KR101860051B1 - 식물세포 배양시스템으로 생산된 피부 생리활성 염기성 섬유아세포성장인자 - Google Patents

식물세포 배양시스템으로 생산된 피부 생리활성 염기성 섬유아세포성장인자 Download PDF

Info

Publication number
KR101860051B1
KR101860051B1 KR1020160079663A KR20160079663A KR101860051B1 KR 101860051 B1 KR101860051 B1 KR 101860051B1 KR 1020160079663 A KR1020160079663 A KR 1020160079663A KR 20160079663 A KR20160079663 A KR 20160079663A KR 101860051 B1 KR101860051 B1 KR 101860051B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
fibroblast growth
growth factor
basic fibroblast
bfgf
plant cell
Prior art date
Application number
KR1020160079663A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20180012348A (ko
Inventor
정대현
김수정
김성심
박경목
김하늘
신서연
김현순
하장호
Original Assignee
주식회사 바이오에프디엔씨
한국생명공학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 바이오에프디엔씨, 한국생명공학연구원 filed Critical 주식회사 바이오에프디엔씨
Priority to KR1020160079663A priority Critical patent/KR101860051B1/ko
Publication of KR20180012348A publication Critical patent/KR20180012348A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101860051B1 publication Critical patent/KR101860051B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • C07K14/503—Fibroblast growth factor [FGF] basic FGF [bFGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 감자 식물세포 기반 염기성 섬유아세포성장인자에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 식물 세포인 감자 식물세포 배양을 통해 생산된 염기성 섬유아세포성장인자(bFGF)의 피부생리활성과 그 용도 및, 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 식물세포 기반 염기성 섬유아세포성장인자 생산 시스템 및 방법에 따라 얻어진 염기성 섬유아세포 성장인자는 종래 숙주세포로 많이 이용되고 있는 대장균에 비해 훨씬 낮은수준의 세포 독성물질을 포함하고 있으면서도 피부 생리활성을 가지고 있어 자외선과 같은 자극에 따른 노화를 방지할 수있고, 주름 개선능이 있어 기능성 화장품의 소재로써 더욱 가치있다.

