CN101054572B - 人脐血干细胞培养及定向分化为多巴胺能神经细胞的方法及得到的多巴胺能神经细胞的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及人脐血干细胞培养及定向分化为多巴胺能神经细胞的方法、所得到的多巴胺能神经细胞及其应用。根据本发明的由脐带血干细胞定向分化为多巴胺能神经细胞的方法，包括以下步骤：a)脐血干细胞培养：从脐带血中分离脐带血单个核细胞，分离出的脐带血单个核细胞接种在具有盖玻片的多孔板中，置于约36.5-37.5℃、3-8％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养，得到培养后的脐血干细胞；b)多巴胺能神经细胞的诱导分化：取生长状态良好的脐血干细胞，待其生长至第12-16天达70％-90％融合时全量换液，使用条件培养液诱导剂或生长因子诱导剂进行诱导分化，得到多巴胺能神经细胞。根据本发明的方法，可以提供大量由脐带血干细胞定向分化的多巴胺能神经细胞。

Description

人脐血干细胞培养及定向分化为多巴胺能神经细胞的方法及得到的多巴胺能神经细胞的应用

技术领域

本发明涉及人脐血干细胞的培养及分化，尤其涉及由人脐血干细胞培养及定向分化为多巴胺能神经细胞的方法、所得到的多巴胺能神经细胞及其应用。

背景技术

多巴胺(dopamine，DA)能神经细胞在人体自身运动、情感行为和认知能力方面具有非常重要的作用，黑质内DA能神经细胞的损伤或功能退化会使纹状体中的多巴胺含量减少，进而导致帕金森病(Parkinson’s disease，PD)。目前细胞移植是治疗此类神经系统疾病的新的治疗途径，因此如何在体外获取大量的DA神经细胞是进行帕金森病细胞移植和替代治疗的关键所在。已有研究发现人或鼠骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞、神经干细胞可定向诱导分化为DA能神经细胞，请参见Guo L，Yin F，Meng HQ，et al.Differentiation of mesenchymal stem cells into dopaminergicneuron-like cells in vitro[J].Biomed Environ Sci，2005，18(1)：36-42；郭雨霁，高英茂，邴鲁军，纹状体组织块诱导胚胎干细胞定向分化的实验研究[J].山东大学学报(医学版)，2003，41(2)：97-100；Potter ED，Ling ZD，Carvey PM.Cytokine-induced conversion ofmesen-cephalic derived progenitor cells into dopamine neurons[J].CellTissue Res，1999，296(2)：235-246。但是种子细胞的来源存在诸如取材困难、伦理等问题。

因此，需要一种将来自其它来源的细胞定向诱导分化为DA能神经细胞的方法。

发明内容

本发明的目的之一是克服现有技术的不足，提供一种人脐带血干细胞的培养方法，包括以下步骤：

1)脐带血细胞分离步骤：将脐带血中的红细胞沉降，提取血浆层，离心，弃上清后用PBS重悬制备成单细胞悬液，然后叠加在等体积的淋巴细胞分离液上，以1600-2000r/min的速度离心15-25分钟，吸取两相界面之间的细胞层，用细胞培养基重悬得到分离后的脐带血单个核细胞；

2)脐带血干细胞培养步骤：将前一步分离出的脐带血单个核细胞接种在已用多聚赖氨酸或鼠尾胶原包被过的具有盖玻片的多孔板中，在36.5-37.5℃、3-8％的CO₂、饱和湿度的培养箱中培养，得到脐带血干细胞。

根据本发明的方法，其中所述细胞培养基包含10％FBS、100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素。

根据本发明的方法，其中使用0.5％的甲基纤维素溶液进行红细胞沉降。

本发明另一目的是提供一种由脐带血干细胞定向分化为多巴胺(DA)能神经细胞的方法，包括以下步骤：

1)脐血干细胞培养：从脐带血中分离脐带血单个核细胞，将分离出的脐带血单个核细胞接种在具有盖玻片的多孔板中，置于约36.5-37.5℃、3-8％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养，得到培养后的脐血干细胞；

2)多巴胺能神经细胞的诱导分化：取生长状态良好的脐血干细胞，待其生长至第12-16天达70％-90％融合时全量换液，使用条件培养液诱导剂或生长因子诱导剂进行诱导分化，得到多巴胺能神经细胞。

