BR112013015802A2 - método para extrair albumina de soro humano a partir de grão de arroz transgênico - Google Patents

Abstract

método para extrair albumina de soro humano a partir de grão de arroz transgênico. a presente invenção fornece um método para extrair albumina de soro humano a partir de grãos de arroz transgênico, que compreende os passos de: moer o grão de arroz descascado, em seguida misturar o grão de arroz moído com um tampão de extração e extrair com agitação para obtenção da mistura i; 2) ajustar o ph da mistura i para 4,0-4,5 e precipitá-la por 1-12 horas para obtenção na mistura ii; 3) filtrar a mistura ii e coletar o filtrado para obter uma solução contendo alta concentralção de albumina de soro humano. o método fornece uma base para a purificação adicional de rhsa.

Description

Vv1O

RELATÓRIO DESCRITIVO MÉTODO PARA EXTRAIR ALBUMINA DE SORO HUMANO A PARTIR DE GRÃO

DE ARROZ TRANSGÊNICO — DOMÍNIO DA INVENÇÃO A presente invenção se refere ao campo da biotecnologia e, mais particularmente, a um método para extrair albumina de soro humano recombinante (rHSA) do grão de arroz transgênico.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO A albumina de soro humano (HSA) é uma cadeia simples, proteína não glicosilada que consiste de 585 aminoácidos, que possui peso molecular de 66,5 kD e ponto isoelétrico entre 4,7-4,9. É a proteina mais abundante no plasma do sangue humano, constituindo cerca de 60% das proteínas totais do plasma. Existem cerca de 40g de HSA em cada litro de sangue humano. Além de presente no plasma, a HSA 15º também é encontrada em tecidos e secreções corporais, peles e cavidades linfáticas. Em condições fisiológicas normais, a HSA tem o efeito de manter a pressão osmótica coloidal do plasma, nutrindo, acelerando a concrescência das feridas e, como um transportador, participando no transporte de muitas moléculas biológicas hidrofóbicas, tais como, os hormônios, substâncias biológicas ativas e medicamentos no corpo. — Portanto, a HSA é uma importante proteina médica que é usada principalmente para tratamento clínico de hipoproteinemia, causada pela perda de sangue, queimadura, escaldadura, cirurgia plástica e lesão cerebral, assim como para o tratamento de cirrose hepática, hidronefrose entre outras. No momento, a HSA para uso clínico é preparada principalmente por extração e isolamento a partir do plasma humano. No entanto, esta forma de preparação apresenta as seguintes desvantagens: Por um lado, a fonte de plasma é insuficiente, ou seja, a fonte sanguinea limitada é incapaz de atender a demanda de produção da HSA e as preparações mais importantes desta; por outro lado, o próprio sangue pode potencialmente ser um fator de risco, por exemplo, pode conter perigosos agentes — patógenos de infecção, tais como o vírus da hepatite, vírus da imunodeficiência humana (HIV) entre outros, o que causa enormes preocupações sobre a aplicação de HSA extraída a partir do plasma. Portanto, é urgente desenvolver um processo alternativo para produzir HSA. Com o desenvolvimento de modernas técnicas de DNA recombinante e — sínteses, os pesquisadores desenvolveram um profundo interesse na produção e aplicação de albumina de soro humano recombinante (rHSA). Até agora, diversos sistemas de expressão foram utilizados experimentalmente para produção em massa de rHSA. Por exemplo, procariontes, tais como bacilo de colo (Latta, M. et al,

Bio/Technology, 5:1309-1314, (1987)), bacilo subtilis (Saunders, C. W. et al, J. Bacteriol. 169: 2917-2925, (1987)), eucariontes, tais como leveduras (WO 00/44772, EPO683233A2, US 5612196) e também o cultivo de células animais foi utilizado para a produção de rHSA. No entanto, as abordagens acima não são adequadas para a — produção industrializada, seja pelo baixo nível de expressão, seja pelo alto custo de produção.