Description

식물세포 배양시스템으로 생산된 피부 생리활성 염기성 섬유아세포성장인자{Basic Fibroblast Growth Factors with Skin Physiological Activity Produced by Plant Cell Culture System}
본 발명은 감자 식물세포 기반 염기성 섬유아세포성장인자에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 식물 세포인 감자 식물세포 배양을 통해 생산된 염기성 섬유아세포성장인자(bFGF)의 피부생리활성과 그 용도 및, 생산하는 방법에 관한 것이다.
식물 유전공학은 짧은 역사에도 불구하고 눈부신 발전을 하여 동식물 및 미생물 유래의 유용 유전자를 식물에 도입하여 새로운 형질을 갖는 형질전환 식물체의 개발이 가능하게 되었다. 지금까지 시도된 유전자 조작에 의한 식물체 개발은 내병성, 내충성, 제초제 내성 유전자 등의 도입에 의한 작물의 생산성 증가 등의 농업적 응용에 집중되었고, 이들은 식물 유전공학의 1세대를 형성하였다.
그러나 최근 들어 식물을 단순히 식량자원의 소재로 보는 농업적 응용보다는 식물이 가지는 다양한 산업 소재로서의 기능과 고등생물로서 지니는 장점 등을 이용하여 고부가가치의 유용한 재조합 단백질의 생산을 위한 생산 시스템으로서의 개발에 관심이 집중되어 있다. 즉, 식물 자체를 목적으로 하는 것이 아니라 식물을 도구로 이용하여, 도입된 유전자가 단순히 발현되는 것으로 끝나는 투입 (input) 개념보다는 도입된 유전자로부터 유래하는 새로운 물질이나 기능을 이용하려는 생산 (output)의 개념으로 이용하고자 하였으며, 이것이 곧 2세대 식물 유전공학의 기본 개념이다.
식물은 의료용 및 산업용 단백질의 대량생산 시스템으로 특히 매력적인데, 그 이유는 기존에 확립되어 있는 전통적인 농업기반을 이용하여 쉽게 수확하고 가공할 수 있으므로 원하는 생물자원 (biomass)의 대량확보가 가능하기 때문이다. 또한 단백질 발현 시스템으로 주로 이용되었던 세균과 달리 식물체는 포유동물 단백질의 활성에 필수적인 후-해독 수식 과정이 수행되는 진핵생물 단백질 합성 경로를 갖고 있다 (Cabanes-Macheteau et al., Glycobiolgy 9:365-372(1999)).
미생물을 이용한 재조합단백질 기술은 생산단가 경쟁력 확보가 가능하여 산업용 단백질의 경우 대부분의 재조합단백질 생산이 근본이 되는 기술이다. 그러나, 이러한 미생물을 이용한 재조합단백질 생산 기술은 높은 생산 효율성에도 불구하고 미생물 이용에서 유래되는 근본적인 단점을 내재하고 있다.
한편, 식물세포배양 (plant cell culture technology)이란 식물체에서 분리하여 유도한 세포를 무균조건하에서 적당한 환경과 배지 조건에서 배양하는 것을 말한다. 최근에는 식물세포를 이용한 외래 단백질 생산이 시도되고 있으며 식물세포라는 생산 숙주가 갖는 특별한 장점을 지니고 있다.
미생물을 이용한 일반적인 재조합단백질의 생산에 비해 식물세포 배양시스템을 이용한 성장인자의 생산은 많은 장점을 갖는다. 세균 등을 활용한 미생물 시스템의 경우에는 재조합단백질들을 쉽게 대량생산할 수 있는 장점이 있지만 단백질의 적절한 접힘 (folding), 이황화결합 (disulfide bond)의 형성 및 당화 (glycosylation)과정 등 단백질 합성 후 변형과정 (post-translational modification)이 일어나지 않는 문제가 있어 당단백질의 생산에는 적합하지 않다. 비록 유전공학적인 방법에 의해 개량된 포유동물 세포배양 시스템의 경우 인체 내에 존재하는 형태와 가장 가까운 당단백질을 생산할 수 있는 방법이지만 세포배양을 위한 포유동물 유래의 각종 호르몬, 생장조절물질 및 배지 등의 사용과 대량생산을 위한 설비확충에 많은 비용이 드는 문제점을 가지고 있고, 인체에 감염할 수 있는 바이러스나 프리온 단백질 등의 위험을 내재하고 있다. 반면에 식물세포 배양시스템 혹은 분자농업을 활용한 재조합단백질의 생산은 포유동물 세포배양, 세균 및 효모 배양 시스템에서 존재할 수 있는 각종 오염원들의 감염 위험이 적어 안전성이 높고, 폐기물 또한 다른 시스템들에 비해 친환경적이므로 환경오염의 문제도 해결할 수 있다. 특히 식물세포를 이용한 항노화 성장인자와 피부생리활성 성장인자들의 생산 기술은 해당 소재들을 활용한 다양한 화장품 및 코스메슈티컬의 제조시 자극성 물질을 원천적으로 제저할 수 있어 피부 자극과 부작용을 획기적으로 감소시킬 수 있다. 또한 식물에서 생산되는 방법이 화장품 산업의 자연주의 선호적 시장 동향과 일치하여 향후 그 경제적 가치가 크게 성장할 수 있는 핵심기술이다.