根据本发明的方法，其中所述条件培养液诱导剂为纹状体条件培养液、星形胶质细胞条件培养液或羊膜上皮细胞条件培养液。

根据本发明的方法，其中所述生长因子诱导剂为ATRA+EGF+bFGF。

根据本发明的方法，其中所述多孔板在使用前先用多聚赖氨酸或鼠尾胶原处理。

根据本发明的方法，在培养箱中的培养包括在首次全量更换培养液，以后根据细胞生长情况进行半量换液一次。

本发明还提供由根据本发明的方法得到的从脐带血分离培养得到的脐带血干细胞。

本发明还提供由根据本发明的方法得到由脐带血干细胞定向分化得到的多巴胺能神经细胞。

本发明还提供由脐带血干细胞定向分化得到的多巴胺能神经细胞在制备用于治疗神经系统疾病的药物中的应用。

附图说明

通过结合附图详细地描述本发明的典型实施例，本发明的上述和其它特征以及优点将变得更加显而易见，附图中：

图1为脐血细胞培养第3天形成的巢样克隆×4；

图2为脐血细胞培养第14天呈较为均一的梭形×4；

图3为脐血细胞培养后的流式细胞分析结果；

图4为星形胶质细胞的GFAP免疫荧光染色×20；

图5为EGF+bFGF组TH免疫荧光阳性细胞×20；

图6为ATRA组TH免疫荧光阳性细胞×20；

图7为ATRA+EGF+bFGF组TH免疫荧光阳性细胞×20；

图8为纹状体条件培养液组TH免疫荧光阳性细胞×20；

图9为星形胶质细胞条件培养液组TH免疫荧光阳性细胞×20；

图10为羊膜上皮细胞条件培养液组TH免疫荧光阳性细胞(×40)；

图11为脐带血干细胞Nestin染色结果(×10)；

图12显示了对照组DAT免疫荧光染色(×40)结果；

图13显示了星形胶质细胞条件培养液组DAT免疫荧光染色(×40)；

图14显示了纹状体条件培养液组DAT免疫荧光染色(×100)；

图15显示了羊膜上皮细胞条件培养液组DAT免疫荧光染色(×100)；以及

图16显示了P1代脐带血干细胞不同诱导组TH、DAT的western-blotting分析结果；其中a、对照组；b、星形胶质细胞CM组；c、纹状体细胞CM组；d、羊膜上皮细胞CM组。

具体实施方式

与骨髓间充质干细胞相比，脐血干细胞具有来源丰富、采集方便、免疫源性更弱、细菌污染率低、不涉及伦理问题等优点，这就为PD的细胞移植或替代治疗提供了一种新的种子细胞来源途径。目前在体外条件下诱导人脐血干细胞定向分化为某一特定表型的神经细胞的研究甚少，原因在于脐血干细胞培养比较困难。本申请的发明人意外地发现从健康新生儿的脐带血中可以成功地分离出脐血干细胞，并且在一定条件下将分离出的脐血干细胞成功地进行培养，而且经过培养的脐血干细胞在一定条件下可以定向分化为DA能神经细胞。

本发明的一个方面提供了一种脐带血干细胞的培养方法，包括以下步骤：

1)脐带血细胞分离步骤，包括：收集健康新生儿的脐带血，用无菌PBS等体积稀释，然后按大约1∶2-1∶6(优选1∶4)的比例加入0.5％的甲基纤维素溶液(用于沉降红细胞，然后去除)，混匀，静置40～60min，吸取血浆层离心，弃上清后用PBS重悬制备成单细胞悬液，然后叠加在等体积的淋巴细胞分离液上(用于分离单个核细胞)，以1600-2000r/min，优选1800r/min的速度离心15-25分钟，形成两相，小心吸取界面层的细胞，PBS洗涤2-4次，再用培养细胞的培养基(H-DMEM完全培养液，含10％FBS、100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素)重悬，得到分离后的脐血单个核细胞；

2)脐带血干细胞培养步骤：将前一步分离出的脐血细胞以5×10⁶细胞/ml的密度接种在已用多聚赖氨酸或鼠尾胶原等(用于细胞贴附)包被过的具有盖玻片的多孔板中，置于在36.5-37.5℃、3-8％的CO₂、饱和湿度的培养箱中培养，(培养箱的条件优选为37℃、5％的CO₂、饱和湿度)得到培养后的脐血干细胞。

脐带血干细胞鉴定：

(1)流式细胞仪检测其表面标志：待细胞达80％～90％融合时，常规消化后，用PBS洗涤2次，调整细胞浓度为1×10⁶细胞/ml，加入鼠抗人CD34-FITC、CD90-PCY5、CD166-PE，置于4℃孵育30min，然后离心弃去染液，用PBS洗涤2次，最后制备成500μl单细胞悬液，上机对细胞表面抗原进行检测。阴性对照采用抗体同型对照，孵育方法同实验组。流式分析结果显示，脐血单个核细胞培养14天后可稳定表达CD90、CD166等间充质干细胞表面抗原，但极少表达CD34等造血干细胞表面抗原(图3)。