A solicitação de patente chinesa No. 200510019084, dos presentes inventores, divulga um método para a produção de rHSA, usando células de endosperma de arroz como biorreator, compreendendo: Utilizar promotores e peptídeos-sinal especificamente expressos no endosperma de arroz para mediar a entrada de rHSA no sistema de endomembranas das células de endosperma do arroz e armazenar rHSA nos corpos proteicos do endosperma de arroz, permitindo assim ao rHSA se acumular amplamente no grão de arroz e finalmente atingir um maior nível de expressão. O nível de expressão do rHSA obtido é pelo menos 0,3% maior, com base —nopesodo grão de arroz. O método possui as vantagens de alto nível de expressão e baixo custo, desta forma possibilita o desenvolvimento de uma nova estratégia para a produção de medicamentos proteicos.

No momento, não existe um processo de produção já estabelecido para extrair rHSA do grão de arroz transgênico. Estabelecer um método e um processo para extrair proteinas do grão de arroz transgênico, melhorar a eficiência de extração das proteínas alvo e reduzir o rendimento de extração de proteínas não alvo são elementos críticos do desenvolvimento da pesquisa e da tecnologia. A presente invenção estabelece uma tecnologia e um processo para extração de alta eficiência do rHSA do grão de arroz transgênico em larga escala.

— RESUMO DA INVENÇÃO O objetivo da invenção é fornecer um método para extrair albumina de soro humano recombinante (rHSA) do grão de arroz transgênico.

Para atingir o objetivo acima, a presente invenção fornece as seguintes soluções técnicas: Um método para extrair albumina de soro humano recombinante do grão de arroz transgênico, compreendendo os passos de: 1) Remover a casca do arroz transgênico que contém a albumina de soro humano recombinante, triturar o grão de arroz descascado, em seguida misturar o grão de arroz transgênico moido com um tampão de extração e extrair com agitação —paraobtençãoda mistural; 2) Ajustar o pH da mistura | do passo 1) para 4,0-4,5 e precipitá-la por 1-12 horas para obtenção da mistura |l;

3) Filtrar a mistura Il do passo 2) e coletar o filtrado para obtenção de uma solução contendo alta concentração de albumina de soro humano recombinante.

Especificamente no passo 1), como albumina de soro humano recombinante apresenta grânulos de amido dentro das células de endosperma do arroz, de modo a reduzir o rendimento de extração das proteínas não alvo, para melhorar o rendimento de extração da albumina de soro humano recombinante, o grão de arroz transgênico contendo rHSA é descascado e o grão de arroz descascado é moido a pó ou moído com uma finura de 80-120 mesh de tamanho.

O tampão de extração compreenda tampão fosfato (PBS) 10-30mM, acetato de sódio 10-20mM, sulfato de amônio 10-50mM e caprilato de sódio 5-40mM, e o tampão de extração possua um pH de 6,5-8,0.

No tampão de extração, tal sulfato de amônio, de preferência, tem uma concentração de 10-30mM, mais preferencialmente, 15-30mMM e, ainda mais —preferencialmente, 20-30mM.

No tampão de extração, tal caprilato de sódio, de preferência, tem uma concentração de 5-30mM, mais preferencialmente, 5-20mMM e, ainda mais preferencialmente, 10-20mM.

Por exemplo, em uma personalização, o tampão de extração compreende tampão fosfato (PBS) 10-30mM, acetato de sódio 10-20mM, sulfato de amônio 15- 30mM e caprilato de sódio 5-20mM, e o tampão de extração possui um pH de 6,5-8,0.

Em uma personalização preferida, o tampão de extração compreende tampão fosfato 25mM, acetato de sódio 20mM, sulfato de amônio 20mM e caprilato de sódio 20mM, e possui um pH de 7,5.