섬유아세포 성장인자(FGF)는 구조적으로 관련된 9개의 폴리펩타이드이며, 세포 증식, 분화 및 일반적인 성장을 조절하는 강력한 조절자이다. 이는 종양형성과 전이의 병리학적 과정에도 관여한다 (Galzie et al. Biochem. Cell Biol. (1997) 75: 669-685). 이는 내피세포를 포함한 광범위한 중배엽 및 신경상피 유래 세포에 대한 강력한 유사분열물질이면서 분화 인자이다. 헤파린 프로테오글리칸, 헤파린 또는 헤파린 황산염은 FGF 수용체에 제시된 다수의 FGF 분자들과 복합체 형태로 결합한다. FGF 단백질은 자신의 수용체와 결합하여 단백질 티로신 키나제를 활성화시킨다. 이러한 티로신 키나제의 인산화는 새로운 mRNA의 전사를 포함한 다수의 신호를 개시한다. 염기성과 산성의 두 섬유아세포 성장인자가 맥관형성의 강력한 유도자로 공지되어있다(Friesel et al. (1995) FASEB J. 9: 919-925). 염기성과 산성 인자 모두가 혈관형성 제어와 함께 정상적 맥관형성과 병리학적 맥관형성에 관여한다 (Slavin, J. (1995) Cell Biology International 19(5): 431-444). 이들 인자는 이미 정제되어 아미노산 서열이 결정되어있으며 이들의 cDNA도 클로닝되어 서열분석되었다.
FGF-2로도 잘 알려진 bFGF (basic Fibroblast Growth Factor)는 mesenchymal, neuroectodermal 과 endothelial origin의 세포 성장을 촉진하는 헤파린 결합된 성장인자이다. basic Fibroblast Growth Factor는 in vitro 상에서 다양한 형태의 세포 증식을 야기 하는데, fibroblast, myoblasts, osteoblasts, neuronal cells, endothelial cells, keratinocytes, chondrocytes 등 다른 많은 세포들의 성장을 촉진한다. 이 bFGF (basic Fibroblast Growth Factor)는 상처치료를 촉진하는 인자로 사용되어 왔는데, 특히 피부궤양이나 욕창등에 널리 사용되어 왔다.
현재에는 bFGF는 피부과와 같은 병원 등에서 레이져 박피 후 피부재생을 촉진하는 소재로 사용되어지고 있으며, 고기능성 화장품 소재로서 각광을 받고 있으며, 실제로 현재 bFGF와 bFGF의 화장품 소재로서 활용이 활발하게 이루어 지고 있으며, 그 요구도 증가하고 있는 추세이다. 또한, 최근 피부재생과 더불어 모발 형성 및 모발 생육촉진에 대한 생리활성이 부각되어 화장품 원료로써 각광받는 항노화 호르몬 단백질로 높은 의학적 및 산업적 가치를 가지고 있다. bFGF와 관련된 선행 특허로는 피부 투과촉진하는 피부 개선용 화장료 조성물에 관한 특허가 있다.
화장품에는 다양한 천연식물들이 사용되고 있는데, 이중에서 감자(Solanum Tuberosum L.)에 대한 연구는 지금까지 날로 증가하고 있으며, 과거에 천연팩등의 주요 소재로 사용됨에서 나아가 감자 내에 천연활성을 갖는 성분이나 영양소를 이용한 화장품 소재로의 응용분야 개척에 관심이 모아지고 있다.
대한민국특허 10-1602690
본 발명자들은 인간의 성장인자들 중 주름개선 및 탈모방지의 효과를 갖는 성장인자 염기성 섬유아세포성장인자(bFGF)를 식물세포인 감자 식물세포 (혹은 캘러스)에서 높은 함량으로 생산하는 기술을 발명하고, 감자 식물세포 (혹은 캘러스) 배양시스템 기반 염기성 섬유아세포성장인자 생산기술을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF) 발현용 재조합 벡터가 도입된 감자 식물세포를 이용하는 염기성 섬유아세포 성장인자의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 염기성 섬유아세포 성장인자 유전자가 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 염기성 섬유아세포 성장인자 발현용 재조합 벡터를 감자 식물세포에 형질전환하는 단계를 포함하는 염기성 섬유아세포 성장인자 발현용 감자 식물세포의 제조방법를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 발현능을 가지는 감자 식물세포를 제공하는 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
일 관점에서, 본 발명은 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF) 발현용 재조합 벡터가 도입된 감자 식물세포 (혹은 캘러스)를 이용하는 염기성 섬유아세포 성장인자의 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 도 1의 개열지도를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기방법은 염기성 섬유아세포 성장인자 발현용 재조합 벡터가 도입된 감자 식물세포를 배양하여 염기성 섬유아세포 성장인자를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
여기서, 감자 식물세포를 배양할 시에 사용되는 배지는 BM 배지로, 1.0 mg/L를 pichloram을 함유하는 BM 배지이며, BM배지의 조성은 1L당 MS salt + myo-inositol 100mg/l + vitamins + 3% sucrose + 0.8% agar, pH 5.8이다.
