CN102993266A - 一种融合蛋白的纯化和复性方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种融合蛋白的纯化和复性方法，包括以下几个步骤：蛋白质的纯化、样品稀释、膜包准备、浓缩和置换步骤。本发明的有益效果是：本方法可工业化放大、纯化后得到的纯度是在蛋白得率高的情况下，纯度也高，并且还具有稳定的抗原活性。

Description

一种融合蛋白的纯化和复性方法

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白的制备方法，尤其涉及一种适合工业化且低成本的Mtb72f融合蛋白包涵体的制备方法。

背景技术

目前来说，高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌在大量合成异源蛋白质时，一般情况下以包涵体的形式存在于细菌内。包涵体由高度聚集的外源蛋白质、核酸及蛋白质合成酶及核糖体组成。其中大部分（50%以上）是克隆外源基因的表达产物，它们具有工程菌表达的外源基因的正确的氨基酸序列，但空间构象往往是错误的，因而没有生物活性。由于包涵体位于细菌细胞内且没有生物活性，需经细胞裂解后经提取洗涤后变性复性及纯化步骤方能得到有活性的蛋白质。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种融合蛋白的纯化和复性方法，包括以下几个步骤：蛋白质的纯化、样品稀释、膜包准备、浓缩和置换步骤。

优选的，所述蛋白质的纯化步骤包括：将包涵体变性液上样到含Q-Sepharose F.F柱子，用平衡缓冲液A清洗后，用洗脱缓冲液B洗脱目标峰，再将来自Q-Sepharose F.F柱子上的洗脱峰上样到事先用平衡缓冲液C平衡好的含有陶瓷基质羟基磷灰石的柱子，收集含有Mtb72f的穿透峰；其中，所述平衡缓冲液A为：50mM NaCl,20mM Bis-Tris,6M 尿素，pH=7.0；

缓冲液B为：90 mM NaCl,20mM Bis-Tris,6M 尿素，pH=7.0；平衡缓冲液C为：250mM NaCl,20mM Bis-Tris,6M 尿素，pH=7.0。

优选的，所述样品稀释步骤包括：用紫外分光光度计测定穿透峰的浓度，用洗脱缓冲液B稀释至 0.2-0.3g/L。

优选的，所述膜包准备步骤包括：用NaOH 溶液循环清洗Centramate膜包，再用Na₂HPO₄清洗2次，再用平衡缓冲液C清洗至渗出液pH值为7.0±0.10。

优选的，所述浓缩和置换步骤包括：

1）将稀释后的穿透峰浓缩至1.1-1.6g/L,循环流速为6L/min/ M²，每分钟的渗析流速控制在浓缩后料液体积的1/18，将样品超滤浓缩至浓度为3.0-3.8g/L。

2）将步骤1所得到的样品用Tris缓冲液进行透析置换，透析过程中，循环速度保持在6L/min/ M²，渗析速度与第一次浓缩时一致，加缓冲液的速度与渗析速度相同。

3）将步骤2所得到的样品浓缩至步骤1的浓缩体积的0.38-0.40倍。循环速度和渗析速度同前。

4）以步骤3中用Tris缓冲液透析处理，透析过程中，循环速度保持在6L/min/ M²。循环速度和渗析速度同前，样品加缓冲液速度与渗析液的速度一致。

5）收集步骤4的浓缩液，再将所述膜包用20mM、pH=7.5的Tris缓冲液清洗，共清洗3次，收集滤出液，每次用量皆为5L/M²膜面积。将3次滤出液加至步骤4的浓缩液混匀后检测蛋白浓度，添加20mM、pH=7.5的Tris缓冲液，使样品蛋白终浓度=2.0mg/mL。

优选的，还包括无菌过滤步骤：将步骤5得到的样品用0.22 μm滤器进行无菌过滤即得到纯化原液，纯化原液分装于无菌无热原的PEG瓶中，–70℃以下保存。

优选的，所述NaOH 溶液用量为10L/M²膜面积，浓度为 0.3M，Na₂HPO₄溶液的浓度为400mM，用量为10L/M²膜面积。

优选的，所述步骤2中Tris缓冲液的用量为：以步骤1浓缩后的体积的2.5倍体积20mM的Tris缓冲液进行透析置换。

优选的，所述步骤4中的用量为以步骤3浓缩后的体积9.5倍体积、pH=7.5、浓度为20mM的Tris缓冲液透析处理。

本发明为中国发明专利“用于治疗或预防结核分枝杆菌引起的结核病的新方法”（中国专利申请号：200680023551.3）相关专利，具体涉及表达Mtb72f多肽疫苗的大肠杆菌工程菌的裂解参数的优化和相关的纯化后复性工艺的优化。