(2)经Nestin染色呈阳性，如图11所示。

上述结果显示脐血单个核细胞经分离培养14天左右可以获得纯度较高的脐带血干细胞。

本发明另一方面提供一种由脐带血干细胞定向分化为多巴胺(DA)能神经细胞的方法，包括以下步骤：

取生长状态良好的脐血干细胞，待其生长至第14天左右达70％融合时全量换液，分别换加不同诱导剂对其进行诱导分化。诱导剂分组情况如下：

1)对照组：即仅使用空白完全培养液(简称C组)；

2)ATRA组：即在原完全培养液中加入ATRA 10μg/L；

3)EGF+bFGF组：即在原完全培养液中加入EGF、bFGF各10μg/L；

4)ATRA+EGF+bFGF组：即在原完全培养液中加入ATRA、EGF、bFGF各10μg/L；

5)纹状体条件培养液组(简称W组)；

6)星形胶质细胞条件培养液组(简称X组)；

7)羊膜上皮细胞条件培养液(简称Y组)。

在对PD的细胞移植和替代治疗中，移植细胞的数量以及多巴胺能神经细胞的分化比例是最为关键的问题，因此诱导方式和诱导剂的选择相当重要。

曾有研究证明，某些细胞因子和化学因子(如bFGF、EGF、ATRA)与机体神经系统的发育以及神经分化密切相关。bFGF是一种可以明显促进有丝分裂的多肽因子，在神经营养方面具有广谱性，在促进神经外胚层向神经前体细胞转化环节上起重要作用。EGF能够促进神经前体细胞的存活和增殖，并且在增殖后期发挥作用，参见Ciccolini F.Identification of two distinct types of multipotentneural precursors that appear sequentially during CNS development[J].Mol Cell Neurosci，2001，17(5)：895-907。二者均可以促进细胞分化并决定细胞分化方向。ATRA是一种作用很强的分化诱导剂，能够增强细胞间黏附，调节神经系统相关基因，在调控多种组织和细胞的形态发生、增殖、分化、代谢方面具有广泛的生物学作用，并且可以诱导胚胎干细胞向DA能神经细胞定向分化，参见Dinsmore J，Ratliff J，Jacoby D，et al.Embryonic stem cells as a model for studyingregulation of cellular differentiation[J].Theriogenology，1998，49(1)：145-151。本申请的发明人发现，对脐血干细胞的定向诱导作用方面bFGF、EGF的诱导作用弱于ATRA，但效果均不理想。但当bFGF、EGF与ATRA联合发挥作用时，则可以明显提高脐血干细胞分化DA能神经细胞的比例。因此发明人推测在定向诱导方面bFGF、EGF可能与ATRA存在交叉和协同作用。虽然ATRA是人体发育所必需的，但文献报道若其浓度使用不当就可能成为致畸剂，潜在风险较大，故不宜应用于临床。

本发明采用了三种条件培养液(CM)作为诱导剂，其分别为：纹状体条件培养液组(简称W组)；星形胶质细胞条件培养液组(简称X组)；羊膜上皮细胞条件培养液(简称Y组)。

A.纹状体条件培养液的制备：

切取哺乳动物(例如大鼠、小鼠、兔子、猴子)的脑组织中的纹状体组织，解剖镜下仔细去除脑膜、血管等纤维结构，用PBS吹打成单细胞悬液，离心洗涤2～3次，再用L-DMEM/F12完全培养液(含10％FBS、100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素)重悬，接种在培养瓶置于37℃、5％的CO₂、饱和湿度的培养箱中培养。每天收集细胞培养液，离心3000r/min×20min，取上清经0.22μm的微孔滤膜过滤，冻存备用。使用前与H-DMEM完全培养液按3/2(v/v)比例混合，即制成纹状体条件培养液。

B.星形胶质细胞条件培养液的制备：

先对纹状体细胞进行原代培养，待细胞融合达90％时全量换液，置于水平恒温摇床37℃、250r/min震荡18h，然后按常规方法胰酶消化传代。星型胶质细胞纯度达95％以上(图4)。传代后第1天换加H-DMEM完全培养液，然后每天收集细胞培养液，用上述方法离心过滤，-20℃冻存备用。使用前与H-DMEM完全培养液按3/2(v/v)比例混合，即制成(纹状体)星形胶质细胞条件培养液。