다른 관점에서, 본 발명은 염기성 섬유아세포 성장인자 유전자가 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 염기성 섬유아세포 성장인자 발현용 재조합 벡터를 감자 식물세포에 형질전환하는 단계를 포함하는 염기성 섬유아세포 성장인자 발현용 감자 식물세포의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 염기성 섬유아세포 성장인자 유전자가 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 벡터로써, 도 1의 개열지도를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
이러한 재조합 벡터를 감자 식물세포 (혹은 캘러스)에 형질전환 하는 단계는, (a) 상기 발현용 재조합 벡터를 아그로박테리움에 도입하고, 감자 조직과의 공동 배양을 통해 수행하는 단계를 포함할 수 있는데, 이 과정은 상업용 아그로박테리움 예컨대, GV3101에 상기 재조합 벡터를 도입하고,감자 조직, 예컨대, 잎의 절편을 함께 공동 배양하는 과정을 포함한다.
본 발명에 있어서, 아그로박테리움의 식물체 감염은 식물의 잎 절편들을 아그로박테리움의 배양액에 접촉시키는 방법을 사용하므로, 공동 배양시 배지는 (감염 전후의 감자 잎 절편의 유지배지인) BM 배지에 2.0mg/ml 2,4-D를 첨가한 배지일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 상기 (a) 단계 다음에,
(b) 상기 공동배양된 감자 잎 절편체들을 재분화하는 단계; (c) 재분화된 감자 식물체들로부터 bFGF 발현용 감자 식물체를 선별하는 단계; 및 (d) 선별된 감자 식물체로부터 기내식 배양용 감자 식물세포를 유도 배양하는 단계;를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 (c) 단계는 재분화된 감자 식물체들을 분자생물학적으로 검사하여 형질전환이 우수하고 bFGF의 생산이 우수한 식물체를 선별하는 단계이며, (d) 선별된 감자 식물체로부터 기내식 배양이 가능한 감자 식물세포 (캘러스)를 유도 배양하는 단계를 포함한다.
상기 방법에서 사용된 배지들은 본 기술분야에서 아그로박테리움 감염을 위해 사용되는 배지, 분화 유도 배지, 캘러스 유도 배지라면 모두 적용가능하고, 예를 들어서,아래와 같은 조성을 포함하는 배지를 이용할 수 있다.
- 감염 전후 감자 잎 절편의 유지 배지: BM배지+2.0mg/l 2,4-D
- 감자 잎 절편에서 분화 유도 배지: BM배지+ 2.0mg/l zeatin + 0.1mg/l GA3 + 0.01mg/l NAA + 100mg/l kanamycin + 500mg/l carbenicillin
- 분화된 감자 잎 절편에서 식물세포 (캘러스) 유도 배지: BM배지+1.0mg/l picloram-1
상기 방법을 통해 얻어지는 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)는 대장균과 같은 숙주세포를 이용하여 생산된 bFGF에 비하여 훨씬 낮은 수준의 엔도톡신을 함유하고 있다.
본 발명은 식물세포 기반 염기성 섬유아세포성장인자 생산 시스템에 따라 얻어진 염기성 섬유아세포 성장인자는 종래 숙주세포로 많이 이용되고 있는 대장균에 비해 훨씬 낮은수준의 세포 독성물질을 포함하고 있으면서도 피부 생리활성을 가지고 있어 자외선과 같은 자극에 따른 노화를 방지할 수있고, 주름 개선능이 있어 기능성 화장품의 소재로써 더욱 가치있다.
도 1은 본 발명의 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF) 발현을 위한 발현벡터(pBYR2fN-his-bFGF)의 구성을 나타낸 지도이다.
도 2는 2fN-his-bFGF를 발현하는 형질전환 식물체의 분자적 분석결과로, (a)는 지노믹 DNA 확인, (b)NPT II gene PCR, (c) 35s F+bFGF R PCR, (d) bFGF gene PCR 이다.
도 3 및 도 4는 2fN-his-bFGF를 발현하는 형질전환 식물체의 cDNA RT-PCR (도 3) 및 real-time quantitative RT-PCR 분석결과 (도 4)이다.
도 4에서 그래프 막대는 왼쪽부터 NC, bFGF-2, bFGF-3, bFGF-4,bFGF-6, bFGF-7, bFGF-8, bFGF-9, bFGF-10, bFGF-13, bFGF-14, bFGF-16이다.
도 5는 pBYR2fN-his-bFGF 단백질을 발현하는 형질전환된 식물체의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿 결과를 나타낸 것이다 (NC: Negative control, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 14, 16: 독립적인 형질전환 라인들).
도 6은 형질전환된 식물체 라인들로부터 유래된 캘러스의 웨스턴 블럿 분석 결과를 나타낸 것이다 (PC: Positive control: 10ng, 그리고 3, 4, 6, 8, 16는 각각 독립적인 형질전환 라인들을 나타낸다).
도 7은 항원-항체 분석법 (immunoblotting 분석)을 통한 식물세포 유래 bFGF의 확인한 결과이다.
도 8은 식물세포 유래 a/bFGF의 endotoxin 무검출 확인한 결과이다.