De modo a obter o mais alto rendimento de extração da albumina de soro humano recombinante e equilibrar a relação entre volume de extração e eficiência de extração, o arroz em pó é misturado com o tampão de extração em uma proporção peso/volume (kg/L, peso do arroz moíido/volume do tampão de extração) de 1:5 a 1:10, em seguida extraído com agitação em 60 rotações por minuto (rpm) por 1-3horas. Os — experimentos mostraram que a proporção variando de 1:5 a 1:10 não influencia claramente na eficiência de extração da albumina de soro humano recombinante. Com a finalidade de reduzir o custo e o volume de extração, o arroz transgênico moído é, preferencialmente, misturado com tampão de extração em uma proporção peso/volume (kg/L) de 1:5, e o tempo de extração é de preferência de 1-1,5 horas.

De modo a extrair albumina de soro humano recombinante do grão de arroz moído com a máxima eficiência, de acordo com o aspecto característico da albumina de soro humano de ser estável a 60ºC, um aumento da temperatura de extração obviamente melhora o rendimento de extração de proteína total e de albumina de soro humano recombinante, de maneira que a HSA não seja desnaturada na temperatura. Portanto, na presente invenção é empregado um tratamento de aquecimento para efetivamente aumentar o rendimento de extração da albumina de soro humano — recombinante. Esta temperatura de extração é de 45-60ºC, de preferência de 55-60ºC.

Uma vez que tanto a extração de albumina de soro humano recombinante quanto a extração das proteinas não alvo são melhoradas em condições de aquecimento e de alto pH, no processo mencionado acima, a remoção das proteínas não alvo em excesso pode ser realizada pela precipitação das proteínas de reserva do endosperma de arroz no ponto isoelétrico da albumina de soro humano. De acordo com a presente invenção, o processo de precipitação no passo 2) é realizado em pH baixo. Após a extração, a mistura extraída é ajustada para pH 4,04,5, em seguida a mistura é precipitada a temperatura ambiente por pelo menos 1 hora para eliminar os efeitos negativos das proteínas não alvo em excesso, produzidas pelo processo de extração sob aquecimento e alto pH. Em uma personalização, é utilizado ácido acético para ajustar o pH para 4,0-4,5, de preferência 4,5, o tempo de precipitação é de 1-12 horas, de preferência, de 3-12 horas, e mais preferencialmente de 6 horas.

De acordo com as diferentes características físicas entre os grânulos de amido existentes no arroz moido e a parte líquida, as técnicas e os equipamentos rotineiros —podem ser utilizados para separar as substâncias indesejáveis da extração de proteina. A mistura extraída obtida do processo de precipitação no passo 2) é submetida a uma separação sólido-líquido via filtação por pressão ou outro equipamento equivalente, atingindo a finalidade de separar efetivamente o resíduo de amido da proteína alvo, em larga escala. A invenção fornece um método simples, — rápido e de baixo custo para a obtenção de uma solução contendo alta concentração de albumina de soro humano recombinante.

Em uma personalização, este filtrado compreende os passos de filtrar usando filtração a pressão com um tecido filtrante tipo filtro em estrutura de placa, em seguida filtração por microfiltração com uma membrana de fibra oca. Esta membrana de fibra oca é feita de polietersulfona, com um poro de tamanho 0,20um — 0,45Uum em diâmetro e, de preferência, 0,22um.

Na solução contendo albumina de soro humano recombinante preparada de acordo com o método da presente invenção, a concentração da albumina de soro humano recombinante é de 0,65-0,66mg/mL; a concentração inicial das proteinas totais é de 6,90-7,05mg/mL e é reduzida para cerca de 2,8mg/mL após o passo de precipitação; o teor de proteínas não alvo é significativamente reduzido.

As soluções técnicas de acordo com a presente invenção possuem as so seguintes vantagens:

1. A eficiência de extração da albumina de soro humano recombinante é aumentada pela combinação de diferentes pHs e diferentes concentrações do sal. Os dados mostraram que a concentração da albumina de soro humano recombinante no extrato obtido de acordo com a presente invenção é de 0,65-0,66mg/mL, enquanto que a concentração obtida pela técnicas anteriores é de apenas 0,30-0,315mg/mL. Desta forma, aplicando o método melhorado da presente invenção, a quantidade extraída de albumina de soro humano recombinante a partir do mesmo peso de arroz moído é aumentada em 1,15 vezes.

