CN105343414B - 中药复方药物组合物的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了含有下述重量配比的原料药在制备促使胚胎干细胞向类雌性生殖细胞分化的诱导液中的用途：熟地18‑30份、山茱萸9‑12份、山药8‑16份、枸杞子9‑12份、菟丝子8‑16份、鹿角胶8‑16份、杜仲1‑16份、肉桂1‑9份、当归1‑16份、制附子1‑16份。本发明还公开了促使胚胎干细胞向类雌性生殖细胞分化的诱导液。本发明诱导液可以诱导胚胎干细胞向类雌性生殖细胞分化，临床应用前景良好。

Description

中药复方药物组合物的新用途

技术领域

本发明涉及一种中药复方药物组合物的新用途，具体地，是在制备促进胚胎干细胞向雌性生殖细胞分化的诱导液中的用途。

背景技术

近年来，由于环境污染严重、工作压力加大、饮食习惯改变、生殖系统疾病等因素对正常受孕造成不利影响，不孕症患者数量呈上升势头，发病率约为12.5％～15％，且有逐年增加趋势。因此世界卫生组织(WHO)宣布将不孕症与心血管病、肿瘤并列为当今影响人类生活和健康的三大主要疾病。自1978年全球首例试管婴儿诞生以来，以体外授精-胚胎移植(IVF-ET)为代表的辅助生殖技术(ART)的引入给不孕不育症的成功治疗提供了更大的可能。助孕的相关研究对于解决不孕不育患者的实际问题具有现实的意义。

体外受精(IVF)是指哺乳动物的精子和卵在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。获取合格的卵和精子，是体外受精的基础，目前，体外受精包括促排卵、卵泡检测与取卵、精子的优选与处理和体外受精步骤。诱发多个卵泡发育的促排卵是不孕治疗的重要基础，此环节早时使用自然周期排卵，但每一自然周期一般仅有一个卵泡成熟，提供卵少，导致实施以后步骤困难，且妊娠率低，现已被超排卵技术所取代。然而，超排卵技术是指应用人类促性腺激素促进更多卵泡成熟排卵的一种技术，由于此过程多个同时发育，雌二醇增加，引起反馈性的黄体生成素(LH)峰出现，导致卵早熟，质量差，妊娠率低，而且因药物过度使用引起的并发症，如卵巢过度刺激综合征(OHSS)、多胎妊娠、出生缺陷和表遗传学修饰异常等。因此，急需寻找其他合适的方法，制备生殖细胞。

同时，对于因机能衰退，体内无法发育得成熟生殖细胞的人群，如，绝经妇女，更需要寻找一种体外制备生殖细胞的方法。

右归丸出自明代温补名家张景岳的《景岳全书·新方八阵》，为补益肾阴、肾阳的经典方，具有调经、助孕、促卵泡发育及排卵、提高卵细胞质量以及提高卵受精率、促进早期胚胎发育的作用。

胚胎干细胞，简称ES、EK或ESC细胞，是早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺中分离出来的一类细胞。目前，未见右归丸影响胚胎干细胞向生殖细胞分化的报道。

发明内容

本发明的技术方案是提供了一种中药复方药物组合物的新用途。具体地，是在制备促使干细胞向雌性生殖细胞分化的诱导液中的用途。

本发明含有下述重量配比的原料药在制备促使胚胎干细胞向雌性生殖细胞分化的诱导液中的用途：熟地18-30份、山茱萸9-12份、山药8-16份、枸杞子9-12份、菟丝子8-16份、鹿角胶8-16份、杜仲1-16份、肉桂1-9份、当归1-16份、制附子1-16份。

优选地，所述原料药的重量配比如下：熟地24份、山茱萸9-12份、山药12份、枸杞子9-12份、菟丝子12份、鹿角胶12份、杜仲12份、肉桂6份、当归9份、制附子6份。

进一步优选地，所述原料药的重量配比如下：熟地24份、山茱萸9份、山药12份、枸杞子9份、菟丝子12份、鹿角胶12份、杜仲12份、肉桂6份、当归9份、制附子6份。

本发明促使胚胎干细胞向雌性生殖细胞分化的诱导液，它以常用细胞培养基为基础培养基，添加含药血清，其终浓度为2～20％(v/v)；

所述含药血清按照如下方法制备：

(1)按照前述配比取原料药，制备成为超细粉，以5.0g/kg的剂量施用于鼠，施用方式为口服给药；

(2)给药30min、60min、90min后，眼底静脉丛取血，分别静置、离心得上清液，混匀，过滤除菌，即可。

常用细胞培养基，是指包含供给细胞营养和促使细胞增殖的基础物质的培养基，如，α-MEM培养基(又叫MEM培养基，Minimum Essential Medium)、DMEM-高糖培养基、DMEM-低糖培养基、RPMI-1640培养基、DMEM/F12培养基或M-199培养基。