C.羊膜上皮细胞条件培养液的制备：

包括以下步骤：

准备带有绒毛膜的羊膜。用镊子小心将羊膜和绒毛膜剥离，剥下羊膜呈白色，半透明状薄膜。将剥下的羊膜剪成糜状。将剪碎的组织放入锥形瓶中，根据组织体积再加入DMEM和2％胰酶，使胰酶终浓度为0.2％。将锥形瓶放入水浴摇床内，37℃，120转/分钟，消化1小时。加入等体积含有胎牛血清的DMEM终止消化反应。进一步混匀，过150目细胞筛，收集细胞悬液。离心机离心此细胞悬液，1000rpm离心8分钟，弃上清，用含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM重悬细胞。以1×10⁶个/ml细胞密度种植于培养瓶中，37℃，5％CO₂，培养箱进行培养，约每6天传代一次。取P1代细胞上清，离心、过滤后，以羊膜上清与DMEM 4∶6的比例制成羊膜上皮细胞条件培养液。

多巴胺能神经细胞的鉴定：

对使用诱导剂诱导分化后的细胞进行免疫荧光染色、实时定量RT-PCR检测、Western blotting分析、高压液相色谱检测，结果显示诱导分化后的细胞具有多巴胺能神经细胞的特征，并且该多巴胺能神经细胞可以分泌多巴胺，具有多巴胺能神经细胞的功能。

本发明的实验结果显示在采用不同诱导剂的各种诱导方案中，采用星形胶质细胞条件培养液的定向诱导作用最强，DA能神经细胞分化率最高，分化比率为10.53％，纹状体条件培养液的诱导作用略次之，分化比率为10.02％，二者之间比较无显著性差异。采用羊膜上皮细胞条件培养液的分化比率为9.66％。

以上结果显示：条件培养液提供的微环境可能在细胞定向分化过程中起着极其重要的作用，而星形胶质细胞则可能是发挥作用的主导因素。条件培养液既可以模拟体内微环境，又可以排除纹状体细胞对脐血干细胞的直接接触诱导作用，由此证明纹状体组织可能通过释放一些细胞生长因子发挥作用，诱导脐血干细胞向DA能神经细胞方向分化。星形胶质细胞是纹状体组织的主要细胞，体外分离后仍能够分泌多种神经营养因子和生长因子，如胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、脑源性生长因子(BDNF)、神经营养素-3(NT-3)、睫状神经营养因子(CNTF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)以及多种细胞黏附分子，这对DA能神经细胞具有明显的营养、保护和诱导分化的作用，其中，GDNF可以促进体内外DA能神经细胞存活和分化，BDNF有诱导神经干细胞向神经细胞分化的作用，NT-3可以促进神经前体细胞存活、增殖及神经细胞再生，CNTF则具有神经营养、保护及促增殖作用，这些因子可能通过某种共有途径相互协同发生作用从而促进了DA能神经细胞分化率的提高。

基于上述内容，可以推断纹状体组织对脐血干细胞的定向诱导作用可能主要源于纹状体的星形胶质细胞，条件培养液可以为脐血干细胞的定向分化提供较为适宜的诱导微环境。

实施例

材料和方法

材料来源：

脐血样本取自首都医科大学附属天坛医院和友谊医院产科健康育龄产妇足月正常产或剖宫产婴儿的脐带。新生SD大鼠(出生24小时内)由本校实验动物中心提供。

试剂：

L-DMEM/F12、H-DMEM培养基(Gibco公司，美国)；胎牛血清(FBS，Hyclone公司，美国)；人淋巴细胞分离液(1.077g/ml，天津TBD公司)；甲基纤维素450(Sigma公司，密苏里州，美国)；碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、全反式维甲酸(ATRA)(晶美生物试剂公司)；小鼠抗人酪氨酸羟化酶(TH)单克隆抗体(首都医科大学附属宣武医院惠赠)；小鼠抗大鼠胶质纤维酸性蛋白(GFAP)单克隆抗体(Sigma公司)；鼠抗人CD34-FITC、CD90-PCY5、CD166-PE(BD PharMingen公司)；异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗小鼠IgG、Hoechst 33342(Sigma公司)。

实施例1脐血干细胞的分离、培养及鉴定

分离、培养：收集健康新生儿的脐带血40～60ml，用无菌PBS等体积稀释，然后按1∶4比例加入0.5％的甲基纤维素溶液，混匀，静置40～60min，吸取血浆层离心，弃上清后用PBS重悬制备成单细胞悬液，然后叠加在等体积的淋巴细胞分离液上，离心1800r/min×20min，小心吸取界面细胞层，用PBS洗涤3次，再用H-DMEM完全培养液(含10％FBS、100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素)重悬，以5×10⁶细胞/ml的密度接种在已用多聚赖氨酸包被过含有盖玻片的12孔板中，置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养。根据细胞形态，首次7天全量更换培养液，以后根据细胞生长情况每2天半量换液一次。