2. A eficiência de extração de proteina não alvo é reduzida. De acordo com a presente invenção, a concentração das proteínas totais no extrato inicial é de 6,90- 7,05mg/M! e o teor de proteína total é de 2,8mg/mL após o passo de precipitação, uma redução de 2,46 vezes.

3. O efeito asséptico ou efeito de esterilização é aumentado devido à melhora do passo de microfiltração, o que elimina a contaminação microbiana que pode ser introduzida no passo subsequente de purificação e reduz a quantidade de endotoxina bacteriana que pode ocorrer no processo de produção.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig. 1 é um gráfico que mostra os efeitos de combinar as diferentes temperaturas e tempos de extração sobre o rendimento da extração das proteínas totais a partir de grão de arroz transgênico moído.

A Fig. 2 é um gráfico que mostra os efeitos de combinar as diferentes temperaturas e tempos de extração sobre o rendimento da extração do rHSA a partir —degrãode arroz transgênico moído.

A Figura 3 é uma imagem de SDS-PAGE de amostras obtidas por combinações ortogonais de diferentes temperaturas e tempos de extração.

A Fig. 4 é um gráfico que mostra os efeitos de combinar as diferentes pHs e concentrações de sal de sulfato de amônio sobre o rendimento da extração das — proteinas totais a partir de grão de arroz transgênico moído.

A Fig. 5 é um gráfico que mostra os efeitos de combinar as diferentes pHs e concentrações de sal de sulfato de amônio sobre o rendimento da extração de rHSA a partir de grão de arroz transgênico moído.

A Figura 6 é uma imagem de SDS-PAGE de amostras obtidas por —combinações ortogonais de diferentes pHs e concentrações de sal de sulfato de amônio.

A Figura 7 é um gráfico que mostra os efeitos de diferentes concentrações de caprilato de sódio e tempos de precipitação sobre o rendimento de extração de proteínas totais.

A Figura 8 é uma imagem de SDS-PAGE das amostras de extração obtidas em diferentes concentrações de caprilato de sódio e tempos de precipitação.

A Figura 9 é uma imagem de SDS-PAGE das amostras de extração obtidas em diferentes pHs e tempos de precipitação.

A Figura 10 é um esquema mostrando os percentuais de rHSA nas proteinas totais da solução extraída antes e após a filtração com membranas de diferentes tamanhos de poros.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO As características e as vantagens da presente invenção ficam ainda mais claras a partir dos exemplos abaixo. Os exemplos possuem caráter apenas ilustrativo e não devem ser interpretados como limitadores da invenção em qualquer direção. 15º Exemplo 1: Extração de rHSA de acordo com o método melhorado da presente invenção O arroz transgênico pode ser preparado de acordo com o método divulgado na solicitação de patente chinesa nº 200510019084 dos inventores em questão. O arroz com casca foi beneficiado para a obtenção do arroz semipolido e triturado para —obtenção do arroz moido com uma finura de 80-100 mesh. O arroz moído foi misturado com um tampão de extração em uma proporção de 1:5 (peso/volume, kg/L) e extraído por 1,5 horas a 60ºC. Os componentes do tampão de extração são: tampão fosfato 25mM, acetato de sódio 20mM, sulfato de amônio 10mM, caprilato de sódio 10mM; pH de 7,5. A mistura resultante foi ajustada para pH 4,5 com ácido acético e — colocada por pelo menos 3 horas para precipitar as proteínas não alvo. Em seguida, a mistura resultante foi sequencialmente submetida à filtração por pressão usando um filtro a pressão em estrutura de placa (tipo tecido filtrante) e microfiltração por coluna de fibra oca com um poro de tamanho 0,22um para a obtenção de sobrenadante contendo rHSA. A concentração de rHSA foi de cerca de 0,66 mg/mL.

