissue constructs)或類器官(organoid)組織，並以培養所得到的該類組織或該類器官組織作為該生物材料。
13. 如申請專利範圍第12項所述的製作生物材料的方法，其中所述細胞為肝細胞，而培養後所得到該類組織或該類器官組織包括多層肝實質細胞，其堆疊為胰島狀微結構、肝壁狀微結構或整合為腔室狀結構。
14. 一種藥物毒性試驗方法，其包括提供如申請專利範圍第1項所述的生物材料培養裝置，將從正常或病理組織的細胞置入所述生物材料培養裝置的該培養池中並提供該培養液進行培養，得到類組織或類器官組織，並單一添加或連續添加藥物至培養所得到的該類組織或該類器官組織中，觀察該類組織或該類器官組織之變化，以分析該藥物對於該類組織或該類器官組織的毒性。
15. 如申請專利範圍第14項所述的藥物毒性試驗方法，其中所述細胞組織為肝細胞組織。
16. 如申請專利範圍第15項所述的藥物毒性試驗方法，其中觀察該類組織或該類器官組織之變化是利用碘化丙啶作為追蹤劑，以其顏色變化來觀察該類組織或該類器官組織之活力，而顯示其對於該藥物毒性的反應。