도 9는 UVB 조사 선량에 따른 HaCaT 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 10은 식물세포 및 대장균 유래 성장인자 bFGF의 HaCat 세포주의 UVB 보호 효과를 나타낸 결과이다.
도 11 및 도 12는 눈가 주름 개선 시험 결과를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
식물세포 기반 염기성 섬유아세포 성장인자의 제조
1.1 발현 벡터 제작 및 bFGF 발현
타겟 유전자인 염기성 섬유아세포 성장인자 (bFGF)가 도입된 pBYR2fN-his-bFGF를 제작하였다(유진바이오텍).
벡터의 구조는 도 1의 지도와 같다. 이러한 벡터를 감자 품종 중 하나인 수미에 도입하기 위해서, Agrobacterium-mediated 형질전환 방법을 수행하였다. 감자 식물체 상부 잎의 절편을 약 0.3cm2 정도로 취한 다음 OD600=0.6 내외로 자란 아그로박테리움 균주인 GV3101 (harboring pBYR2fN-his-bFGF, pBYR2fN-his-(s)bFGF)과 20분간 공동배양하였다. 멸균된 paper위에서 절편체를 완전 건조시켜 아그로박테리아 잔여를 제거하고, 2일 동안 유전자의 도입을 촉진시키기 위하여 항생제-free 캘러스 유도배지 (BM배지+2.0mg/l 2,4-D)에서 배양한 후 재분화를 유도하기 위한 배지로 옮겨주었다 (BM배지+ 2.0mg/l zeatin + 0.1mg/l GA3 + 0.01mg/l NAA + 100mg/l kanamycin + 500mg/l carbenicillin). 약 1주일후부터 상처부위에서 캘러스가 형성되고 그로부터 2주 가량 지나면 multishoot들이 형성되었다. 2주 간격으로 새로운 배지로 옮겨주어 항생제 배지에서 뿌리가 튼튼하게 내리기 시작하는 독립 shoot들을 호르몬이 첨가되지 않고 100mg/l kanamycin과 500mg/l carbenicillin이 첨가되어 있는 BM배지로 옮겨주어 성숙된 개체로의 생육을 유도하였다. 형질전환된 식물체 선별은 genomicDNA PCR 및 RT-PCR 방법을 이용하였다. 그 결과, genomic DNA PCR에서 pBYR2fN-his-bFGF 유전자가 도입된 형질전환체는 11개체 였다. (도 2)
1.2 pBYR2fN-his-bFGF 감자 transgenic plant line 분석
앞에서 genomic DNA PCR에서 선별된 11개의 pBYR2fN-his-bFGF 수미 형질전환체를 앞에서 설명한 방법으로 total RNA를 추출하고 cDNA로 합성하는 방법으로 RT-PCR을 수행하였다. 또한 정량적 발현양을 확인하기 위하여 앞에서 설명한 Real-time quantitative RT-PCR 및 western blot 방법을 수행하여 발현양이 높은 5개체를 선별하였다 (도 3 내지 5).
1.3 pBYR2fN-his-bFGF 감자 transgenic line plant 유래 callus 라인 분석
Real-time quantitative RT-PCR 및 western blot으로 확인된 형질전환체의 잎을 1mg·L-1 picloram 포함하는 BM배지(MS salt + myo-inositol 100mg/l + vitamins + 3% sucrose + 0.8% agar, pH 5.8)에 치상하여 25℃, 암배양하여 캘러스를 유도하였다. 약 4주 후 유도된 캘러스만 동일 배지에 계대 배양하여 증식 후 목적단백질의 발현 유무를 확인하기 위해 western blot을 수행하였다. 증식된 캘러스 0.5g을 취하여 앞에서 수행한 western blot과 동일한 방법으로 실험하였다. 그 결과 2fN-his-bFGF 3,4,6번 형질전환체에서 유래된 캘러스에서 목적 단백질의 발현이 유의하게 매우 높은 것을 확인 하였으며, 식물세포 배양시스템 기반 항노화 성장인자 bFGF의 고발현 세포주(한국생물자원센터 (KCTC), 기탁번호: bFGF-PC10843)를 확보하였다 (도 6).
면역블롯팅을 다음과 같이 실시하였다
앞에서 준비한 TSP를 정량 후 95℃에서 5분 incubation 하고 12% Mini-protein TGXTM Gel(Bio-rad)에서 크기에 따른 단백질의 분리 (20mA)를 실시 한 후, polyvinylidene fluoride membrane으로 전이 시켰다 (200mA, 90분). 이 membrane을 5% skim milk로 2시간 동안 blocking하였고 TBST 버퍼 (137 mM NaCl, 20 mM Tris, 0.1% Tween-20) 로 15분씩 3차례 세척과정을 거친 후 항체 반응과 검출과정을 수행하였다. Rabbit poly anti-human bFGF (1:5000)으로 1차 항체를 붙인 다음 (overnight, 4℃), TBST 버퍼로 세척하고 (15분, 3회), 뒤이어 goat anti-rabbit IgG (1:2500) 2차 항체를 붙였다 (3시간, RT). 다시 TBST 버퍼로 세척 (15분, 3회)한 후 NBT/BCIP 발색으로 특이 밴드를 검출하였다 (도 7).
실험예 1 : 엔도톡신 확인 시험
식물세포 배양시스템을 통해 생산된 성장인자들은 다양한 면역 반응 및 피부 알러지 반응의 원인이 될 수 있는 대장균 유래 endotoxin이 존재하지 않는 점이 대장균 유래 성장인자들에 비해 큰 장점이 될 수 있다.