—Exemplo2: Extração de rHSA de acordo com o método anterior da técnica O arroz transgênico pode ser preparado de acordo com o método divulgado na solicitação de patente chinesa nº 200510019084 dos inventores em questão. O arroz com casca foi beneficiado para a obtenção do arroz não polido e triturado para obtenção do arroz moido com uma finura de 80-100 mesh. O arroz moido foi — misturado com um tampão de extração em uma proporção de 1:5 (peso/volume, Kkg/L) e extraído por pelo menos 1 hora em temperatura ambiente. Os componentes do tampão de extração são: Tampão fosfato 25mM e acetato de sódio 20mM; pH 6,5. À mistura resultante foi ajustada para pH 4,5 com ácido acético e colocada por 1 hora para precipitar.

Em seguida, a mistura resultante foi sequencialmente submetida à filtração por pressão usando um filtro a pressão em estrutura de placa (tipo tecido filtrante) e microfiltração por coluna de fibra oca com um poro de tamanho 0,45pum paraa obtenção de sobrenadante contendo rHSA.

A concentração de rHSA foi de cerca de 0,314 mg/ml.

Comparado aos resultados de acordo com o método melhorado da presente invenção, o teor de proteínas totais foi de apenas 45,5% e o teor de rHSA foi de 47,7% (Figuras de 1a 3). Exemplo 3: Efeitos da temperatura de tempo de extração sobre o rendimento de —extraçãoderHSA Este exemplo empregou um tampão de extração constante e executou uma combinação ortogonal em diferentes temperaturas (45ºC, 50ºC, 55ºC, 60ºC, respectivamente) e diferentes tempos de extração (20 min, 40 min, 60 min, 80min, respectivamente) para obtenção de diferentes amostras de extrato.

O método BCA foi utilizado para determinar a concentração de proteínas totais em cada amostra e o ELISA foi utilizado para determinar a concentração de rHSA em cada amostra.

Os resultados são mostrados nas Figuras | e 2, respectivamente.

Cada amostra foi submetida ao SDS-PAGE e a fotografia da eletroforese é mostrada na Figura 3. A partir das Figuras 1 e 2 pode ser visto que com o aumento do tempo e da temperatura de extração, as concentrações das proteínas totais e rHSA no extrato do arroz moido tendem a aumentar proporcionalmente.

A temperatura de extração teve maior influência na eficiência de extração do que o tempo de extração.

A maior eficiência de extração de rHSA foi obtida quando a extração foi realizada a 60ºC por 60 minutos.

A fotografia da eletroforese na Figura 3 mostrou que, em diferentes — condições de temperatura e tempo, as bandas espectrais das proteínas extraídas apresentavam uma diferença significativa na área onde o peso molecular era maior do que aquele do rHSA, enquanto que as bandas espectrais eram idênticas na área onde o peso molecular era menor do que aquele do rHSA, em diferentes condições de extração. —Exemplo 4: Efeitos do valor de pH do tampão de extração e concentração do sal de sulfato de amônio no rendimento de extração do rHSA Este exemplo empregou uma condição constante para extrair a 55ºC por 60 minutos.

A proporção de arroz moido em relação ao tampão de extração (peso/volume, kg/L) foi de 1:5. Foram executadas combinações ortogonais em — diferentes concentrações de sulfato de amônio (0, 10, 30, 50mM, respectivamente) e pH do tampão de extração (pH 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, respectivamente). O método BCA foi utilizado para determinar a concentração de proteínas totais e o ELISA foi utilizado para determinar a concentração de rHSA em cada amostra. Os resultados são mostrados nas Figuras 4 e 5, respectivamente. A Figura 6 mostra os SDS-PAGE das amostras obtidas por combinações ortogonais de diferentes concentrações de sal de sulfato de amônio e pH do tampão de extração.