鉴定：每天在倒置显微镜下观察细胞形态变化。而且，培养一定时间后，用流式细胞仪检测其表面标志：待细胞达70％～90％融合时，常规消化后，用PBS洗涤2次，调整细胞浓度为1×106细胞/ml，加入鼠抗人CD34-FITC、CD90-PCY5、CD166-PE，置于4℃孵育30min，然后离心弃去染液，用PBS洗涤2次，最后制备成500μl单细胞悬液，上机对细胞表面标志进行检测。阴性对照采用抗体同型对照，孵育方法同实验组。

观察结果显示：脐血单个核细胞培养3天后部分细胞贴壁，生成较多的巢样细胞克隆(图1)，少量细胞有出芽现象；7～9天时可见有些细胞出现细丝状突起，呈纤维样，另有一些破骨样细胞；随培养时间的推移，破骨样细胞可逐渐减少，14～16天左右可见贴壁细胞形态逐渐趋于均一的梭形，相邻细胞突起连接成网状(图2)。流式分析结果显示：脐血单个核细胞培养14天后可稳定表达CD90、CD166等脐带血干细胞表面抗原，但极少表达CD34等造血干细胞表面抗原(图3)。此结果显示脐血单个核细胞经分离培养14天左右可以获得纯度较高的脐带血干细胞(也可称为间充质干细胞)。

实施例2纹状体条件培养液的制备

取新生SD大鼠(出生24h内)断颈处死后完整剥离大脑组织，置于4℃的PBS中，切取纹状体组织，解剖镜下仔细去除脑膜、血管等纤维结构，用PBS吹打成单细胞悬液，离心洗涤2～3次，再用L-DMEM/F12完全培养液(含10％FBS、100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素)重悬，以2.5×10⁵细胞/ml的密度接种在25cm²培养瓶置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养。3天后全量换液，6天时换加H-DMEM完全培养液，每天收集细胞培养液，离心3000r/min×20min，取上清经0.22μm的微孔滤膜过滤，-20℃冻存备用。使用前与H-DMEM完全培养液按3/2(v/v)比例混合，即制成纹状体条件培养液。

实施例3星形胶质细胞的纯化培养、条件培养液的制备及纯度鉴定

先按实施例2的方法对纹状体细胞进行原代培养，待细胞融合达90％时全量换液，置于水平恒温摇床37℃、250r/min震荡18h，然后按常规方法胰酶消化传代。传代后第1天换加H-DMEM完全培养液，然后每天收集细胞培养液，用上述方法离心过滤，-20℃冻存备用。使用前与H-DMEM完全培养液按3/2(v/v)比例混合，即制成(纹状体)星形胶质细胞条件培养液。

星形胶质细胞纯度鉴定：在细胞传代后第3天终止培养，用4％多聚甲醛溶液固定，用免疫荧光染色方法对细胞性质和纯度进行检测。用PBS洗3遍，3％H₂O₂-甲醇溶液阻断内源性过氧化物酶，室温孵育30min，用PBS洗3遍，用正常羊血清封闭，室温孵育30min，甩去正常羊血清，滴加小鼠抗大鼠GFAP抗体(1∶200)于4℃过夜，用PBS洗3遍，滴加山羊抗小鼠荧光二抗(FITC，1∶200)37℃避光孵育30min，用PBS洗3遍，滴加hoechst 33342(0.05mg/ml)染细胞核，室温避光孵育3min，封片后在荧光显微镜下观察染色情况并记录结果。星形胶质细胞阳性率计算：在荧光显微镜下随机在每张玻片上取10个视野(×200)，计数Hoechst 33342染色阳性的细胞核的数目及GFAP染色阳性的细胞数。星形胶质细胞纯度＝GFAP染色阳性的细胞数/Hoechst 33342染色阳性的细胞数。

由于新生鼠纹状体中以星形胶质细胞为主，而纹状体条件培养液来源于原代培养的纹状体多种细胞，因此同时也对原代培养的纹状体细胞的星形胶质细胞(实施例2的纹状体条件培养液)纯度进行了鉴定，方法同上。

结果如下：原代培养的纹状体(纹状体条件培养液)细胞形态较为均一，主要呈扁平状，其间也夹杂少量神经样细胞，进行GFAP免疫组化染色后统计阳性率可达85％以上；星形胶质细胞条件培养中，可以看到细胞形态均一，胞体较大，扁平，形态不规则，胞突较多较长，呈GFAP免疫阳性着色(图4)，纯度可达95％以上。由于GFAP为星形胶质细胞的标记物，说明在纹状体条件培养液和星形胶质细胞条件培养液中存在着大量的星形胶质细胞。

实施例4羊膜上皮细胞条件培养液的制备

取材：北京友谊医院妇产科，将带有绒毛膜的羊膜保存于无菌生理盐水中.

实验步骤：

1.将带有绒毛膜的羊膜从生理盐水中取出，浸泡在放有含1％双抗的无菌PBS平皿中。

2.用镊子小心将羊膜和绒毛膜剥离，剥下羊膜呈白色，半透明状薄膜。

3.将剥下的羊膜浸泡在放有含1％双抗的无菌PBS平皿中洗3次，进一步洗去血污。

4.将羊膜浸泡在放有DMEM的平皿中，剪成约5×5mm小块，

5.再将剪好的小块羊膜放入小青瓶中，用小剪刀将其进一步剪成糜状。

6.将剪碎的组织放入100ml锥形瓶中，根据组织体积再加入DMEM和2％胰酶，使胰酶终浓度为0.2％。将锥形瓶放入水浴摇床内，37℃，120转/分钟，消化1小时。

7.加入等体积含有胎牛血清的DMEM终止消化反应。

8.进一步混匀，过150目细胞筛，收集细胞悬液。

9.离心机离心此细胞悬液，1000rpm，8分钟，

10.弃上清，用含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM重悬细胞。

11.胎盘蓝染色，显微镜下进行死后细胞计数。

12.以1×10⁶个/ml细胞密度种植于25cm²培养瓶中，37℃、5％CO₂、培养箱进行培养，每6天传代一次。

13.取P1代细胞上清，离心、过滤后，以羊膜上清与DMEM4∶6的比例制成羊膜上皮细胞条件培养液。

实施例5DA能神经细胞的诱导分化、鉴定及分化率统计

取生长状态良好的脐血干细胞，待其生长至第14天左右达70％融合时全量换液，分别使用不同诱导液对脐血干细胞进行诱导分化。分组情况如下：

1)对照组：即仅使用空白完全培养液；

2)ATRA组：即在原完全培养液中加入ATRA 10μg/L；

3)EGF+bFGF组：即在原完全培养液中加入EGF、bFGF各10μg/L；

4)ATRA+EGF+bFGF组：即在原完全培养液中加入ATRA、EGF、bFGF各10μg/L；

5)纹状体条件培养液组(P1代纹状体细胞上清∶DMEM＝4∶6)；

6)星形胶质细胞条件培养液组(P1代星型细胞上清∶DMEM＝4∶6)；

7)羊膜上皮细胞条件培养液(P1代羊膜上皮细胞上清∶DMEM＝4∶6)。

每天在倒置相差显微镜下观察其形态变化。在加入不同诱导液第4天时终止诱导，用4％多聚甲醛溶液进行固定。对上述细胞用荧光染色方法检测诱导后的细胞酪氨酸羟化酶(TH，是多巴胺能神经细胞标记物)的表达。一抗为小鼠抗人TH抗体(1∶5000)。多巴胺能神经细胞分化率＝TH染色阳性的细胞数/Hoechst 33342染色阳性的细胞数。采用SPSS10.0统计软件，单因素方差分析结果用均数±标准差

表示。

结果

1.TH免疫荧光染色：脐血干细胞在分别加入ATRA、EGF+bFGF、ATRA+EGF+bFGF、纹状体条件培养液、星形胶质细胞条件培养液72h后，可见有些细胞的胞体形态发生变化，呈椭圆形、多边形或不规则形，细胞周围光晕明显，折光性增强，分化为双极或多极细胞。各组细胞在诱导第4天时终止培养，进行TH免疫荧光染色，免疫阳性颗粒位于细胞浆内，参见图5～图10，其中图5显示EGF+bFGF组TH免疫荧光阳性细胞×20；图6显示ATRA组TH免疫荧光阳性细胞×20；图7显示ATRA+EGF+bFGF组TH免疫荧光阳性细胞×20；图8显示纹状体条件培养液组TH免疫荧光阳性细胞×20；图9显示星形胶质细胞条件培养液组TH免疫荧光阳性细胞×20；以及图10显示羊膜上皮细胞条件培养液组TH免疫荧光阳性细胞×40。

对各组TH荧光染色阳性细胞进行统计，结果参见表1：

表1不同诱导组DA能神经细胞分化率的比较(％，

)