所述含药血清的终浓度为4.5～5％(v/v)。

所述常用细胞培养基为α-MEM培养基、DMEM-高糖培养基、DMEM-低糖培养基、RPMI-1640培养基、DMEM/F12培养基或M-199培养基。

所述诱导液中还添加有终浓度为10～20％(v/v)的胎牛血清和/或1％(v/v)青链霉素。

青链霉素：即青霉素和链霉素的混合液，其中，青霉素的含量为10000U/ml，链霉素的含量为10mg/ml。

本发明提供了一种促使胚胎干细胞向雌性生殖细胞分化的方法，步骤如下：取胚胎干细胞，置于前述的诱导液中培养至少3天，即可。

本发明补肾中药复方右归丸可以上调胚胎干细胞中与雌性生殖细胞相关的基因表达，促进其向雌性生殖细胞分化，为雌性生殖细胞的体外构建提供了新方法，临床应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1未分化的MESC-1B10的生长

图2 MESC-1B10的EB形成

图3 ZGW-RS对贴壁的EB的形态学影响

图4 YGW-RS对贴壁的EB的形态学影响

图5 RBS对贴壁的EB的形态学影响

具体实施方式

实施例1本发明诱导液的制备

1、含药血清的制备

SD大鼠，清洁级，6～8周龄，体重220～250g，♀兼用，各15只，许可证号：SCXK(川)2004-15；四川省医学科学院实验动物研究所提供。动物饲养于清洁级动物室，温度22±2℃，湿度40～70％，10h/14h明暗交替，每3min自动换气一次，常规全价颗粒饲料喂养，自由饮水，♀分开饲养于不锈钢饲养笼内。

对小鼠灌服药物组合物(熟地30g、山茱萸12g、山药16g、枸杞子12g、菟丝子16g、鹿角胶16g、杜仲16g、肉桂9g、当归16g、制附子16g)，给药剂量为5.0g/kg，给药容量均为20ml/kg，空白组大鼠灌服蒸馏水。分别于给药后30min、60min、90min眼底静脉丛取血，血液静置2小时后，3000rpm离心10min，分离各组各不同时间段血清，将每组三个时间段的血清混匀，过滤除菌，即得本发明含药血清。

2、诱导液的制备

将步骤1制得的含药血清加入α-MEM培养基中，至其终浓度为2％(v/v)，即可。

实施例2本发明诱导液的制备

1、含药血清的制备

SD大鼠，清洁级，6～8周龄，体重220～250g，♀兼用，各15只，许可证号：SCXK(川)2004-15；四川省医学科学院实验动物研究所提供。动物饲养于清洁级动物室，温度22±2℃，湿度40～70％，10h/14h明暗交替，每3min自动换气一次，常规全价颗粒饲料喂养，自由饮水，♀分开饲养于不锈钢饲养笼内。

对小鼠灌服药物组合物(熟地18g、山茱萸9g、山药8g、枸杞子9g、菟丝子8g、鹿角胶8g、杜仲1g、肉桂1g、当归1g、制附子1g)，给药剂量为5.0g/kg，给药容量均为20ml/kg，空白组大鼠灌服蒸馏水。分别于给药后30min、60min、90min眼底静脉丛取血，血液静置2小时后，3000rpm离心10min，分离各组各不同时间段血清，将每组三个时间段的血清混匀，过滤除菌，即得本发明含药血清。

2、诱导液的制备

将步骤1制得的含药血清加入DMEM高糖培养基中，至其终浓度为20％(v/v)，即可。

实施例3本发明诱导液的制备

1、含药血清的制备

SD大鼠，清洁级，6～8周龄，体重220～250g，♀兼用，各15只，许可证号：SCXK(川)2004-15；四川省医学科学院实验动物研究所提供。动物饲养于清洁级动物室，温度22±2℃，湿度40～70％，10h/14h明暗交替，每3min自动换气一次，常规全价颗粒饲料喂养，自由饮水，♀分开饲养于不锈钢饲养笼内。