A partir das Figuras 4 e 5 pode ser visto que com o aumento do pH do tampão de extração e da concentração de sal, as concentrações das proteínas totais e do TrHSA no extrato de arroz moido tendem a crescer proporcionalmente, com desvios em casos individuais. O pH do tampão de extração teve uma significativa maior influência sobre o rendimento da extração de rHSA, do que a concentração de sal do tampão de extração. Em uma condição onde o pH do tampão de extração foi 75 e a concentração do sal foi 10mMM, a eficiência de extração de rHSA foi a maior. Comparado aos diferentes tempos e temperaturas de extração, os diferentes pHs e as diferentes concentrações de sal tiveram apenas uma menor influência sobre as bandas das proteínas extraídas. Enquanto em pH mais elevado existiram bandas ligeiramente menores acima da banda principal de rHSA, as demais bandas permaneceram idênticas, conforme mostra a Figura 6.

Figura 5: Efeitos do tempo de precipitação e da concentração de caprilato de sódio sobre o rendimento de extração do rHSA. As concentrações utilizadas de caprilato de sódio foram 10mMM, 20mM, 30mM e — 40mM, respectivamente, para testar se o aumento da concentração de caprilato de sódio tinha um melhor efeito de proteção sobre o rHSA. Após a extração, foi adicionado ácido acético para ajustar o pH para 4,5 e a mistura resultante foi precipitada por Oh, 1h, 2h, 3h e ao longo da noite, respectivamente, para determinar a concentração da proteína. O efeito dos diferentes tempos de precipitação e diferentes — concentrações de caprilato de sódio sobre o extrato das proteínas totais é mostrado na Figura 7. Os padrões SDS-PAGE das amostras obtidas em diferentes concentrações de caprilato de sódio e diferentes tempos de precipitação são mostrados na Figura 8. Os extratos das Figuras 7 e 8 dizem respeito às amostras das misturas após a extração, mas antes do ajuste de pH.

A partir das Figuras 7 e 8 pode ser visto que o choque do ajuste de pH da solução de extração para 4,5 resultou em muito rHSA precipitado. Conforme o tempo de precipitação aumentou, uma parte do rHSA precipitado tornou a dissolver. Após precipitar por toda noite, a concentração média das proteínas totais foi de 78% com base no valor antes da precipitação e não houve degradação após a precipitação por — toda noite. Entretanto, as bandas degradadas e as proteinas não alvo também foram amplamente precipitadas durante o processo de precipitação. Foi demonstrado que o caprilato de sódio 20mM teve o melhor efeito de proteção, enquanto que maiores concentrações causam aumento da precipitação Para determinar o efeito do pH e do tempo de precipitação sobre a eficiência de precipitação, o arroz moido foi misturado com um tampão de extração (25mM de — tampão fosfato, 10mM de sulfato de amônio, 10mM de caprilato de sódio, pH 7,5) em uma proporção (peso/volume, kg/L) de 1:5, em seguida extraído a 60ºC por 1 hora com agitação. O extrato resultante do grão de arroz moído foi dividido em seis partes iguais, que foram ajustadas para pH 4,5, 4,4, 4,3, 4,2, 4,1, 4,0, respectivamente. Os extratos com pH ajustado foram agitados sobre um leito de agitação em temperatura ambiente por 1 e 2 horas, respectivamente, seguido por amostragem. Os padrões SDS-PAGE das amostras são mostrados na Figura 9. O extrato da Figura 9 diz respeito à amostra da mistura após a extração, mas antes do ajuste de pH.

A partir dos padrões SDS-PAGE da Figura 9 pode ser visto que conforme o pH diminui ocorre um aumento da eficiência de precipitação das proteínas não alvo, em — conjunto com a perda de rHSA. A extensão do tempo de precipitação teve um efeito positivo sobre a eficiência de precipitação. Em pH abaixo de 4,1, as bandas macromoleculares foram completamente precipitadas. Considerando as exigências técnicas do processo e minimizando a perda do rHSA alvo, é preferível precipitar em pH 4,5.

—Exemplo 7: Comparação entre os efeitos de esterilização usando diferentes tamanhos de membrana de fibra oca de polietersulfona (PES) no passo de microfiltração

1. Efeito da microfilttação com diferentes membranas filtrantes sobre a remoção de bactérias no arroz As amostras de solução utilizadas neste exemplo foram filtrados límpidos da filtração por pressão, que foram obtidos pelo tratamento do arroz transgênico moído, usando o processo melhorado de acordo com a presente invenção, em produção em escala piloto. As amostras foram tratadas por pequenas colunas de fibra oca com poro de tamanho 0,20um e 0,45um, respectivamente. Foram coletadas tanto a solução — original antes do tratamento quanto o filtrado após o tratamento. Um volume de 0,1mL da solução original ou de suas soluções de diluição foi aplicado, respectivamente, sobre placas LB para análise do efeito de esterilização das duas membranas filtrantes. Os resultados são mostrados na Tabela 1. Foram determinadas as concentrações da albumina de soro humana recombinante e das proteínas totais nas soluções antes e após a filtração, e calcularam-se os percentuais de albumina de soro humano recombinante nas proteínas totais. O percentual é mostrado na Figura 10 como um gráfico de barras

Tabela 1 2 3 4 5 Amostra após a 382 a 2 2 o A 3800 Amostra após a 41 7 0 o O O 400-700 filtração com 0,45Um Amostra após a O o 0 Oo 0 0 Oo filtração com 0,20um Os resultados da tabela 1 mostram que a membrana de fibra oca com 0,45um — pode remover 50-90% das bactérias presentes no filtrado a partir da filtração por pressão, ao contrário, a membrana de fibra oca com 0,20um pode remover 100% das bactérias presentes no filtrado a partir de filtração por pressão, garantindo que a contaminação microbiana não poderia ser introduzida no passo subsequente de purificação por meio do filtrado, reduzindo assim o teor de endotoxinas bacterianas no — processo de produção.

Em relação à Figura 10, comparando com as amostras filtrtadas das membranas de fibra oca de 0,20um e 0,45pum, quando filtradas com membrana de 0,20uUm, a perda de albumina de soro humano recombinante é muito menor do que a perda de proteínas totais. O extrato que foi filtrado com a membrana de 0,20um apresentou uma concentração relativamente maior de albumina de soro humano recombinante.

Claims (14)

REIVINDICAÇÕES

1. MÉTODO PARA EXTRAIR ALBUMINA DE SORO HUMANO A PARTIR DE GRÃO DE ARROZ TRANSGÊNICO caracterizado por compreendendo os passos de: 1) Remover a casca do arroz transgênico que contém a albumina de soro humano — recombinante, triturar o grão de arroz descascado, em seguida misturar o grão de arroz transgênico moído com um tampão de extração e extrair com agitação para obtenção da mistura |; 2) Ajustar o pH da mistura | do passo 1) para 4,0-4,5 e precipitá-la por 1-12 horas para obtenção da mistura |!; 3) Filtrar a mistura 1l do passo 2) e coletar o filtrado para obtenção de uma solução contendo alta concentração de albumina de soro humano recombinante.

2. MÉTODO PARA EXTRAIR ALBUMINA DE SORO HUMANO A PARTIR DE GRÃO DE ARROZ TRANSGÊNICO, conforme a reivindicação 1, caracterizado por no passo 1) tal grão de arroz transgênico moído ter uma finura de 80-120 mesh.

15º 3. MÉTODO PARA EXTRAIR ALBUMINA DE SORO HUMANO A PARTIR DE GRÃO DE ARROZ TRANSGÊNICO, conforme a reivindicação 1, caracterizado por no passo 1) tal tampão de extração compreender tampão fosfato 10-30mM, acetato de sódio 10- 20mM, sulfato de amônio 10-50mM e caprilato de sódio 5-40mM, e possuir um pH de 6,5-8,0.