★与对照组比较，P＜0.01

^＊组间两两比较，P＜0.01

▲纹状体条件培养液组与星型胶质细胞条件培养液组比较，P＞0.05。

显然，星形胶质细胞条件培养液组DA能神经细胞分化率最高，纹状体条件培养液组次之，各诱导组与对照组比较均有显著性差异，除星形胶质细胞条件培养液组和纹状体条件培养液组两组间无显著性差异外，其余各组间比较均有显著性差异(P＜0.01)

本发明的实验结果提示，与化学因子和细胞因子相比，利用条件培养液模拟细胞微环境能更有利于脐血干细胞的定向分化。并且由于条件培养液更易于制备和控制，安全系数较高，在将来临床细胞替代治疗方面更具可行性。

2.DAT免疫荧光染色：脐血干细胞在分别加入纹状体条件培养液、星形胶质细胞条件培养液、羊膜上皮细胞条件培养液72h后，可见有些细胞的胞体形态发生变化，呈椭圆形、多边形或不规则形，细胞周围光晕明显，折光性增强，分化为双极或多极细胞。各组细胞在诱导第4天时终止培养，进行DAT(多巴胺转运体，)免疫荧光染色，免疫阳性颗粒位于细胞胞浆及胞膜周围。参见图12-15，其中图12显示对照组DAT免疫荧光染色(40X)结果；图13显示星形胶质细胞条件培养液组DAT免疫荧光染色(40X)；图14显示纹状体条件培养液组DAT免疫荧光染色(100X)；以及图15显示羊膜上皮细胞条件培养液组DAT免疫荧光染色(100X)。ATRA、EGF+bFGF等组由于分化率较低，故没有进行DAT荧光染色。

3.实时定量RT-PCR检测

脐血干细胞在分别加入纹状体条件培养液、星形胶质细胞条件培养液、羊膜上皮细胞条件培养液72h后，可见有些细胞的胞体形态发生变化，呈椭圆形、多边形或不规则形，细胞周围光晕明显，折光性增强，分化为双极或多极细胞。各组细胞在诱导第4天时终止培养，进行实时定量RT-PCR检测。

1)引物设计与合成：

TH引物：上游引物：5-CCGAGCTGTGAAGGTGTTTGA-3’

下游引物：5’-CGCGCCGGGTCTCTAGAT-3’；

DAT引物：上游引物5’-GGAGCCATAGACGGCATCA-3’

下游引物5’-CCTCGCAGAGCCGGTAGA-3’；

NSE引物：上游引物5’-CGCGCCAGCCCTCAT-3’

下游引物5’-AGGTTGTCCAGCTTCTCTTGCT-3’。

引物的设计参考Genebank发表的序列，由北京三博远志生物技术有限公司合成。

其中，NSE是神经细胞特异性烯醇化酶，是成熟神经细胞的特异性标志。

2)实时定量PCR：

TRIZOL提取细胞的总RNA，紫外分光光度计测定所提取的RNA在260nm、280nm波长下的光密度值，计算RNA纯度及浓度。用逆转录试剂盒进行反转录获取cDNA，-20℃保存待用。实时定量PCR反映体系及扩增条件：PCR反应体积为20μl。反应体系为SYBR GREEN PCR Master Mix10μl，上游引物(10μM)0.4μl下游引物(10μM)0.4μl，cDNA模板0.5μl，无菌ddH₂O补充至20μl。每一模板扩增目的片段三个复孔，扩增actin三个复孔，并设阴性对照。PCR反应条件50℃2min，95℃10min，96℃预变性3min；94℃变性15s，59℃退火20s，72℃延伸30s，40个循环；应用相对定量分析软件进行分析，显示扩增曲线，比较各组目的基因表达量，结果见表2。

表2

^*与对照组相比，P＜0.01

上述结果说明经不同条件培养液诱导后各组均有TH、NSE的mRNA扩增。

4.Western blotting分析

对对照组、及诱导后的纹状体条件培养液组、星形胶质细胞条件培养液组、羊膜上皮细胞条件培养液组进行Western blotting分析。

细胞裂解液将细胞裂解(10mM HEPES，50mM NaCl，5mMEDTA，1％Triton X-100，1mM Benzamidine(25ml裂解液加入0.004克))。并进行蛋白定量。取30μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，湿式转膜(Bio-RAD)。转好的PVDF膜放置于25ml封闭液中(1.25g脱脂奶粉，溶于25ml TBST杂交洗液中，制成5％封闭液)室温封闭1h，以封闭膜上非特异性结合位点；以杂交洗液2漂洗3次，每次10min；加入适当稀释的一抗(TH抗体，1∶5000；actin抗体，1∶200)，；DAT，1∶1000)4℃孵育过夜。吸出一抗孵育液，以杂交洗液2漂洗硝酸纤维素膜3次，每次10min；加入1∶3000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠或羊抗兔IgG抗体，室温下与杂交膜孵育1h；弃去二抗液，以杂交洗液2漂洗硝酸纤维素膜3次，每次10min。取等量的化学发光剂和增强剂混合，NC膜蛋白样品侧朝上，将配好的液体至于其上3min。在暗室，将一张放射自显影底片压在膜上，曝光1min，取出冲洗；同时再放另一张底片于膜上，即压片，冲片。Western blot条带光密度值测定：用Gel-Del凝胶成像系统对X-光片进行扫描，计算光密度值。比较不同条带的密度，将各时间点的光密度值与正常对照组比较，得到相对百分数。

结果如图16所示。另外，P1代脐带血干细胞不同诱导组western-blotting结果比较如表3所示。该结果说明各组细胞中均有TH、DAT蛋白表达。

表3

组别	TH表达比值(％)	DAT表达比值(％)
			对照组	100	100
星形胶质细胞条件培养液组	198.73±8.68<sup>*</sup>	120.45±2.51<sup>*</sup>
			纹状体条件培养液组	165.26±10.40<sup>*</sup>	110.58±2.17<sup>*</sup>

羊膜上皮细胞条件培养液组

144.65±7.51<sup>*</sup>

106.78±2.71<sup>*</sup>

^*与对照组比较，P＜0.01

5.HPLC检测结果

对对照组、及诱导后的纹状体条件培养液组、星形胶质细胞条件培养液组、羊膜上皮细胞条件培养液组进行高压液相色谱(HPLC)电化学方法检测，以便检测细胞内DA含量。

将细胞分别从培养瓶中消化下来，室温离心，1000rpm，3min。弃上清，用PBS重悬细胞沉渣，转入1.5mlEP管，离心，1000rpm，3min，共洗涤2次。用1ml PBS重悬细胞沉渣，取1μl细胞悬液，稀释100倍计数，计算EP管总细胞数。各组细胞取含相同细胞数的细胞悬液，转入另一EP管，离心，1000rpm，3min。弃上清，加入HPLC裂解液90μl。放入-40℃低温冰箱，冻融三次。14000rpm，离心15min，取上清，重复两编。-80℃保存。取DA标准品上清，以微量进样器上样，再取样品上清上样，最后进DA标品上样；测样品，每个样品进样量为20μl。样品的色谱与标品对照并根据色谱峰面积进行定量。结果见表4。

表4

组别	对照组	羊膜上皮细胞条件培养液组	星形胶质细胞条件培养液组	纹状体条件培养液组
					DA	3.284	296.939	656.007	14.384

上述结果说明，根据本发明的方法得到的多巴胺能神经细胞可以分泌多巴胺，证明该多巴胺能神经细胞具有初步功能。

通过以上内容可以确认，根据本发明提供的由脐带血干细胞经分离、培养、定向分化为多巴胺(DA)能神经细胞的方法并且所得到的细胞经鉴定符合多巴胺(DA)能神经细胞的特点。该多巴胺(DA)能神经细胞可以通过细胞移植用于治疗帕金森病这样的神经系统疾病。

已经描述了许多本发明的具体实施方式，但本发明不应该被认为局限于这些具体实施方式。应该理解，除非另有说明，这里所提供的任何或所有的实例、或典型的术语都仅仅是出于更好地说明本发明的目的，而并不限制本发明的范围。不过，应该理解，在不偏离本发明的精神和范围的前提下，可以作出很多不同的修改。因此，应该明了，本发明不限于具体描述的实施方式，而仅由权利要求的范围所限定。

Claims (3)

1.一种由脐带血干细胞定向分化为多巴胺(DA)能神经细胞的方法，包括以下步骤：

a)脐血干细胞培养：从脐带血中分离脐带血单个核细胞，将分离出的脐带血单个核细胞接种在具有盖玻片的多孔板中，置于36.5-37.5℃、3-8％的CO₂、饱和湿度的培养箱中培养，得到培养后的脐血干细胞；

b)多巴胺能神经细胞的诱导分化：取生长状态良好的脐血干细胞，待其生长至第12-16天达70％-90％融合时全量换液，使用条件培养液诱导剂进行诱导分化，得到多巴胺能神经细胞；

其中所述条件培养液诱导剂选自纹状体条件培养液、星形胶质细胞条件培养液及羊膜上皮细胞条件培养液中的一种。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多孔板在使用前先用多聚赖氨酸或鼠尾胶原处理。

3.根据权利要求1所述的方法，在培养箱中培养包括在5-8天首次全量更换培养液，以后根据细胞生长情况每2～3天半量换液一次。

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