실시예 1에서 얻어진 bFGF가 실제로 엔도톡신(endotoxin)을 함유하고 있는지 그 존재 및 함량을 분석하기 위하여 대장균 (E. coli)에서 생산한 bFGF를 대조군으로 하여 비교 평가 실험을 실시하였다.
구체적으로, ToxinSensor Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit(GenScrip사, USA )을 사용하여 비교 평가를 실시하였고, 제조자의 지시에 따라 절차를 수행하였다.
그 결과, 대장균 유래 bFGF와 식물세포 유래 bFGF를 각각 40 ug/ml 농도로 현탁하여 엔도톡신(endotoxin) 함량을 비교 평가한 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 대장균 유래 bFGF에서는 0.038 EU/ml의 endotixin이 검출된 반면, 식물세포 유래 bFGF에서는 0.002 EU/ml의 endoxoin이 검출됨을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따라 얻어진 감자 식물세포 유래 bFGF는 피부 세포에 더욱 안전하고, 알러젠이 없는 우수한 품질의 성장인자임을 확인하였다.
실험예 2 : in vitro 피부 세포 UV- 독성 시험
인체 피부의 노화는 다양한 환경성 스트레스에 의해 유발되며 이러한 요인에는 환경 오염물질들 및 UV 조사 등을 들 수 있다. 세포 독성 수준의 UVB 조사시 다양한 농도의 식물세포 배양시스템 기반 항노화 성장인자들을 처리하여 인간상피세포주 (HaCaT cell line)가 받은 UV-유도성 세포독성을 보호하는 정도를 MTT 시험법으로 평가하였다.
각질형성 세포주 HaCaT 세포를 3 X 104 cells/well를 96well plate에 넣고 배양기에서 48시간 동안 배양하고, 배양된 세포에서 배양배지를 제거하고 인산완충액(phosphated buffered saline, PBS)으로 세척하였다. 대장균 및 식물세포 유래 bFGF를 농도별(0.625, 1.25, 2.5ppm)로 처리한 다음 UV crosslink(Bio-Link-BLX, France)를 이용하여 200mJ/㎠의 UVB를 조사한 후, UVB를 조사하지 않은 군 및 시료를 첨가하지 않고 UVB만 조사한 대조군과 세포 생존율을 비교함으로써 시료의 UVB 보호 효과를 측정하였다. 시험 결과, HaCaT세포주에 UVB의 조사량을 달리하여 세포생존율을 확인한 결과 200mJ/㎠에서 생존율이 40% 이하로 저하됨을 확인하였다 (도 9).
식물세포 및 대장균 유래 성장인자 bFGF들을 다양한 농도별로 처리한 후 UVB 200mJ/㎠를 조사하여 24시간 배양하고 MTT 시험법으로 세포생존율을 측정한 결과, 대장균 유래 성장인자 bFGF와 식물세포 유래 성장인자 bFGF 모두 UVB 조사로 인한 세포의 손상을 완화시켜 주는 효과를 보임을 확인하였다. 식물세포 유래 bFGF는 측정한 농도 모두에서 UVB에 대한 보호효과를 보였으며 특히 2.5ppm에서 UVB 비조사군 대비 각각 약 72% 정도의 회복능을 나타내었다 (도 10).
실험예 3 : 주름 개선 효능 시험
주름개선 유효성을 평가하는 인체 피부 주름개선시험을 인체적용시험 전문기관인 P&K피부임상연구센터(주)에 의뢰하여, 얻은 결과는 다음과 같았다.
5.1. 눈가 주름 측정 결과 (R1)
시험제품과 대조제품 사용에 의한 피부 주름 변화를 확인하기 위하여 사용 전, 사용 4주 후, 사용 8주 후 R4 값을 측정하였다. 시험제품 사용 부위는 사용 전 87.50±18.16, 사용 4주 후 77.39±22.15, 사용 8주 후 75.16±20.30으로 나타났으며, 대조제품 사용 부위는 사용 전 82.44±22.36, 사용 4주 후 83.18±22.55, 사용 8주 후 84.50±24.72로 나타났다. 통계적 방법으로 유의성 여부를 검정한 결과, 시험제품 사용 부위는 제품 사용 전과 비교하여 사용 4주 후 피부 주름이 유의적으로 감소(p<0.025)하였다. 군간 비교 시 사용 4주 후, 8주 후에서 시험제품 사용 부위와 대조제품 사용 부위 간에 통계적으로 유의한 차이가 있었다.(아래 표 참고, 도 11)
Figure 112017068207465-pat00001
5.2. 눈가 주름 측정 결과 (R2)
시험제품과 대조제품 사용에 의한 피부 주름 변화를 확인하기 위하여 사용 전, 사용 4주 후, 사용 8주 후 R5 값을 측정하였다. 시험제품 사용 부위는 사용 전 49.09±6.77, 사용 4주 후 46.96±7.17, 사용 8주 후 43.65±5.87로 나타났으며, 대조제품 사용 부위는 사용 전 47.67±8.30, 사용 4주 후 48.51±9.89, 사용 8주 후 47.83±6.52로 나타났다. 통계적 방법으로 유의성 여부를 검정한 결과, 군간 비교 시 사용 8주 후에서 시험제품 사용 부위와 대조제품 사용 부위 간에 통계적으로 유의한 차이가 있었다. (아래 표 참고, 도 12)
Figure 112017068207465-pat00002
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (6)