4. MÉTODO PARA EXTRAIR ALBUMINA DE SORO HUMANO A PARTIR DE GRÃO DE ARROZ TRANSGÊNICO, conforme a reivindicação 3, caracterizado por tal sulfato de amônio possuir uma concentração de 10-30mM e tal caprilato de sódio ter uma concentração de 5-30mM.

5. MÉTODO PARA EXTRAIR ALBUMINA DE SORO HUMANO A PARTIR DE GRÃO —DE ARROZ TRANSGÊNICO, conforme a reivindicação 4, caracterizado por tal sulfato de amônio possuir uma concentração de 15-30mM e tal caprilato de sódio ter uma concentração de 5-20mM.

6. MÉTODO PARA EXTRAIR ALBUMINA DE SORO HUMANO A PARTIR DE GRÃO DE ARROZ TRANSGÊNICO, conforme a reivindicação 3, caracterizado por tal tampão de extração ter um pH de 7,0-7,5

7. MÉTODO PARA EXTRAIR ALBUMINA DE SORO HUMANO A PARTIR DE GRÃO DE ARROZ TRANSGÊNICO, conforme a reivindicação 3, caracterizado por tal tampão de extração compreender tampão fosfato 25mM, acetato de sódio 20mM, sulfato de amônio 20mM e caprilato de sódio 20mM, e possuir um pH de 7,5.

—8 MÉTODO PARA EXTRAIR ALBUMINA DE SORO HUMANO A PARTIR DE GRÃO DE ARROZ TRANSGÊNICO, conforme a reivindicação 1, caracterizado por no passo 1) tal grão de arroz transgênico moído e tal tampão de extração serem misturados em uma proporção peso/volume (kg/L) variando de 1:5 a 1:10, o tempo de extração ser de 1-3horas e a temperatura de extração ser de 45-60ºC.

9. MÉTODO PARA EXTRAIR ALBUMINA DE SORO HUMANO A PARTIR DE GRÃO DE ARROZ TRANSGÊNICO, conforme a reivindicação 8, caracterizado por no passo —1)talgrãode arroz transgênico moido e tal tampão de extração serem misturados em uma proporção peso/volume (kg/L) variando de 1:5, o tempo de extração ser de 1-1,5 horas e a temperatura de extração ser de 55-60ºC.

10. MÉTODO PARA EXTRAIR ALBUMINA DE SORO HUMANO A PARTIR DE GRÃO DE ARROZ TRANSGÊNICO, conforme a reivindicação 1, caracterizado por no passo 2) tal mistura | ser ajustada para pH 4,0-4,5 e, em seguida, precipitada por 3- 12 horas a temperatura ambiente.

11. MÉTODO PARA EXTRAIR ALBUMINA DE SORO HUMANO A PARTIR DE GRÃO DE ARROZ TRANSGÊNICO, conforme a reivindicação 10, caracterizado por no passo 2) tal mistura | ser ajustada para pH 4,5 e precipitada durante a noite ou 6 horas.

12. MÉTODO PARA EXTRAIR ALBUMINA DE SORO HUMANO A PARTIR DE GRÃO DE ARROZ TRANSGÊNICO, conforme a reivindicação 1, caracterizado por no passo 3) tal passo de filtração compreender os passos de filtração por filtração a pressão com um tecido filtrante tipo filtro em estrutura de placa, em seguida filtração — por microfiltração com uma membrana de fibra oca de polietersulfona.

13. MÉTODO PARA EXTRAIR ALBUMINA DE SORO HUMANO A PARTIR DE GRÃO DE ARROZ TRANSGÊNICO, conforme a reivindicação 12, caracterizado por tal membrana de fibra oca de polietersulfona ter um poro de tamanho 0,20ym-0,45pym.

14. MÉTODO PARA EXTRAIR ALBUMINA DE SORO HUMANO A PARTIR DE — GRÃO DE ARROZ TRANSGÊNICO, conforme a reivindicação 13, caracterizado por tal membrana de fibra oca de polietersulfona ter um poro de tamanho 0,22um.