对小鼠灌服药物组合物(右归丸：熟地24g、山茱萸9g、山药12g、枸杞子9g、菟丝子12g、鹿角胶12g、杜仲12g、肉桂6g、当归9g、制附子6g)，给药剂量为5.0g/kg，给药容量均为20ml/kg，空白组大鼠灌服蒸馏水。分别于给药后30min、60min、90min眼底静脉丛取血，血液静置2小时后，3000rpm离心10min，分离各组各不同时间段血清，将每组三个时间段的血清混匀，过滤除菌，即得本发明含药血清。

2、诱导液的制备

将步骤1制得的含药血清加入DMEM低糖培养基中，至其终浓度为4.5％(v/v)，即可。

实施例4本发明诱导液的制备

1、含药血清的制备

SD大鼠，清洁级，6～8周龄，体重220～250g，♀兼用，各15只，许可证号：SCXK(川)2004-15；四川省医学科学院实验动物研究所提供。动物饲养于清洁级动物室，温度22±2℃，湿度40～70％，10h/14h明暗交替，每3min自动换气一次，常规全价颗粒饲料喂养，自由饮水，♀分开饲养于不锈钢饲养笼内。

对小鼠灌服药物组合物(右归丸：熟地24g、山茱萸12g、山药12g、枸杞子12g、菟丝子12g、鹿角胶12g、杜仲12g、肉桂6g、当归9g、制附子6g)，给药剂量为5.0g/kg，给药容量均为20ml/kg，空白组大鼠灌服蒸馏水。分别于给药后30min、60min、90min眼底静脉丛取血，血液静置2小时后，3000rpm离心10min，分离各组各不同时间段血清，将每组三个时间段的血清混匀，过滤除菌，即得本发明含药血清。

2、诱导液的制备

将步骤1制得的含药血清加入RPMI-1640培养基中，至其终浓度为5％(v/v)，即可。

以下是通过药效实验及临床实验证明本发明的有益效果。

1材料

1.1实验动物及细胞株SD大鼠24只，清洁级，体重180～220g，雌雄各半，四川实验动物合格证号SCXK(川)2008-19。实验动物使用许可证号SYXK(川)2008-100。MESC-1B10细胞株为四川大学刘聪教授馈赠。

1.2药品、试剂和耗材左归丸、右归丸为成都中医药大学药学院制备。DMEM高糖培养液、胎牛血清(FBS)、细胞培养用双抗(青霉素和链霉素)、磷酸缓冲液(PBS)、细胞消化用胰蛋白酶均购自成都哈里公司，批号分别为20130401、20130405、20130315、20130505、20130408；非必需氨基酸(NEAA)，美国Gibco公司，批号：03985 K11；β-巯基乙醇(β-ME)，美国Gibco公司，批号：862986；白血病抑制因子(LIF)，美国Millipore公司，批号：1993949。普通细胞6孔培养板和超低吸附培养6孔板购自美国Corning公司，批号分别为04718601、10312041；RNA提取试剂盒Tri Reagent，美国Molecular Research Center公司，批号：4071；反转录试剂盒iSCRIPT cDNA SYNTHES，美国Bio-Rad公司，批号：T730001972；qPCR试剂盒iQ SYBR GRN，美国Bio-Rad公司，批号：T760000082。

1.3仪器UPR-I-10T纯水机(中国优普公司)；3111型CO2细胞培养箱(美国ThermoScientific公司)；SW-CJ-2FD超净工作台(中国苏州净化公司)；TDL-40B型大体积离心机(中国Anke公司)；Legend Micro 17R型高速台式冷冻离心机(美国Thermo公司)；DMI3000B型倒置显微镜(德国Leica公司)；CFX96型定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)。

2方法

2.1小鼠胚胎干细胞的培养培养MESC-1B10的饲养层细胞使用小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3。培养NIH3T3的培养液为DMEM高糖培养液，其中含10％FBS、100U/ml盘尼西林、0.1mg/ml链霉素。培养MESC-1B10的培养液为DMEM高糖培养液，其中含17％FBS、100U/ml盘尼西林、0.1mg/ml链霉素、0.1mmol/L的NEAA、0.1mmol/L的β-ME和1000U/ml LIF。待培养孔中的NIH3T3生长到90％汇合度时，加入丝裂霉素C至终浓度为10μg/ml，将培养板放入细胞培养箱中孵育3h，而后用无菌PBS清洗细胞5遍。在培养孔中加入适量的培养MESC-1B10的培养液，将MESC-1B10接种至培养孔，每天更换培养MESC-1B10的培养液，4～7d后，可见干细胞克隆出现。

2.2拟胚体(EB)的诱导形成诱导EB形成的培养液与培养MESC-1B10的培养液成分一样，只是没有LIF。EB形成的操作程序如下：往培养孔中加入细胞消化用胰蛋白酶；将培养板放入细胞培养箱中消化3min；吹打消化下来的细胞至细胞呈单细胞状态；细胞混合液放入细胞培养箱中静置30min，以利用差速贴壁法分离饲养层细胞NIH3T3和MESC-1B10；收集混合液静置后的上清液(大部分悬浮细胞为MESC-1B10)，移入超低吸附培养板；24h后，可观察到悬浮的类圆形的EB形成，再过24h，收集所有EB待用。

2.3大鼠含药血清及空白血清(RBS)的制备取SD大鼠24只，适应性饲养1周后，随机分为左归丸血清组ZGW-RS(左归丸：熟地黄200g、菟丝子100g、牛膝75g、龟板胶100g、鹿角胶100g、山药100g、山茱萸100g、枸杞子100g)、右归丸含药血清组YGW-RS(右归丸：熟地24g、山茱萸9g、山药12g、枸杞子9g、菟丝子12g、鹿角胶12g、杜仲12g、肉桂6g、当归9g、制附子6g)和空白血清组RBS，每组6只，雌雄各半。含药血清组分别灌服液化后药物，给药剂量均为5.0g/kg，给药容量均为20ml/kg，空白组大鼠灌服蒸馏水。分别于给药后30min、60min、90min眼底静脉丛取血，血液静置2h后，3000rpm离心10min，分离各组各不同时间段血清，将每组三个时间段的血清混匀，过滤除菌备用。

2.4大鼠含药血清对MESC-1B10形成的EB的干预将收集得到的EB移入普通细胞培养板。24h内EB贴壁并生长。24h后，对相应的培养孔中分别加入各药物的大鼠含药血清和RBS，血清的终浓度为4.5％(v/v)，同时设不加入任何血清的空白对照。干预72h后，对各孔进行显微照像，以对比细胞形态的变化。

2.5实时荧光定量PCR分析(qPCR)贴壁的EB被干预72h后，利用RNA提取试剂盒TriReagent提取各孔的总RNA，而后以提取的RNA为模板利用cDNA合成试剂盒合成cDNA，最后以cDNA为模板利用qPCR试剂盒进行qPCR分析，目标基因为9种与生殖分化相关的基因，分别为：Oct-4、GDF-9、SCP3、Mvh、ZP2、ZP3、Itga6、Itgb1和TP2。Oct-4被发现对于保持干细胞全能性十分重要，Oct-4被过多上调或者过多下调都将导致干细胞分化；GDF-9是干细胞向雌性生殖细胞分化的早期标记基因；Stra8被发现对向雌性生殖细胞分化和雄性生殖细胞分化有作用；SCP3是减数分裂的关键基因之一；Mvh对于向雌性生殖细胞和雄性生殖细胞分化都重要，属于干细胞分化的早期标记基因之一；ZP2和ZP3是卵细胞形成的标记基因；Itga6、Itgb1和TP2是精子细胞形成的标记基因。分析中以β-actin为内参基因，具体基因名称和各引物序列见表1。

表1 qPCR分析中的相关基因名称及引物序列

2.6数据分析

所有数据均用表示，运用统计分析软件SPSS 13.0的独立样本t检验分析所有数据，P<0.05为有显著性差异，P<0.01为有极其显著性差异。

3结果

3.1胚胎干细胞MESC-1B10的生长情况监测

如图1～2所述，在饲养层细胞NIH3T3之上，MESC-1B10形成了“鸟巢”状的克隆，在超低吸附孔中形成了类圆形的EB，与文献报道一致，说明胚胎干细胞MESC-1B10生长正常。

3.2含药血清干预贴壁生长的EB

贴壁生长的EB分别被ZGW-RS、YGW-RS和RBS等血清干预，72h后，干预对于EB形态的影响如图3～5所示。

由图可见：ZGW-RS干预后，细胞碎片较多，同时细胞克隆的边缘较模糊；YGW-RS干预后，细胞碎片少，同时细胞克隆的边缘较清晰；RBS与ZGW-RS类似，细胞碎片较多，同时细胞克隆的边缘较模糊。实验结果说明，在右归丸含药血清中，细胞可以更好的生长。

3.3含药血清对MESC-1B10的生殖分化相关基因转录表达的影响

将ZGW-RS、YGW-RS分别与RBS的数据比较，结果如表2和表3所示：

表2 ZGW-RS对MESC-1B10的9种生殖分化相关基因表达模式的影响

Gene	功能	Gene	Change(％)	P-value
					Oct-4	干细胞分化的标记基因	Oct-4	↑233.06	0.0017<sup>**</sup>
Mvh	干细胞分化的标记基因	Mvh	↓31.63	0.1872
					SCP3	减数分裂的关键基因	SCP3	↑172.51	0.0015<sup>**</sup>
GDF-9	干细胞向雌性生殖细胞分化的早期标记基因	GDF-9	↓96.73	0.0001<sup>**</sup>
					ZP2	卵细胞形成的标记基因	ZP2	↓19.03	0.7166
ZP3	卵细胞形成的标记基因	ZP3	↓4.04	0.8093
					Itga6	精子细胞形成的标记基因	Itga6	↓60.05	0.0034<sup>**</sup>
Itgb1	精子细胞形成的标记基因	Itgb1	↓88.56	0.0029<sup>**</sup>
					TP2	精子细胞形成的标记基因	TP2	↓33.31	0.6946

注：与RBS比较，^*:P<0.05；^**:P<0.01

由表2可以看出，左归丸可以促使胚胎干细胞中与减数分裂相关的基因的表达，但是会抑制与生殖分化相关的基因的表达。实验结果说明，左归丸可以促进胚胎干细胞减数分裂，但是会阻碍其向生殖细胞分化。

表3 YGW-RS对MESC-1B10的9种生殖分化相关基因表达模式的影响

Gene	功能	Change(％)	P-value
				Oct-4	干细胞分化的标记基因	↑61.92	0.0275<sup>*</sup>
Mvh	干细胞分化的标记基因	↑184.61	0.0023<sup>**</sup>
				SCP3	减数分裂的关键基因	↑113.83	0.0044<sup>**</sup>
GDF-9	干细胞向雌性生殖细胞分化的早期标记基因	↑69.44	0.0337<sup>*</sup>
				ZP2	卵细胞形成的标记基因	↑7.25	0.8918
ZP3	卵细胞形成的标记基因	↑16.24	0.1893
				Itga6	精子细胞形成的标记基因	↓39.57	0.0233<sup>*</sup>
Itgb1	精子细胞形成的标记基因	↓80.64	0.0025<sup>**</sup>
				TP2	精子细胞形成的标记基因	↓41.08	0.6320

注：与RBS比较，^*:P<0.05；^**:P<0.01

由表3可以看出，右归丸可以促使胚胎干细胞中与减数分裂相关基因的表达，促使与雌性生殖分化相关基因的表达，并抑制与雄性生殖分化相关基因的表达。实验结果说明，右归丸可以促进胚胎干细胞向雌性生殖细胞分化。

Claims (6)

1.含有下述重量配比的原料药在制备促使胚胎干细胞向雌性生殖细胞分化和提高Oct-4基因、Mvh基因、SCP3基因、GDF-9基因、ZP2基因、ZP3基因的表达水平的诱导液中的用途：熟地24份、山茱萸9份、山药12份、枸杞子9份、菟丝子12份、鹿角胶12份、杜仲12份、肉桂6份、当归9份、制附子6份；

所述胚胎干细胞是小鼠胚胎干细胞。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述诱导液是降低Itga6基因、Itgb1基因、TP2基因的表达水平的诱导液。

3.一种促使胚胎干细胞向雌性生殖细胞分化和提高Oct-4基因、Mvh基因、SCP3基因、GDF-9基因、ZP2基因、ZP3基因的表达水平的方法，其特征在于：取胚胎干细胞，置于诱导液中培养至少3天，即可；

所述诱导液是以常用细胞培养基为基础培养基，并添加有含药血清，含药血清的终浓度为2~20%（v/v）；

所述含药血清按照如下方法制备：

（1）按照权利要求1或2所述配比取原料药，制备成为超细粉，以5.0g/kg的剂量施用于鼠，施用方式为口服给药；

（2）给药30min、60min、90min后，眼底静脉丛取血，分别静置、离心得上清液，混匀，过滤除菌，即可；

所述胚胎干细胞是小鼠胚胎干细胞。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述含药血清的终浓度为4.5~5%（v/v）。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述常用细胞培养基为α-MEM培养基、DMEM-高糖培养基、DMEM-低糖培养基、RPMI-1640培养基、DMEM/F12培养基或M-199培养基。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述诱导液中还添加有终浓度为10~20%（v/v）的胎牛血清和/或1%（v/v）青链霉素。