  1. 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF) 발현용 재조합 벡터가 도입된 감자 식물세포를 이용하는 주름 개선용 화장품 소재로써 사용을 위한 염기성 섬유아세포 성장인자의 생산 방법으로, 상기 방법은,
    (a) 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF) 발현용 재조합 벡터를 아그로박테리움에 도입하고, 감자 잎 조직과의 공동 배양을 수행하는 단계;
    (b) 상기 공동배양된 감자 잎 절편체들을 재분화하는 단계;
    (c) 재분화된 감자 식물체들로부터 bFGF 발현용 감자 식물체를 선별하는 단계; 및
    (d) 선별된 감자 식물체로부터 기내식 배양용 감자 식물세포인 캘러스를 유도 배양하는 단계;
    를 통해 상기 염기성 섬유아세포 성장인자 발현용 재조합 벡터가 도입된 감자 식물세포를 제조하는 단계를 포함하고,
    상기 염기성 섬유아세포 성장인자 발현용 재조합 벡터가 도입된 감자 식물세포를 배양하여 염기성 섬유아세포 성장인자를 수득하는 단계를 포함하는 더 포함하고,
    상기 방법을 통해 얻어진 염기성 섬유아세포 성장인자는 UV에 대한 피부 보호능을 가지고,
    상기 방법을 통해 얻어진 염기성 섬유아세포 성장인자는, 대장균을 이용하여 생산되는 염기성 섬유아세포 성장인자 보다, 적은 엔도톡신을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
KR1020160079663A 2016-06-24 2016-06-24 식물세포 배양시스템으로 생산된 피부 생리활성 염기성 섬유아세포성장인자 KR101860051B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160079663A KR101860051B1 (ko) 2016-06-24 2016-06-24 식물세포 배양시스템으로 생산된 피부 생리활성 염기성 섬유아세포성장인자