200680023551.3披露的Mtb72f生产工艺为：E. coli工程菌的发酵及诱表达，收获工程菌，细胞裂解，包涵体收获及洗涤，包涵体在变性条件下溶解。其后，溶解的包涵体经过滤后直接进行下游纯化及用切向流过滤（超滤）进行复性。原工艺所涉及的细胞裂解步骤为使用高压均浆机进行。其后，包涵体用离心机进行收集并进行清洗。清洗后的包涵体由包含尿素的变性缓冲液充分溶解并过滤后方能进行下一步的纯化步骤。    披露的发明专利中高压均质机细胞破碎为实验室小型设备，处理量低；另一方面，压力设为11，000±100psi （即在750bar-760bar之间），为了使工程菌破碎完全，需重复处理5次。而在操作过程中，为了保存目标蛋白活性和质量，每次破碎前需将悬液预冷至10℃以下，由于破碎的低效率和过于繁琐的操作导致整个细胞裂解时间过长，不适合大规模的工业化生产。故用工业级的高压均质机进行工艺放大时需调整压力参数减少破碎次数。我们在研究中发现，在使用存在一、二级分级调节阀为模式的工业级高压均质机时，在一级阀压力大于或等于750 bar，总压力为1000bar的情况下，经两次处理工程菌细菌都能完全破碎，但将操作压力限定在一个狭窄的范围时（一级阀压力为850bar-900bar,二级阀压力为100bar-150bar）时，经两次破碎处理，下游制备得到的包涵体变性溶解液的澄清度显著增加（浊度显著下降），滤器过滤容量亦明显增加。更重要的是，下游纯化结果表明目标蛋白纯度显著提高。

另外，在原工艺中纯化后复性为利用切向流超滤技术进行。但仅表述为用pH=7.5的20mM Tris缓冲液置换料液中的尿素而复性，原工艺没有具体规定用于浓缩和透滤处理的起始料液的浓度，也没有规定与复性相关的透滤速度。而我们在研究中发现，在超滤回流速度为6L/M²，每分钟的渗出速率为第一次浓缩后体积的1/18时，不同的起始浓度的复性料液得出的纯化原液在稳定性方面有明显差别：经稀释后至一定浓度的料液，在抗原活性方面有更高的稳定性。

本发明的有益效果是：本方法可工业化放大、纯化后得到的纯度是在蛋白得率高的情况下，纯度也高，并且还具有稳定的抗原活性。

 

具体实施方式

对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明：

实施例1：

菌体复溶：

取Mtb72f工程菌菌株接种于发酵罐中按流加补料的方式进行高密度发酵。当发酵液OD650nm=50时加入IPTG于37℃进行诱导，诱导5小时后收获菌体。取一定量的菌体（≥16L发酵收获时的菌体量），加入预冷的裂解缓冲液，调节菌体复溶液至OD₆₅₀nm≈60。将菌体复溶液用高速均质机均质处理，均质后冷却到≤10℃。

实施例2

菌体破碎：

将冷却匀浆后的样品用高压匀浆机（型号为Niro Soavi的Ponny）进行菌体破碎，高压匀浆机压力调节为二级100-150bars、一级850-900 bars，破碎总压力为1000±50bars；匀浆机入口样品温度应控制在≤10℃，出口样品温度必须≤25℃。同一批样品破碎处理两次，处理完毕后获得菌体破碎液。

实施例3

菌体破碎液离心及清洗：

在菌体破碎液中加入同体积的裂解缓冲液，混匀后用工业规模的离心机（如管式高速离心机）收集包涵体沉定，过程温度小于15℃。离心结束后收集包涵体，添加包涵体清洗缓冲液至菌体复溶时相当的体积，用高速均质（如Ultra Turrax T50） 均质处理，后用离心机收集包涵体沉淀，过程温度同样小于15℃。重复一次包涵体清洗和离心操作步骤。收集包涵体，添加少量清洗缓冲液体后用高速均质处理后制成包涵体悬液交纯化工序。

实施例4：

包涵体变性溶解及过滤：

缓慢将包涵体悬液样品滴加入包涵体溶解缓冲液中（体积约为对应的菌体收获液的1/2），搅拌器300rpm、室温不断搅拌约2h。然后进行包涵体变性液过滤。料液可直接用深层滤器（如PALL公司的Supracap系列）进行澄清过滤；亦可采用离心（如8000g离心15min）后取上清用囊式滤器进行澄清过滤。滤液的浊度应小于10NTU，用于包涵体目标蛋白的纯化。

实施例5：

Mtb72f蛋白的纯化

将包涵体变性液上样到事先用平衡缓冲液A（50mM NaCl,20mM Bis-Tris,6M 尿素，pH=7.0）平衡好的含Q-Sepharose F.F的柱子，用平衡缓冲液A清洗后，用洗脱缓冲液B（90 mM NaCl,20mM Bis-Tris,6M 尿素，pH=7.0）洗脱目标峰（QSFF-E）。再将来自Q-Sepharose F.F的洗脱峰上样到事先用平衡缓冲液C（250mM NaCl,20mM Bis-Tris,6M 尿素，pH=7.0）平衡好的含有陶瓷基质羟基磷灰石 (CHT)（I型,40um,Bio-rad）的柱子，收集含有Mtb72f的穿透峰（HA-FT1）。

实施例6：

Mtb72f蛋白的超滤复性

(1) 样品稀释：紫外法测定HA-FT1样品浓度，将HA-FT1用洗脱缓冲液B稀释至 0.20-0.30g/L.

（2）膜包准备：用2000ml 0.3M NaOH 循环清洗0.2M²的Centramate（30kDa分子量截止值（MWCO））膜包。其后用400mM Na2HPO4清洗2次。再用平衡缓冲液C清洗至渗出液pH值为7.0±0.10。

（3）第一次浓缩：将稀释后的HA-FT1浓缩至于1.1-1.6g/L,其间控制循环流速为每M²膜面积6L/min，每分钟的渗析流速控制在第一次浓缩后料液体积的1/18，将样品超滤浓缩至约浓度约为3.0-3.8g/L。

（4）第一次缓冲液透析置换（复性）：第一次浓缩后的样品以2.5倍体积20mM的Tris缓冲液进行透析置换。透析过程中，循环速度保持在每M²膜面积6L/min，渗析速度与第一次浓缩时一致，加缓冲液的速度与渗析速度一致。

（5）第二次浓缩：第一次透析置换完成后，将样品浓缩至第1次浓缩体积的0.38-0.40倍之间。循环速度和渗析速度同前。

（6）第2次缓冲液替换：以第二次浓缩后体积的9.5倍体积20mM的Tris(pH=7.5)缓冲液透析处理，循环速度和渗析速度同前，样品加缓冲液速度与渗析液的速度一致。

（7）收集第二次浓缩液后，膜包以1000mL的20mM Tris(pH=7.5)缓冲液清洗，共清洗3次，收集滤出液。再将三次清洗的滤出液加至第二次浓缩液混匀，检测蛋白浓度，添加一定量的20mM Tris(pH=7.5)缓冲液，使样品蛋白终浓度=2.0mg/mL。

（8）无菌过滤：将复性样品用0.22 μm滤器进行无菌过滤即得到纯化原液。纯化原液分装于无菌无热原的PEG瓶中，–70℃以下保存。

 

实施例5

处理16L菌液对应的菌体：

菌体复溶，细胞破碎参数为：第一次破碎：一级阀压力：750bars，二级阀压力：200bars；第二次破碎：一级阀压力：900bars，二级阀压力：100bars。

实施例6

处理16L菌液对应的菌体：

菌体复溶。菌体破碎时，细胞破碎参数为：一级阀压力：900bars，二级阀压力：100bars，破碎操作两次。

实施例5和实施例6的包涵体所用的高压均质机为Niro Soavi公司。

实施例5和实施例6具有相同的离心及清洗操作：在菌体破碎液中加入同体积的裂解缓冲液，混匀后用管式高速离心机（型号：GQ75,16500g，进料速度400ml/min)收集包涵体沉定，过程温度小于15℃。离心结束后收集包涵体，添加包涵体清洗缓冲液至菌体复溶时相当的体积，用高速均质（如Ultra Turrax T50） 均质处理，后用管式高速离心机（型号：GQ75,16500g，进料速度200ml/min)收集包涵体沉淀，过程温度同样小于15℃。重复一次包涵体清洗和离心操作步骤。收集包涵体，添加少量清洗缓冲液体后用高速均质处理后制成包涵体悬液交纯化工序。

包涵体清洗后进行包涵体变性溶解，实施例5和实施例6的步骤相同：取相当于8L收获菌体来源的包涵体悬液缓慢将包涵体悬液样品滴加入包涵体溶解缓冲液中（体积约为4L），搅拌器300rpm、室温不断搅拌约2h。然后进行包涵体变性液过滤。

不同破碎压力下的制备的包涵体变性液取样，用深层滤器（PALL公司的PDH4，有效面积26cm²）进行过滤。过滤时，速度控制在3.4ml/min。随着过滤量的增加，过滤压力渐增，当过滤压力显示达到15psi上限时，停止过滤。根据滤过液体积计算深层滤器单位面积的过滤容量。同时，分别对滤前、滤后液取样，用SDS-PAGE蛋白电泳结合考马斯亮蓝染色法检测过滤前后目标条带的光密度值，计算回收率。结果见表1。

  从表1可见：实施例5和实施例6之间比较，细胞破碎总压力都达到1000bars，但一级阀压力较高的后者制备的包涵体质量较好，相应的变性液浊度较低，提高了一次性滤器的过滤容量，降低了过滤成本。

表1 不同破碎压力下制备的包涵体变性溶解及过滤结果

实施例7、8、9皆选用18L的菌液，操作方法如实施例5和6的方法相同，不同操作压力参数下不同纯化批结果比较，见表2。从表2可知，不同操作压力下制备的包涵体其对应的纯化产量一致，但质量存在区别。在一级阀压力为800bars，二级阀压力为200bars的情况下制备的包涵体，其对应的纯化样品纯度较高，未检测出宿主残余蛋白。

表2 破碎压力下制备的包涵体纯化结果

实验设备与材料说明：

1、包涵体变性液的澄清过滤：样品以瓶式离心机进行离心（8000g, 20min）后取上清，用Sartorius的囊式滤器（Sartopore 2–400，0.45um-0.2um）进行过滤。

2、Q-Sepharose F.F层析柱参数：填装柱直径 = 200 mm, 截面积 = 314 cm2, 柱床高度 = 13.5 cm, 填装体积约 4.24 L。

3、羟基磷灰石 (CHT)层析柱参数：总共 200g柱料填装于XK50/30 柱中,柱床高度=15cm。

4、蛋白含量检测：微克BCA法，按Pierce公司的相关试剂操作书进行操作。

5、宿主蛋白（HCP）检测：Western blotting法检测，一抗为Anti-HCP 豚鼠抗血清，二抗为兔抗豚鼠IgG抗体，TMB法进行显色。

实施例10 

  取实施例8的纯化过程样品HA-FT1（浓度为0.61g/L，对应于10L菌体的规模）两份，各对应于4L发酵液规模：实施例11和实施例12，实施例12用洗脱缓冲液B稀释至 0.24g/L，然后分别用超滤复性法进行操作，操作步骤相同如下：

（1）膜包准备：用1000ml 0.3M NaOH 循环清洗Centramate（30kDa分子量截止值（MWCO），面积0.1M²）膜包。其后用400mM Na₂HPO₄清洗2次。再用平衡缓冲液C清洗至渗出液pH值为7.0±0.10。

（3）第一次浓缩：将样品浓缩至1.45g/L,其间控制循环流速为600mL/min，每分钟的渗析流速控制在100ml/min，将样品超滤浓缩至约浓度约为3.70g/L。

（4）第一次缓冲液透析置换（复性）：第一次浓缩后的样品以2.5倍体积20mM的Tris缓冲液进行透析置换。透析过程中，循环速度保持在600mL/min，渗析速度与第一次浓缩时一致，加缓冲液的速度与渗析速度一致。

（5）第二次浓缩：第一次透析置换完成后，将样品浓缩至第1次浓缩体积的0.38-0.40倍之间。循环速度和渗析速度同前。

（6）第2次缓冲液替换：以第二次浓缩后体积的9.5倍体积20mM的Tris(pH=7.5)缓冲液透析处理，循环速度和渗析速度同前，样品加缓冲液速度与渗析液的速度一致。

（7）收集第2次浓缩液，其后膜包用500mL的20mM Tris(pH=7.5)缓冲液清洗，共清洗3次，收集滤出液，加入第2次浓缩液后混匀检测蛋白浓度，添加一定量的20mM Tris(pH=7.5)缓冲液，使样品蛋白终浓度=2.0mg/mL。

（8）样品无菌过滤后样品，在37℃温度下进行稳定性实验。其间在稳定性实验开始（0d）取样，-70℃贮存备用。第7天(7d)再取样一次，与0d样品一起平行检测抗原活性。

（9）抗原活性检测方法：将待检测的事纯化原液样品用注射用水稀释7500倍后用ELISA结合四参数法检测抗原活性。其中，以实例11的稳定性实验开始（0d）的样品为对照品。通过四参数方程求得的对照品的半效浓度为1个活性单位（U），再根据稀释倍数和起始蛋白浓度求得对照品纯化原液的比抗原活性（U/mg）。其余样品则将对照品的半效值代入各自对应的四参数方程求出半效浓度（1个活性单位），并最终求出对应的比抗原活性。检测结果见表3。从表3可以看出：在稳定性实验的第7天，与非稀释样品相比，稀释复性后的样品有更高的比抗原活性，说明稀释处理后复性样品的稳定性更高。

 

表3 稀释与不稀释处理样品复性后抗原活性结果比较

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种融合蛋白的纯化和复性方法，其特征在于，包括以下几个步骤：蛋白质的纯化、样品稀释、膜包准备、浓缩和置换步骤。

2.如权利要求1所述的融合蛋白的纯化和复性方法，其特征在于，所述蛋白质的纯化步骤包括：将包涵体变性液上样到含Q-Sepharose F.F柱子，用平衡缓冲液A清洗后，用洗脱缓冲液B洗脱目标峰，再将来自Q-Sepharose F.F柱子上的洗脱峰上样到事先用平衡缓冲液C平衡好的含有陶瓷基质羟基磷灰石的柱子，收集含有Mtb72f的穿透峰；其中，所述平衡缓冲液A为：50mM NaCl,20mM Bis-Tris,6M 尿素，pH=7.0；

缓冲液B为：90 mM NaCl,20mM Bis-Tris,6M 尿素，pH=7.0；平衡缓冲液C为：250mM NaCl,20mM Bis-Tris,6M 尿素，pH=7.0。

3.如权利要求1所述的融合蛋白的纯化和复性方法，其特征在于，所述样品稀释步骤包括：用紫外分光光度计测定穿透峰的浓度，用洗脱缓冲液B稀释至 0.20-0.30g/L。

4.如权利要求1所述的融合蛋白的纯化和复性方法，其特征在于，所述膜包准备步骤包括：用NaOH 溶液循环清洗Centramate膜包，再用Na₂HPO₄清洗2次，再用平衡缓冲液C清洗至渗出液pH值为7.0±0.10。

5.如权利要求1所述的融合蛋白的纯化和复性方法，其特征在于，所述浓缩和置换步骤包括：

1）将稀释后的穿透峰浓缩至1.1-1.6g/L,循环流速为6L/min/ M²，每分钟的渗析流速控制在浓缩后料液体积的1/18，将样品超滤浓缩至浓度为3.0-3.8g/L；

2）将步骤1所得到的样品用Tris缓冲液进行透析置换，透析过程中，循环速度保持在6L/min/ M²，渗析速度与步骤1浓缩时一致，加缓冲液的速度与渗析速度相同；

3）将步骤2所得到的样品浓缩至步骤1的浓缩体积的0.38-0.40倍，循环速度和渗析速度与步骤1相同；

4）以步骤3中用Tris缓冲液透析处理，透析过程中，循环速度保持在6L/min/ M²，循环速度和渗析速度与步骤1相同，加缓冲液速度与渗析液的速度相同；

5）收集步骤4的浓缩液，再将所述膜包用一定量的20mM、pH=7.5的Tris缓冲液清洗，共清洗3次，收集滤出液，加入浓缩液混合检测蛋白浓度后，添加20mM、pH=7.5的Tris缓冲液，使样品蛋白终浓度为2.0mg/mL。

6.如权利要求1至5任一项所述的融合蛋白的纯化和复性方法，其特征在于，还包括无菌过滤步骤：将步骤5得到的样品用0.22 μm滤器进行无菌过滤即得到纯化原液，纯化原液分装于无菌无热原的PEG瓶中，–70℃以下保存。

7.如权利要求3所述的融合蛋白的纯化和复性方法，其特征在于，所述NaOH 溶液用量为10L/M²膜面积，浓度为 0.3M，Na₂HPO₄溶液的浓度为400mM，用量为10L/M²膜面积。

8.如权利要求5所述的融合蛋白的纯化和复性方法，其特征在于，所述步骤2中Tris缓冲液的用量为：以步骤1浓缩后的体积的2.5倍体积，且浓度为20mM的Tris缓冲液进行透析置换。

9.如权利要求5所述的融合蛋白的纯化和复性方法，其特征在于，所述步骤4中的用量为以步骤3浓缩后的体积9.5倍体积、pH=7.5、浓度为20mM的Tris缓冲液透析处理。