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160079663A KR101860051B1 (ko) 2016-06-24 2016-06-24 식물세포 배양시스템으로 생산된 피부 생리활성 염기성 섬유아세포성장인자

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180012348A KR20180012348A (ko) 2018-02-06
KR101860051B1 true KR101860051B1 (ko) 2018-05-25

Family

ID=61227949

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020160079663A KR101860051B1 (ko) 2016-06-24 2016-06-24 식물세포 배양시스템으로 생산된 피부 생리활성 염기성 섬유아세포성장인자

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101860051B1 (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101359305B1 (ko) * 2011-10-25 2014-02-11 한국생명공학연구원 감자 유래의 괴경 조직 특이적 라케이즈 프로모터 및 이의 용도

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101359305B1 (ko) * 2011-10-25 2014-02-11 한국생명공학연구원 감자 유래의 괴경 조직 특이적 라케이즈 프로모터 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
KR20180012348A (ko) 2018-02-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Reski et al. Moss‐made pharmaceuticals: from bench to bedside
CN104946656B (zh) 一种人源碱性成纤维细胞生长因子、烟草叶绿体表达载体及生产方法
CN114805551B (zh) 一种重组iii型胶原蛋白及其制备方法
US11034970B2 (en) Production of protein from hairy roots of a Brassicaceae plant utilizing rhizobium comprising rol genes
KR20080039885A (ko) 식물 세포로부터 생산된 세포 배양 배지의 성분
KR20000075076A (ko) 형질전환된 미세조류를 이용하여 외래 단백질을 생산하는 방법
CN116574172A (zh) 重组人源化i型胶原蛋白及其制备方法
JP5662363B2 (ja) 難発現性タンパク質の分泌のためのタンパク質融合因子（ｔｆｐ）を明らかにする方法、タンパク質融合因子（ｔｆｐ）ライブラリーを製造する方法、及び難発現性タンパク質の組み換え的生産方法
US11549120B2 (en) Method for introducing substance into plant
Sreevidya et al. Expression of the legume symbiotic lectin genes psl and gs52 promotes rhizobial colonization of roots in rice
CN107955067A (zh) 参与桃黄酮醇生物合成调控的两个myb转录因子及其应用
CN104789531B (zh) 一种将脐带间充质干细胞诱导分化成多巴胺能神经元的方法
KR101860051B1 (ko) 식물세포 배양시스템으로 생산된 피부 생리활성 염기성 섬유아세포성장인자
KR101860040B1 (ko) 식물세포 배양시스템으로 생산된 피부 생리활성 산성 섬유아세포성장인자
CN108486153B (zh) FGF2与TGF-β1融合基因在促进蚕丝细胞增殖活性和抗炎功能中的应用及方法
EP3536790A1 (en) Vector for expressing human epidermal growth factor or skin-permeable human epidermal growth factor, and microalgae transformed with vector
CN114107253B (zh) 一种利用工程细胞进行基因编辑的系统及方法
CN108976293A (zh) 荔枝花色素苷生物合成负调控基因及其应用
CN112851779A (zh) 一种培育花青苷含量提高的转基因植物的方法
DE112006000559T5 (de) Verfahren zur Expression und Anreicherung eines Peptids in einer Pflanze
US20240218388A1 (en) Inducible Promoter for Rice Expression System, Synthetic Biological Platform and Use Thereof
KR100447920B1 (ko) 오이 형질전환체의 제조방법 및 형질전환 오이
KR100798894B1 (ko) 재조합단백질 생산용 단백질융합인자
CN110106168A (zh) 基于转录因子间的互作关系构建双激素响应启动子的方法
KR101660383B1 (ko) 저온저항성 박 대목 형질전환체 및 이의 제조 방법

Legal Events

Date Code Title Description
AMND Amendment
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant