CN102369287A - 纳米颗粒介导的序列特异性核酸酶的投递 - Google Patents

Abstract

提供了用于将序列特异性核酸酶导入包含细胞壁的植物细胞中的方法。提供了用于遗传修饰或以其它方式修饰植物及在包含细胞壁的植物细胞中治疗或预防疾病的方法。

Description

纳米颗粒介导的序列特异性核酸酶的投递

对相关申请的交叉引用

本申请要求2009年4月7日提交的美国临时申请61/167,389的权益。

发明背景

可以利用纳米颗粒的独特性质来将DNA投递到细胞中。在所调查的纳米颗粒(例如钨、铝、镍等)中，金纳米颗粒(GNP)趋向为投递DNA的卓越候选物。低细胞毒性和容易用有生物学意义的多种配体官能化使金纳米颗粒成为转化的优先选择。金纳米颗粒的大小范围可以为1.2nm-600nm。通常使用的GNP合成对20-400nm的颗粒生成带负电荷(例如柠檬酸盐包被)的表面，而更小的1-10nm范围的GNP是带正电荷的。质粒DNA(其具有足以部分解开其碱基的柔性)可以暴露于金纳米颗粒。在柠檬酸盐官能化的GNP的情况中，质粒DNA能部分解开。DNA主链上的负电荷足够远，从而使得碱基与金纳米颗粒间的范德华引力引起质粒DNA的附着，并包被金颗粒的表面。而在带正电荷的GNP的情况中，静电力和范德华力可以促成DNA的包被或附着。

在金属纳米颗粒外，还已经使用大小范围在3-5nm内的半导体纳米颗粒(例如量子点)(“QD”)作为载体来将分子投递到细胞中。DNA和蛋白质可以包被或连接到用配体多官能化的QD表面(参见，例如Patolsky，F.等，J.Am.Chem.Soc.125，13918(2003))。可以通过使用标准的生物缀合方案(参见例如Pinaud，F.，D.King，H.-P.Moore，S.Weiss，J.Am.Chem.Soc.126，6115(2004)；Bruchez，M..，M.Moronne，P.Gin，S.Weiss，A.P.Alivisatos，Science 281，2013(1998))来将经羧酸或胺多官能化的QD与含有硫醇基团(参见例如Dubertret B等，Science 298，1759(2002)；Akerman，M.E.，W.C.W.Chan，P.Laakkonen，S.N.Bhatia，E.Ruoslahti，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99，12617(2002)；Mitchell，G.P.，C.A.Mirkin，R.L.Letsinger，J.Am.Chem.Soc.121，8122(1999))或N-羟基琥珀酰亚氨基(NHS)酯基团的分子交联。一种备选的方式是经由与链霉亲合素的缀合来多官能化QD。链霉亲合素与生物素化的蛋白质、寡聚物或抗体缀合(参见例如Dahan M.等，Science 302，442(2003)；Pinaud，F.，D.King，H.-P.Moore，S.Weiss，J.Am.Chem.Soc.126，6115(2004)；Dahan M.等，Science 302，442(2003)；Wu.X.Y.等，Nature Biotechnol.21，41(2003)；Jaiswal，J.K.，H.Mattoussi，J.M.Mauro，S.M.Simon，Nature Biotechnol.21，47(2003)；及Mansson，A.等，Biochern.Biophys.Res.Commun.314，529(2004)。

已经使用纳米颗粒来将质粒DNA投递到多种动物细胞。已经发现了，在将经DNA包被的纳米颗粒与没有细胞壁的细胞一起温育时，细胞吸收该纳米颗粒，并开始表达DNA上编码的任何基因。在期望对通常具有细胞壁的细胞进行的纳米颗粒投递的情况中，在将所述颗粒添加至原生质体前将细胞壁剥离(参见Torney，F.等，Nature Nanotechnol.2，(2007)。在植物细胞中，细胞壁充当投递外源应用的分子的屏障。已经采用许多侵入性方法，如基因枪(生物射弹)、显微注射、电穿孔、和土壤杆菌(Agrobacterium)来实现将基因和小分子投递至这些有壁的植物细胞中。将小分子和蛋白质投递穿过细胞壁并进入植物细胞中对于开发使得体外和体内操作完整植物的细胞、组织、和器官能够进行的技术会是有利的。

虽然在细菌、酵母、动物细胞、和苔藓中得到完全建立，但是基因添加(将外来DNA导入预定的基因组位置中)在高等植物中仍然是一项重大的挑战。与随机整合相比，位点特异性转基因整合在植物细胞中以非常低的频率发生，即使在引入的DNA含有大段与宿主DNA同源的序列时(Halfter等1992；Lee等1990；Mia和Lam(1995)。例如，高效的基于土壤杆菌的转染系统和除草剂选择导致在稻中多至5x10^-4的基因靶向频率。在植物中提高基因靶向效率的尝试已经包括使用负选择标志，及使用遗传工程化改造成展现出较高靶向频率的植物。尽管有这些努力，但是经由非同源过程的随机DNA整合仍然是植物中基因靶向的主要障碍。鉴于对于靶向基因的添加在用于农业和工业生物技术的作物的修饰中所设想的广泛效用，迫切需要此问题的解决办法。

在这点上，已经在宿主细胞中的特定基因组位置处诱导DNA双链断裂(DSB)(其刺激天然的细胞过程，即同源性指导的DSB修复)后观察到一大批植物和动物模型系统中的基因靶向频率的实质性升高。已经以此方式使用识别位点在植物基因组中罕见的天然存在的位点特异性内切核酸酶来驱动转基因整合至靶序列中，所述靶序列先前经由随机整合而转移到所述植物基因组中。这些研究突出显示了靶向性DSB诱导在植物细胞中刺激基因靶向的潜力，尽管在天然的基因座中引入DSB的挑战仍然存在。

在动物细胞中，经由多种核苷酸序列特异性结合蛋白诸如亮氨酸拉链、锌指蛋白等来实现靶向性基因组调控/操作的解决办法。这些蛋白质涉及作为转录因子的基因调节和/或可以用于在天然基因组位置处诱导DSB。可以通过数类不同序列特异性核酸酶诸如大范围核酸酶、亮氨酸拉链、锌指蛋白等和新近开发的新型嵌合型式的这些蛋白质来提供DSB。描述得最好的核苷酸特异性结合蛋白之一是锌指蛋白(ZFP)。C2H2锌指在两栖动物转录因子TFIIIA中发现，并且从此发现它是所有后生动物物种中最常见的DNA识别基序。C2H2ZFP，即Zif268的X射线晶体结构揭示了蛋白质-DNA识别的显著字节模式，其中每个锌指规定串联布置背景中的3或4bp亚位点，而且提示了使用此肽基序作为具有新特异性的DNA结合域的支架的可能性。从那时起，已经在人工转录因子和其它功能性嵌合蛋白的背景中在许多不同实验室成功使用了工程化改造成结合新序列的大量ZFP。已经使用C2H2锌指蛋白域作为序列特异性DNA结合的支架(Pavelitch和Pabo 1991)，并通过融合锌指蛋白域与源自IIS型限制性内切核酸酶FokI的非序列依赖性核酸酶域来生成ZFN(Kim等1996)。已经使用经工程化改造的ZFN来驱动对经转化的(Moehle等2007)和原代的人细胞(Lombardo等2007)中的内源基因组基因座的高效率靶向。

在植物中使用ZFN上的最初尝试已经是有希望的(Lloyd等2005；Wright等2005；Maeder等2008)。将携带在诱导型启动子控制下的ZFN基因及其相应的识别序列的构建体稳定整合到拟南芥(Arabidopsis)中，并且显示了在诱导的后代幼苗中以平均值为7.9％的频率在识别位点处引入源自非同源末端连接的靶向突变(Lloyd等2005)。类似地，在从用设计为在SuRA基因座处切割的ZFN转化的原生质体再生的66株烟草植物中，3株展现出在靶位点处源自非同源末端连接修复的单碱基对缺失(Maeder等2008)。烟草细胞(其含有预先整合的、非功能性报告基因，该报告基因缺少正好在锌指识别序列侧翼的600bp)在与含有相应的ZFN基因和供体DNA的构建体共转化时显示同源性指导的报告基因修复的证据，所述供体DNA与包含缺少的600bp的预先整合的序列同源(Wright等2005)。最近，使用基于酵母的测定法来鉴定能够切割植物内切壳多糖酶基因的ZFN(Cai等，2009)。含有ZFN和供体DNA构建体两者的Ti质粒的土壤杆菌投递精确地对ZFN切割位点产生多至10％靶向的、同源性指导的转基因整合，所述供体DNA构建体包含pat除草剂抗性基因盒，其侧翼有小段与内切壳多糖酶基因座的同源性。重要的是，注意已经在植物中证明了基于C3H1设计的其它锌指设计(Shukla等，2009，Cai等2009)。

本发明涉及使用纳米颗粒来将序列特异性核酸酶非侵入性投递到具有细胞壁的植物细胞中的方法。

发明概述

以下实施方案与意为例示性和说明性，而非限制范围的系统、工具和方法结合描述。

依照本发明，提供了将序列特异性核酸酶导入植物细胞中的方法，该方法包括：提供具有细胞壁的植物细胞；用至少一种序列特异性核酸酶包被纳米颗粒；将所述具有细胞壁的植物细胞与经序列特异性核酸酶包被的纳米颗粒彼此接触地放置；并允许经序列特异性核酸酶包被的纳米颗粒被摄取入所述包含细胞壁的植物细胞中。

在上文所描述的例示性方面和实施方案外，其它方面和实施方案鉴于以下描述也会变得显而易见。

附图简述

图1和图2分别显示了加有组氨酸标签的(1)和未加组氨酸(2)标签的ZFN-IL1 FokI的大肠杆菌(E.coli)表达。

图3显示了由IL-1锌指-Fok1融合蛋白刺激的染色体间同源重组；其中A代表靶载体，而B代表具有重建的GFP基因的重组体。

图4显示了质粒pDAB1585的图示。

图5显示了在温育细胞后2小时显示GNP介导的YFP内在化的BY2-E单细胞系；小图A(FITC)、B(罗丹明)、C(DIC)、D(A+B)、E(A+B+C)、F(倒置的反射图像)：如经由荧光显微术观察到的YFP内在化。

图6显示了由大范围核酸酶I-SceI蛋白刺激的染色体间同源重组；其中A代表靶载体，而B代表具有重建的GFP基因的重组体。

图7显示了质粒pDAB100375的图示。

发明详述

在以下的描述和表中，使用了许多术语。为了提供对说明书和权利要求书(包括此类术语给予的范围)的清楚且一致的理解，提供了以下定义：

回交。回交可以是育种人员将杂种后代往回与亲本之一，例如第一代杂种F₁与该F₁杂种的亲本基因型之一重复杂交的过程。

胚。胚可以是成熟的种子内含有的小植物。

纳米颗粒。一种具有小于1纳米级尺寸，通常小于100nm的微观颗粒。适合于用于本发明的纳米颗粒可以具有1nm-0.4um的大小。量子点可以具有1nm-10nm，优选地2-4nm的中值直径。如本申请中所使用的纳米颗粒包括但不限于金纳米颗粒、钨纳米颗粒、经金包被的纳米颗粒、多孔纳米颗粒、介孔纳米颗粒(mesoporous nanoparticle)、硅纳米颗粒(silica nanoparticle)、聚合物纳米颗粒、明胶纳米颗粒、纳米壳(nanoshell)、纳米核心(nanocore)、纳米球(nanosphere)、纳米棒(nanorod)、磁性纳米颗粒、半导体纳米颗粒、量子点、纳米基质(nanomatrix)、树枝状聚合物纳米基质(dendrimeric nanomatrix)及其组合。

量子点。量子点是限制导带电子、价带空穴、或激子(导带电子和价带空穴的束缚对(bound pair))在所有三个空间方向上的运动的半导体纳米颗粒。该限制可以由静电势(由外部电极、掺杂、应变、杂质产生)、不同半导体材料间界面的存在(例如在核心-壳纳米晶体系统中)、存在半导体表面(例如半导体纳米晶体)、或这些的组合所致。量子点可以具有离散的量子化能谱。相应的波函数在空间上位于量子点内，但是延续经过晶格的多个周期。量子点含有小的有限数目(1-100级)的导带电子、价带空穴、或激子(即，有限数目的基元电荷)。

纳米基质包括但不限于树枝状聚合物。树枝状聚合物是球体或球状(spheroid or globular)纳米颗粒，其被工程化改造成携带封装于其内部空隙空间中或者附着于表面的分子。该分子是重复分枝的分子；分枝容许表面与散装材料(bulk material)间的多价相互作用。树枝状聚合物的例子是球形阳离子聚酰胺胺(PAMAM)级联聚合物。这些聚合物由表面上的伯胺和内部中的叔胺组成。此类树枝状聚合物通过在溶剂分解溶剂中的热处理来部分降解，由此导致较小的空间约束和较大的柔性。树枝状聚合物的高正电荷便于与DNA的静电相互作用，并且柔性结构容许树枝状聚合物在与DNA结合时压紧，而在自DNA释放时膨胀。转染或转化效率由于树枝状聚合物的正电荷和柔性结构特性而升高。树枝状聚合物可以获自Qiagen(Qiagen，Germantown，MD)，树枝状聚合物以Superfect^TM Transfection Reagent(产品目录编号301305)对公众出售。

多官能化。除非另有规定，术语“多官能化”会用于描述单或多官能化的纳米颗粒。单官能化的颗粒应当指其上已经化学结合单一类型的官能团的官能化纳米颗粒或纳米颗粒的团聚。多官能化颗粒应当指其上已经化学结合至少两种，且可能三种或更多种不同类型的官能团的纳米颗粒或纳米颗粒的团聚。

对除草剂的抗性。对一定剂量的除草剂的抗性指植物幸免于(即植物可以不被杀死)会抑制生长和/或导致非抗性植物不能存活的活性成分的所述剂量的能力。在一些情况中，耐受性植物可能暂时变黄或者在其它方面展现出一些除草剂诱导的损伤(例如，过度分蘖和/或生长抑制)，但是能恢复。

稳定化的。稳定化的指从同一品种的近交植物的一个世代可再现地(reproducibly)传递给下一世代的植物特征。

摄取。摄取指颗粒或基质，诸如纳米颗粒，例如金、树枝状聚合物、或量子点穿过细胞壁或细胞膜的易位，其中所述易位不仅仅由于除摄取颗粒的细胞外的某物对颗粒赋予的动量而发生。仅由于对颗粒赋予的动量而引起颗粒穿过细胞壁或细胞膜的易位的装置或方法的非限制性例子是生物射弹、基因枪、显微注射、和/或刺穿感染(impalefection)技术。

核酸。术语“核酸”、“多核苷酸”、和“寡核苷酸”可互换使用，指线性或环形构象及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸聚合物、或其它核苷酸或核苷聚合物。出于本公开内容的目的，这些术语不应解释为限制聚合物的长度。术语可以涵盖天然核苷酸的已知类似物，及在碱基、糖和/或磷酸酯模块(例如硫代磷酸酯主链)中进行修饰的核苷酸。一般地，特定核苷酸的类似物具有相同的碱基配对特异性；即A的类似物会与T进行碱基配对。

染色体。染色体指构成细胞的整个或部分基因组的染色质复合物。细胞的基因组经常以其核型表征，所述核型是构成细胞基因组的所有染色体的集合。细胞的基因组可以包含一条或多条染色体。“附加体”指不是细胞的染色体核型的一部分的复制型核酸、核蛋白复合物或其它包含核酸的结构。附加体的例子包括质粒和某些病毒基因组。“可及区”指细胞染色质中存在于核酸中的靶位点可以被识别该靶位点的外源分子结合的位点。不希望受限于任何具体的理论，认为可及区指不被包装成核小体结构的。可及区的独特结构经常可以通过其对化学和酶探针，例如核酸酶的敏感度来检测。“靶位点”或“靶序列”指定义为只要存在足以结合的条件结合分子便会与之结合的核酸的部分的核酸序列。例如，序列5”-GAATTC-3’是Eco RI限制性内切核酸酶的靶位点。

基因。出于本公开内容的目的，基因包括编码基因产物的DNA区，及调节基因产物的产生的所有DNA区，不论此类调节序列是否邻近编码和/或转录的序列。因而，基因包括但不必限于启动子序列、终止子、翻译调节序列诸如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点、增强子、沉默基因、绝缘子(insulator)、边界元件、复制起点、基质附着位点和基因座控制区。

表达。术语表达或基因表达可互换使用，且指将基因中含有的信息转化成基因产物。基因产物可以是基因的直接转录产物(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、核酶、结构RNA或任何其它类型的RNA)或通过mRNA翻译生成的蛋白质。基因产物还包括通过诸如加帽(capping)、聚腺苷酸化、甲基化、和编辑等过程修饰的RNA，和通过例如甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP核糖基化、肉豆蔻酰化(myristilation)、和糖基化修饰的蛋白质。基因表达的“调控(modulation)”指基因活性的变化。基因的调控可以包括但不限于基因激活和基因阻抑。

蛋白质。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语还适用于其中的一个或多个氨基酸是相应的天然存在氨基酸的化学类似物或经修饰的衍生物的氨基酸聚合物。

序列。术语“序列”指任何长度的核苷酸序列，其可以是DNA或RNA，可以是线性、环形或分枝的，而且可以是单链或双链。术语“供体序列”指插入基因组中的核苷酸序列。供体序列可以是任何长度的，例如长度为2-25,000个核苷酸(或其间或其上的任何整数值)，优选地长度为约100-5,000个核苷酸(或其间的任何整数)，更优选地长度为约200-2,500个核苷酸。

同源序列。同源序列指与第二序列共享一定程度的序列同一性，而且其序列可以与所述第二序列的序列相同的第一序列。“同源、不相同的序列”指与第二序列共享一定程度的序列同一性，但是其序列与第二序列的序列不同的第一序列。例如，包含突变体基因的野生型序列的多核苷酸与突变体基因的序列同源而不相同。在某些实施方案中，两个序列间的同源性程度足以容许利用正常的细胞机制在其间进行同源重组。两个同源不相同序列可以是任何长度，并且其非同源性程度可以小到单一核苷酸(例如，对于通过靶向同源重组来改正基因组点突变)或大到10千碱基或更多(10 or more kilobase)(例如，对于在染色体中的预定位点处插入基因)。包含同源不相同序列的两个多核苷酸不需要是相同长度。例如，可以使用20-10,000个核苷酸或核苷酸对的外源多核苷酸(即供体多核苷酸)。

重组。重组指两个多核苷酸间的遗传信息交换的过程。出于本公开内容的目的，“同源重组(HR.)”指例如在细胞中修复双链断裂过程中发生的此类交换的特殊化形式。此过程需要核苷酸序列同源性，使用“供体”分子来进行对“靶”分子(即，经历双链断裂的分子)的模板修复，而且以不同的名称称为“非交换基因转变”或“短道基因转变”，这是因为它导致遗传信息从供体转移至靶物。不希望受限于任何具体的理论，此类转移可以涉及断裂的靶物与供体间形成的异源双链体DNA的错配改正，和/或“合成依赖性链退火”(SDSA)(其中使用供体来再合成会变为靶物的一部分的遗传信息)，和/或相关过程。此类特殊化的HR经常导致靶分子的序列改变，使得供体多核苷酸的部分或整个序列被掺入靶多核苷酸中。

切割。“切割”、“诱导双链断裂”和“切”可互换使用，指DNA分子的共价主链的断裂。切割可以通过多种方法，包括但不限于对磷酸二酯键的酶或化学水解来启动。单链切割和双链切割都是有可能的，并且双链切割可作为两个独特的单链切割事件的结果而发生。DNA切割可以导致平端或交错末端的生成。在某些实施方案中，使用融合多肽来进行靶向双链DNA切割。“切割域”包含一种或多种拥有用于DNA切割的催化活性的多肽序列。切割域可以包含在单一多肽链中，或者切割活性可以产生自两条(或更多条)多肽的联合。“切割半域”指与第二多肽(相同或不同)一起形成具有切割活性(优选地双链切割活性)的复合物的多肽序列。双链断裂和双链切割可互换使用。

染色质。染色质指包含细胞基因组的核蛋白结构。细胞染色质包含核酸(主要为DNA)和蛋白质，包括组蛋白和非组蛋白染色体蛋白质。大多数真核细胞染色质以核小体形式存在，其中核小体核心包含与包含组蛋白H2A、H2B、H3和H4各两个的八聚物结合的约150个碱基对的DNA；并且接头DNA(随生物体而具有可变长度)在核小体核心间延伸。组蛋白HZ的分子一般与接头DNA结合。出于本公开内容的目的，术语“染色质”想要涵盖所有类型的细胞核蛋白(原核的和真核的两者)。细胞染色质包括染色体和附加体染色质两者。

结合。结合指大分子间(例如蛋白质与核酸间)的序列特异性、非共价相互作用。不是结合相互作用的所有组分都需要是序列特异的(例如，与DNA主链中的磷酸酯残基接触)，只要总体上的相互作用是序列特异的即可。此类相互作用一般以10^-6M^-1或更低的解离常数(K_d)为特征。“亲和力”指结合强度：升高的结合亲和力与较低的K_d关联。

可操作连接。术语“可操作连接”和“可操作连接的”(或“可操作地连接”)就两个或更多个组件(诸如序列元件)的并置而言可互换使用，其中将组件排列为使得两个组件均正常发挥功能，而且容许至少一个组件可以介导对至少一个其它组件发挥的功能的可能性。举例而言，若转录调节序列响应一种或多种转录调节因子的存在或缺失而控制编码序列的转录水平，则转录调节序列诸如启动子与编码序列可操作连接。转录调节序列一般与编码序列可操作连接，但是不需要与其直接相邻。例如，增强子是与编码序列可操作连接的转录调节序列，即使它们不是连续的。就融合多肽而言，术语“可操作连接的”可以指每个组件在与另一组件的连接中与其没有如此连接时执行相同的功能的事实。例如，就其中ZFP DNA结合域与切割域融合的融合多肽而言，若在融合多肽中，ZFP DNA结合域部分能够结合其靶位点和/或其结合位点，同时切割域能够切割靶位点附近的DNA，则ZFP DNA结合域和切割域为可操作连接。

序列特异性核酸酶(SSN)：包括数类双功能性蛋白质，其能够识别特定且独特的核苷酸序列(天然的或定制的识别位点)，诸如但不限于大范围核酸酶、亮氨酸拉链和锌指蛋白。大范围核酸酶代表在存在二价金属离子(Ca、Mn、Mg)的情况中能以高特异性切割双链DNA的酶家族。然而，它们在其识别特性和结构上与限制性内切核酸酶不同(Belfort，M.Roberts RJ.Homingendonucleases：keeping the house in order；Nucleic Acid Research 1997，25：3379-3388)。具体地，在限制酶识别短的核酸序列(3-8bp)的情况中，大范围核酸酶识别更长的序列(12-40bp)，其对DSB靶向提供改善的特异性。(Mueller，JE，Bryk，M.Loizos，N.Belfort M.Homing endonucleases.In Nucleases第2版Linn，SM，Lloyd，RS，Roberts，RJ(编)Cold Spring Harbor Laboratory Press：1993111-143.)。亮氨酸拉链是在作为与基因表达有关的重要转录因子的许多真核调节蛋白中的蛋白质-蛋白质相互作用中涉及的一类蛋白质。亮氨酸拉链指横跨数个界(包括动物、植物、酵母等)的这些转录因子中共享的共同的结构基序。亮氨酸拉链是由两个多肽(同二聚体或异二聚体)形成的，所述多肽以如下方式结合特定的DNA序列，其中亮氨酸残基在α-螺旋中均匀地隔开，使得两个多肽的亮氨酸残基在螺旋的同一面上结束。

锌指DNA结合蛋白。锌指DNA结合蛋白ZFP(或结合域)是经由一个或多个锌指以序列特异性方式结合DNA的蛋白质或较大蛋白质内的域，所述锌指是结合域内经由锌离子配位来使其结构稳定化的氨基酸序列的区域。术语锌指DNA结合蛋白经常缩写为锌指蛋白或ZFP。锌指结合域可以“工程化改造”为结合预定的核苷酸序列。用于工程化改造锌指蛋白的方法的非限制性例子是设计和选择。设计的锌指蛋白是自然界中不存在的蛋白质，其设计/组成主要源自理性标准。用于设计的理性标准包括应用取代规则和计算机化算法，以供处理储存现有ZFP设计和结合数据信息的数据库中的信息。参见例如美国专利6,140,081；6,453,242；6,534,261；及6,785,613；还可参见WO 98153058；WO 98153059；WO 98153060；WO 021016536和WO 031016496；及美国专利6,746,838；6,866,997；和7,030,215。

基因组序列。基因组序列包括那些存在于染色体、附加体、细胞器基因组(例如线粒体、叶绿体)、人工染色体和存在于细胞中的任何其它类型的核酸，诸如例如扩增的序列双微小染色体和内源或感染细菌和病毒的基因组。基因组序列可以是正常的(即野生型)或突变体；突变体序列可以包含例如插入、缺失、易位、25重排、和/或点突变。基因组序列还可以包含许多不同等位基因之一。

植物细胞。植物细胞包括但不限于单子叶(单子叶植物)或双子叶(双子叶植物)植物或藻类或苔藓的细胞。单子叶植物的非限制性例子包括谷类植物，诸如玉米、稻、大麦、燕麦、小麦、高粱、黑麦、sugarmaye、菠萝、洋葱、香蕉、和椰子。双子叶植物的非限制性例子包括烟草、番茄、向日葵、棉花、甜菜、马铃薯、莴苣、甜瓜、大豆、mayola(油菜籽)、和苜蓿。植物细胞可以来自植物的任何部分和/或来自植物发育的任何阶段。

感兴趣的区域。感兴趣的区域是期望结合外源分子的核酸聚合物的任何区域，诸如例如基因或基因内或与基因邻近的非编码序列。结合可以是为了靶向DNA切割和/或靶向重组。感兴趣的区域可以存在于例如染色体、附加体、细胞器基因组(例如线粒体、叶绿体)、质粒、感染性病毒基因组、或任何其它核苷酸序列中。感兴趣的区域可以在基因的编码区内，在转录的非编码区诸如例如前导序列、尾随序列或内含子内，或者在编码区上游或下游的非转录区内。感兴趣的区域的长度可以小到单一核苷酸对或达25,000个核苷酸对，或任何整数数值的核苷酸对。

依照本发明的实施方案，提供了将序列特异性核酸酶导入包含细胞壁的植物细胞中的方法，该方法包括将经序列特异性核酸酶包被的纳米颗粒与所述植物细胞接触地放置，并容许穿过植物细胞壁的摄取。在本发明的特定的方面，纳米颗粒可以是任何纳米颗粒，并且可以可逆地或不可逆地含有、包被有、或以其它方式结合有和/或携带锌指核酸酶、和/或大范围核酸酶。在某些实施方案中，可以在与具有细胞壁的植物细胞接触前或与将纳米颗粒导入具有细胞壁的植物细胞同时将锌指核酸酶导入纳米颗粒。可以在本发明的实施方案中使用的纳米颗粒的例子包括但不限于金、量子点、经金包被的纳米颗粒、多孔纳米颗粒、介孔纳米颗粒、硅纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、钨纳米颗粒、明胶纳米颗粒、纳米壳、纳米核心、纳米球、纳米棒、磁性纳米颗粒、半导体纳米颗粒、量子点、纳米基质、树枝状聚合物和/或其组合。

依照本发明的实施方案，具有细胞壁的植物细胞可以是包含完整的且全部的细胞壁的任何植物细胞。本发明的实施方案可以包括来自任何组织或找到它们的任何地方(包括但不限于在胚、分生组织细胞、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、花、种子、荚、茎、悬浮培养物、和组织培养物中)的包含细胞壁的细胞。

在本发明的具体实施方案中，SSN可以是可以依照本发明投递到植物细胞的任何ZFN。例如，ZFN可以包括包含切割域(或切割半域)和锌指结合域的融合蛋白、编码这些蛋白质的多核苷酸以及多肽和编码多肽的多核苷酸的组合。锌指结合域可以包含一个或多个锌指(例如2、3、4、5、6、7、8、9或更多个锌指)，而且可以工程化改造成结合感兴趣的任何区域。如此，通过鉴定期望切割或重组的感兴趣的靶区域，可以依照本文中所公开的方法来构建一种或多种融合蛋白，其包含切割域(或切割半域)和工程化改造成识别所述感兴趣的区域中的靶序列的锌指域。细胞中存在这种融合蛋白(或多种蛋白)会导致融合蛋白对其结合位点的结合和所述感兴趣的区域内或附近的切割。此外，若与感兴趣的区域同源的外源多核苷酸也存在于这种细胞中，则在双链断裂核苷酸序列与外源多核苷酸间以高比率发生同源重组。

在具体的实施方案中，对细胞提供至少一种SSN可以包括通过纳米颗粒对细胞直接提供一个或多个拷贝的SSN蛋白。在其它实施方案中，对细胞提供至少一种SSN可以包括给细胞提供包含编码该SSN的核酸的纳米颗粒，并允许细胞从编码该SSN的核酸生成该SSN。

在其它实施方案中，对细胞提供的一种或多种SSN能够在一个或多个感兴趣的区域处或附近单独地或与其它SSN一齐进行切割。在具体的实施方案中，一个或多个感兴趣的区域可以在高度、更高度、非常高度、或最高度表达的蛋白质的编码序列内。在一些实施方案中，一个或多个感兴趣的区域可以在包含编码高度、更高度、非常高度、或最高度表达的蛋白质的核苷酸序列的基因座附近和/或之内。在其它实施方案中，核苷酸序列可以是在单一感兴趣的区域处的双链断裂。在其它实施方案中，核苷酸序列可以是在两个或更多个感兴趣的区域处的双链断裂。在具体的实施方案中，一个或多个双链断裂可以位于高度、更高度、非常高度、或最高度表达的蛋白质的编码序列中。在其它实施方案中，一个或多个双链断裂可以在包含编码高度、更高度、非常高度、或最高度表达的蛋白质的核苷酸序列的基因座附近和/或之内。

在生成至少两个双链断裂的具体的实施方案中，修复双链断裂可以包括除去双链断裂之间的物质，并再连接核苷酸序列的末端，从而切除双链断裂之间的序列。在多个实施方案中，切除的序列可以包括(不限于)编码整个或部分编码高度、更高度、非常高度、或最高度表达的蛋白质的核苷酸序列的序列。在其它实施方案中，切除的序列可以包括(不限于)实现高度、更高度、非常高度、或最高度表达的蛋白质的表达的调节序列。在此类实施方案中，高度、更高度、非常高度、或最高度表达的蛋白质的表达相对于切割前的表达水平是降低的。

在生成至少两个双链断裂的备选实施方案中，修复双链断裂可以包括除去双链断裂之间的物质，将其用供体序列替换，从而用供体序列替换双链断裂之间的序列。在其它实施方案中，除去的序列可以包括(不限于)编码整个或部分编码高度、更高度、非常高度、或最高度表达的蛋白质的核苷酸序列的序列。在其它实施方案中，除去的序列包括(不限于)实现高度、更高度、非常高度、或最高度表达的蛋白质的表达的调节序列。在此类实施方案中，高度、更高度、非常高度、或最高度表达的蛋白质的表达相对于切割前的表达水平是降低的。

在生成一个双链断裂的实施方案中，修复双链断裂可以包括将供体序列插入该双链断裂中或与其交叉地插入(insert a donor sequence into or acrossthe double strand break)。在某些实施方案中，可以将供体序列插入高度、更高度、非常高度、或最高度表达的蛋白质的编码序列中。在多个实施方案中，此类序列的插入可以经由(作为非限制性例子)存在符合读码框的终止密码子而破坏高度、更高度、非常高度、或最高度表达的蛋白质的编码序列的转录。在其它实施方案中，供体可以(不限于)破坏实现高度、更高度、非常高度、或最高度表达的蛋白质表达的调节序列的功能。在多个实施方案中，高度、更高度、非常高度、或最高度表达的蛋白质的表达相对于切割前的表达水平是降低的。

在又一些实施方案中，供体序列可以编码感兴趣的蛋白质。在其它实施方案中，从供体序列表达感兴趣的蛋白质可以受存在于供体序列中的调节序列和/或存在于供体序列插入其中的序列中的调节序列控制、调节、或与存在于供体序列中的调节序列和/或存在于供体序列插入其中的序列中的调节序列可操作连接。在其它实施方案中，可以与供体序列分开或与供体序列一起向细胞提供编码感兴趣的蛋白质的核酸序列。在一些实施方案中，供体序列可以包含在与编码感兴趣的蛋白质的序列相同的核酸分子内。

在其它实施方案中，作为非限制性例子，编码高度、更高度、非常高度、或最高度表达的蛋白质的核苷酸序列可以位于基因组、质粒、粘粒、人工染色体、附加体、或细胞中的其它核苷酸结构中。

除非另有指明，方法的实施及本文中所公开的组合物的制备和使用采用分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、计算机化学、细胞培养、重组DNA和相关领域中常规的技术，如本领域技术范围内的。这些技术在文献中有全面解释。参见例如Sambrook等MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989和第三版，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY，John Wiley & Sons，New York，1987和定期更新；丛书METHODSIN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，第三版，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，第304卷，“Chromatin”(P.M.Wassarman和A.P.Wolfe编)，Academic Press，San Diego，1999；及METHODS INMOLECULAR BIOLOGY，第119卷，“Chromatin Protocols”(P.B.Becker编)Humana Press，Totowa，1999。

对植物细胞的核酸投递

如上文所述的，可以通过多种常规的技术来将DNA构建体导入期望的植物宿主(例如导入其基因组中)。关于此类技术的综述，参见例如Weissbach &Weissbach Methods for Plant Molecular Biology(1988，Academic Press，N.Y.)部分VIII，第421页-第463页；及Grierson & Corey，Plant Molecular Biology(1988，2d Ed.)，Blackie，London，第7章-第9章。

例如，可以使用诸如对植物细胞原生质体的电穿孔和显微注射等技术来将DNA构建体直接导入植物细胞的基因组DNA中，或者可以使用生物射弹法，诸如DNA颗粒轰击(参见例如Klein等(1987)Nature 327：70-73)来将DNA构建体直接导入植物组织中。或者，可以将DNA构建体与合适的T-DNA侧翼区组合，并导入常规的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)宿主载体中。根癌土壤杆菌介导的转染技术(包括二元载体的解除(disarming)和使用)在科学文献中充分描述。参见例如Horsch等(1984)Science 233：496-498，及Fraley等(1983)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 80：4803。

另外，可以使用非土壤杆菌细菌或病毒诸如根瘤菌属菌种(Rhizobium sp.)NGR234、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizoboium melioti)、百脉根中生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、马铃薯病毒X、花椰菜花叶病毒和木薯叶脉花叶病毒和/或烟草花叶病毒来实现基因转移，参见例如Chung等(2006)Trends Plant Sci.11(1)：1-4。

此外，可以使用与纳米颗粒或序列特异性核酸酶融合的细胞穿透肽来将核苷酸或蛋白质序列投递到植物细胞中。可以将细胞穿透肽表达、分离、并用纳米颗粒、核苷酸序列、或蛋白质功能化以在植物细胞内投递。能够将分子功能性投递到植物细胞中的细胞穿透肽是本领域中已知的，并且可以包括但不限于：TAT(Chugh等，(2008)FEBS 275：2403-2414)；R9(Chang等(2005)Plant Cell Physiol 46(3)：482-488和Chen等(2007)FEBS Lett 581(9)：1891-1897)；MPG(Ziegler等(2008)Adv Drug Deliver Rev 6：580-597和Morris等(1997)Nucleic Acids Res.25：2730-2736)；PEP1(Henriques等(2005)Biochemistry US 44(3)：10189-10198)；和植物来源的细胞穿透肽。

在使用二元T DNA载体(Bevan(1984)Nuc.Acid Res.12：87118721)或共培养规程(Horsch等(1985)Science 227：1229-1231)通过细菌感染细胞时，根癌土壤杆菌宿主的毒力功能会指导构建体和相邻的标志物插入植物细胞DNA中。一般地，使用土壤杆菌转染系统来工程化改造双子叶植物(Bevan等(1982)Ann.Rev.Genet 16：357-384；Rogers等(1986)Methods Enzymol.118：627-641)。也可以使用土壤杆菌转染系统来将DNA转化及转移到单子叶植物和植物细胞。参见美国专利No.5,591,616；Hemalsteen等(1984)EMBO J3：30393041；Hooykass Van Slogteren等(1984)Nature 311：763-764；Grimsley等(1987)Nature 325：1677-179；Boulton等(1989)Plant Mol.Biol.12：3140.；及Gould等(1991)Plant Physiol.95：426-434。

备选的基因转移和转染方法包括但不限于经由钙、聚乙二醇(PEG)或电穿孔介导的对裸DNA的摄取的原生质体转染(参见Paszkowski等(1984)EMBO J 3：2717-2722，Potrykus等(1985)Molec.Gen.Genet.199：169-177；From等(1985)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 82：5824-5828；及Shimamoto(1989)Nature 338：274-276)和植物组织的电穿孔(D’Halluin等(1992)Plant Cell 4：1495-1505)。用于植物细胞转染的其它方法包括显微注射、碳化硅介导的DNA摄取(Kaeppler等(1990)植物细胞Reporter 9：415-418)、和微粒轰击(参见Klein等(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85：4305-4309；及Gordon Kim等(1990)Plant Cell 2：603-618)。

可以使用公开的方法和组合物来将外源序列插入植物细胞基因组中的预定位置中。由于导入植物基因组中的转基因的表达严重依赖于其整合位点，所以这是有用的。因而，可以通过靶向重组将编码例如营养物、抗生素或治疗性分子的基因插入植物基因组中对其表达有利的区域中。

可以培养通过任何上述转染技术生成的经转染的植物细胞以再生拥有该转染的基因型及因此拥有期望的表型的整株植物。此类再生技术依赖于在组织培养生长培养基中操作某些植物激素，通常依赖于已经与期望的核苷酸序列一起导入的杀生物剂和/或除草剂标志物。从培养的原生质体的植物再生记载于Evans等，“Protoplasts Isolation and Culture”于Handbook of Plant CellCulture，第124页-第176页，Macmillian Publishing Company，New York，1983；及Binding，Regeneration of Plants，Plant Protoplasts，第21页-第73页，CRCPress，Boca Raton，1985。再生也可以从植物愈伤组织、外植体、器官、花粉、胚或它们的一部分获得。此类再生技术概括地记载于Klee等(1987)Ann.Rev.of Plant Phys.38：467-486。

可以使用导入植物细胞中的核酸来对基本上任何植物赋予期望的性状。可以使用本公开内容的核酸构建体和上文所提及的多种转染方法来在本文中所描述的期望的生理学和农艺学特征方面工程化改造极其多种植物和植物细胞系统。在优选的实施方案中，供工程化改造用的靶植物和植物细胞包括但不限于那些单子叶和双子叶植物，诸如作物，包括谷类作物(例如小麦、玉米、稻、黍、大麦)、果实作物(例如番茄、苹果、梨、草莓、柑橘(orange))、草料作物(例如苜蓿)、根菜作物(例如胡萝卜、马铃薯、甜菜、薯蓣)、叶菜作物(例如莴苣、菠菜、甘蓝)；有花植物(例如矮牵牛、蔷薇/玫瑰(rose)、菊)、针叶树(conifer)和松树(例如松木冷杉(pine fir)、云杉)；植生治理(phytoremediation)中使用的植物(例如重金属积累植物)；油料作物(例如向日葵、油菜籽、大豆、棕榈)和出于实验目的使用的植物(例如拟南芥)。如此，所公开的方法和组合物在一大批植物的范围内有用，包括但不限于来自下述属的种：天门冬属(Asparagus)、燕麦属(Avena)、芸苔属(Brassica)、柑橘属(Citrus)、西瓜属(Citrullus)、辣椒属(Capsicum)、南瓜属(Cucurbita)、胡萝卜属(Daucus)、大豆属(Glycine)、棉属(Gossypium)、大麦属(Hordeum)、莴苣属(Lactuca)、番茄属(Lycopersicon)、苹果属(Malus)、木薯属(Manihot)、烟草属(Nicotiana)、稻属(Oryza)、鳄梨属(Persea)、豌豆属(Pisum)、梨属(Pyrus)、李属(Prunus)、萝卜属(Raphanus)、黑麦属(Secale)、茄属(Solanurn)、高粱属(Sorghum)、小麦属(Triticum)、葡萄属(Vitis)、豇豆属(Vigna)、和玉蜀黍属(Zea)。

本领域技术人员会认可，在将表达盒在转基因植物中稳定掺入并确认为可操作的后，可以通过有性杂交来将其导入其它植物中。根据要杂交的物种，可以使用多种标准育种技术之任一种。

可以通过在由存在于转染DNA上的标志物基因编码的性状方面选择或筛选经工程化改造的植物材料来鉴定并分离经转染的植物细胞、愈伤组织、组织或植物。例如，可以通过将经工程化改造的植物材料在含有抑制量的抗生素或除草剂(转染基因构建体赋予针对其的抗性)的培养基上培养来进行选择。此外，也可以通过筛选可存在于重组核酸构建体上的任何可见标志物基因(例如β-葡糖醛酸糖苷酶、萤光素酶、B或Cl基因)的活性来鉴定经转染的植物和植物细胞。此类选择和筛选方法是本领域技术人员公知的。

也可以使用物理和生物化学方法来鉴定含有插入的基因构建体的植物或植物细胞转染子。这些方法包括但不限于：1)Southern分析或PCR扩增，其用于检测并测定重组DNA插入物的结构；2)Northern印迹、引物延伸或逆转录酶PCR扩增，其用于检测并检查基因构建体的RNA转录物；3)酶测定法，其用于检测酶或核酶活性，其中此类基因产物是由基因构建体编码的；4)蛋白质凝胶电泳、Western印迹技术、免疫沉淀、或酶联免疫测定法，其中基因构建体产物是蛋白质；5)单核苷酸多态性检测技术、侵入者测定法、焦磷酸测序(pyrosequencing)、Solexa测序。也可使用其它技术诸如原位杂交、酶染色、和免疫染色来检测在特定植物器官和组织中的重组构建体的存在或表达。进行所有这些测定法的方法是本领域技术人员公知的。

可以通过例如自感兴趣的组织分离的RNA(例如mRNA)的Northern印迹来观察使用本文中所公开的方法进行基因操作的效果。通常，若mRNA的量已经升高，则可以假设相应的内源基因正在以比之前更高的速率表达。可以使用测量基因活性的其它方法。根据所使用的底物和检测反应产物或副产物的升高或降低的方法，可以使用不同类型的酶测定法。另外，所表达的蛋白质的水平可以用免疫化学法，即ELISA、RIA、EIA和本领域技术人员公知的其它基于抗体的测定法，诸如通过电泳检测测定法(通过染色或Western印迹)来测量。转基因可以在植物的一些组织中或在一些发育阶段选择性表达，或者转基因可以在基本上所有植物组织中，基本上在其整个生活周期期间表达。然而，任何组合表达模式也是可适用的。

本公开内容还涵盖上文所描述的转基因植物的种子，其中所述种子具有转基因或基因构建体。本公开内容进一步涵盖上文所描述的转基因植物的后代、克隆、细胞系或细胞，其中所述后代、克隆、细胞系或细胞具有转基因或基因构建体。

应用

可以使用所公开的用于靶向切割的方法和组合物来诱导基因组序列中的突变。也可以使用靶向切割来创建基因敲除或基因敲低(例如功能基因组学或靶物确认)，并且便于将序列靶向插入基因组中(即序列敲入)。插入可以是依靠染色体序列的替换，其经由(作为非限制性例子)同源重组来或通过靶向整合，其中在预定靶位点处插入新序列(即不存在于感兴趣的区域中的序列)。在某些例子中，此类新序列侧翼可以有与染色体中的感兴趣区域同源的序列。也可以使用相同的方法来用突变体序列替换野生型序列或者将一种等位基因转变成不同等位基因。

可以使用对感染性或整合性植物病原体的靶向切割来治疗植物宿主中的病原性感染，例如其通过切割病原体的基因组，使得其病原性得到降低或消除来实现。另外，可以使用对编码植物病毒受体的基因的靶向切割来阻断此类受体的表达，由此预防植物中的病毒感染和/或病毒扩散。

例示性的植物病原体包括但不限于植物病毒，诸如Alfarnoviruses、α潜隐病毒属(Alphacryptoviruses)、杆状DNA病毒属(Badnaviruses)、β潜隐病毒属(Betaciyptoviruses)、Bigeminiviruses、雀麦花叶病毒属(Bromoviruses)、大麦黄化花叶病毒属(Bymoviruses)、毛状病毒属(Capilloviruses)、香石竹潜伏病毒属(Carlaviruses)、香石竹斑驳病毒属(Carrnoviruses)、花椰菜花叶病毒属(Caulimoviruses)、长线形病毒属(Closteroviruses)、豇豆花叶病毒属(Comoviruses)、黄瓜花叶病毒属(Cucurnoviruses)、质型弹状病毒属(Cytorhabdoviruses)、香石竹病毒属(Dianthoviruses)、碗豆耳突花叶病毒属(Enamoviruses)、蚕豆萎蔫病毒属(Fabaviruses)、斐济病毒属(Fijiviruses)、真菌传杆状病毒属(Furoviruses)、大麦病毒属(Hordeiviruses)、Hybrigeminiviruses、悬钩子病毒属(Idaeoviruses)、等径易变病毒属(Ilawiruses)、甘薯病毒属(Ipomoviruses)、大麦黄矮病毒属(Luteoviruses)、玉米褪绿斑驳病毒属(Machlomoviruses)、橙桑花叶病毒属(Macluraviruses)、玉米雷亚多非纳病毒属(Mara viruses)、单双生病毒属(Monogeminiviruses)、矮缩病毒属(Nanaviruses)、坏死病毒属(Necroviruses)、线虫传多角体病毒属(Nepoviruses)、核型弹状病毒属(Nucleorhabdoviruses)、水稻病毒属(Oryzaviruses)、甜瓜病毒属(Ourmiaviruses)、植物呼肠病毒属(Phytoreoviruses)、马铃薯X病毒属(Potexviruses)、马铃薯Y病毒属(Potyviruses)、黑麦草花叶病毒属(Rymoviruses)、卫星WAS、卫星病毒属(satelliviruses)、欧防风黄点病毒属(Sequiviruses)、南方菜豆花叶病毒属(Sobemoviruses)、水稻条纹叶枯病毒属(Tenuiviruses)、烟草花叶病毒属(Tobamoviruses)、烟草脆裂病毒属(Tobraviruses)、番茄丛矮病毒属(Tornbusviruses)、番茄斑萎病毒属(Tospoviruses)、苹果褪绿叶斑病毒属(Trichoviruses)、芜菁黄花叶病毒属(Tymoviruses)、伞形植物病毒属(Umbraviruses)、巨脉病毒属(Varicosaviruses)和水稻矮化病毒属(Waikaviruses)；真菌病原体诸如黑粉菌(例如黑粉菌目(Ustilaginales))、锈菌(锈菌目(Uredinales))、麦角菌(Clavicepts pupurea)和霉菌(mildew)；霉(mold)(卵菌纲(Oomycetes))诸如晚疫病菌(Phytophthora infestam)(马铃薯疫病(potato blight))；细菌病原体诸如欧文氏菌属(Erwinia)(例如草生欧文氏菌(E.herbicola))、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、丁香假单胞菌(P.syringae)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)和恶臭假单胞菌(P.putida))、雷尔氏菌(Palstonia)(例如青枯雷尔氏菌(R.solanacearum))、土壤杆菌属和黄单胞菌属(Xanthomonas)；蛔虫(线虫纲(Nematoda))；和Phytomyxea(多粘霉属(Polymyxa)和根肿菌属(Plasmodiophora))。

可以使用所公开的用于靶向重组生成感兴趣的蛋白质的方法来用不相同的序列替换任何基因组序列。例如，突变体基因组序列可以用其野生型对应物替换，由此提供用于治疗植物疾病的方法；提供对植物病原体的抗性；提高作物产率等。以相似的方式，使用本文中所公开的靶向重组方法来将基因的一个等位基因用不同等位基因替换。

在许多这些情况中，感兴趣的区域包含突变，并且供体多核苷酸包含相应的野生型序列。相似地，野生型基因组序列可以用突变体序列替换，若这是期望的话。例如，癌基因的过表达可以通过使基因突变或者通过用支持较低的、非病理学表达水平的序列替换其控制序列来逆转。实际上，可以使用本文中所公开的方法和组合物来改正或减轻以任何方式依赖于特定基因组序列的任何病理学。

也可以使用靶向切割、插入、切除、和/或重组来改变非编码序列(例如调节序列诸如启动子、增强子、起始密码子、终止子、剪接位点)以改变基因产物的表达水平。可以为了例如治疗目的、功能基因组学和/或靶物确认研究而使用此类方法。

可以使用染色质结构的靶向修饰来促进融合蛋白与细胞染色质的结合。在其它实施方案中，在本文中所公开的锌指切割域融合物外或取而代之，可以使用一种或多种在锌指结合域与重组酶(或其功能性片段)间的融合物，以便于靶向重组。参见例如共同拥有的美国专利No.6,534,261和Akopian等(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：86888691。在其它实施方案中，使用所公开的方法和组合物来提供ZFP结合域与转录激活或阻抑域的融合物，所述转录激活或阻抑域在其活性方面需要二聚化(同二聚化或异二聚化)。在这些情况中，融合多肽包含锌指结合域和功能域单体(例如来自二聚体转录激活或阻抑域的单体)。两个此类融合多肽对适当定位的靶位点的结合容许二聚化，从而重建功能性转录激活或阻抑域。

此外，如上文所公开的，可以使用本文中所列的方法和组合物来将外源序列靶向整合到细胞基因组中感兴趣的区域中，例如其中切割经由同源性依赖性机制来增强插入(例如，与一个或多个与预定基因组序列(即靶位点)相同，或同源但不相同的序列一起插入包含外源序列的供体序列)。

供体序列在外源序列侧翼的区域中可以含有足够的同源性以支持基因组序列中的双链断裂的同源性指导的修复，由此在基因组靶位点处插入外源序列。因此，供体核酸可以是足以支持通过同源性依赖性修复机制(例如同源重组)来实现外源序列整合的任何大小。不希望受限于任何具体的理论，认为在外源序列侧翼的同源性区域为断裂的染色体末端提供了用于在双链断裂位点处再合成遗传信息的模板。在某些实施方案中，在外源序列侧翼存在两个相同的序列或两个同源但不相同的序列(或各一个)。外源序列(或外源核酸或外源多核苷酸)是含有通常不存在于感兴趣的区域中的核苷酸序列的序列。

例示性的外源序列包括但不限于cDNA、启动子序列、增强子序列、表位标签、标志物基因、切割酶识别位点和各种类型的表达构建体。参见例如美国专利No.6,833,252。其它例示性的归巢内切核酸酶包括I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、ICreI、I-TevI、I-TevII和I-TaiIII。它们的识别序列是已知的。还可参见美国专利No.5,420,032；Belfort等(1997)Nucleic Acids Res.25：3379-3388；Dujon等(1989)Gene 82：115-118；Perler等(1994)Nucleic Acids Res.22，1125-1127；Jasin(1996)Trends Genet.12：224-228；Gimble等(1996)J.Mol.Biol.263：163-180；Argast等(1998)J.Mol.Biol.280：345353及New England Biolabs产品目录。

标志物基因包括但不限于编码介导抗生素抗性(例如氨苄青霉素抗性、新霉素抗性、G418抗性、嘌呤霉素抗性)的蛋白质的序列、编码有色或荧光或发光蛋白质(例如绿色荧光蛋白、增强型绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、萤光素酶)的序列、和介导增强的细胞生长和/或基因扩增的蛋白质(例如二氢叶酸还原酶)的序列。如此，例示性的标志物基因包括但不限于β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、膦丝菌素N-乙酰基转移酶(PAT，BAR)、新霉素磷酸转移酶、p-内酰胺酶、儿茶酚双加氧酶、a-淀粉酶、酪氨酸酶、P-半乳糖苷酶、萤光素酶、水母发光蛋白、EPSP合酶、腈水解酶、乙酰乳酸合酶(ALS)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、茅草枯脱卤素酶和邻氨基苯甲酸合酶。在某些实施方案中，使用靶向整合来插入RNA表达构建体，例如负责微小RNA或siRNA的调节性表达的序列。也可以在RNA表达构建体中掺入启动子、增强子和其它转录调节序列，如上文所描述的。

常规的转化使用外来DNA的随机整合以生成具有选择的性状的经修饰的转基因作物植物，其在一些国外市场受到严格限制。另外，不想要的结果也源自DNA导入方法或源自转基因对基因组的敏感区域的随机插入，经常为每个基因组中多次插入。特别地，不精确插入的效果在早期世代中本身可能不显现，因为不同DNA差错检查机制在生长、繁殖、胚发生、和发育期间被激活。这些结果影响农业生物技术中的任何转基因程序的时间和金钱成本。然而，在最近的Dow AgroSciences发明(WO/2008/021207)中，描述了一种用于精确插入转基因的方法，其经由锌指核酸酶(ZFN)介导的同源重组进行。相反，在可以将ZFN蛋白在靶生物体外部表达并纯化，然后投递到靶植物细胞中的情况中，可以经由非同源末端连接(NHEJ)来诱导手术特异性突变/基因敲除。如此，本发明可以生成非转基因的经遗传修饰的植物，其会绕过对转基因作物的限制，并且可以进行靶向基因编辑的过程而无需转基因方法。

用于异源表达序列特异性核酸酶蛋白诸如ZFN蛋白的方法是本领域内已知的。可适用的表达系统包括但不限于：使用体外系统诸如小麦胚无细胞系统(参见美国专利NO.7,235,382，通过提及而将其收入本文)；荧光假单胞菌表达系统(Madduri等(2007)Protein Expres Purif，55(2)：352360)；和毕赤酵母属(Pichia)蛋白质表达系统(参见美国专利NO.4,683,293；4,808,537；4,812,405；4,818,700；4,837,148；4,855,231；4,857,467；4,879,231；4,882,279；4,885,242；4,895,800；4,929,555；5,002,876；5,004,688；5,032,516；5,122,465；5,135,868；5,166,329，通过提及而将其收入本文)。

本发明的具体的实施方案包括将外源表达的功能性ZFN与纳米颗粒(NP)缀合，并经由NP介导的巧妙且隐蔽的投递方法投递到完整的植物细胞中以诱导双链断裂，并通过NHEJ来恢复受到破坏的基因的功能性。在其它实施方案中，经由NP介导的巧妙且隐蔽的投递方法将与NP缀合的功能性ZFN与DNA的供体片段一起投递。其中ZFN切割基因组内的特定序列，并且经由同源重组将供体DNA整合到此基因座中。连接蛋白质与NP的策略采用了四种主要办法(1)静电吸附、(2)与NP表面上的配体的缀合、(3)与蛋白质能识别并结合的小的辅因子分子的缀合、和(4)与NP表面的直接缀合(Aubin Tam和Hamad Schifferli，2008)。其它策略记载于Medintz等的综述。这些标记策略中涉及的问题包括空间学(sterics)，或蛋白质是否能“通过”配体到NP表面或相关连接基团。导致特定的连接(即不引起广泛的交联)而且对于期望的目的而言稳定的化学的选择也是必要的考虑因素。ZFN肽需要在高DDT浓度下且在存在锌离子的情况中官能化。为了保持缀合物的稳定性，官能化会依照记载于Oh等，2010的缀合规程来进行。

本发明借助于以下例示性实施例来进一步描述。

实施例

实施例1：经由体外翻译或细菌表达来生成序列特异性核酸酶(SSN)。

将SSN (IL1-LO/Fok1、IL1-43/Fok1、IL1-8/Fok1和I-SceI)工程化改造，并自含有所述SSN、附接的限制酶位点和6x组氨酸标签的质粒进行PCR扩增。将PCR产物插入TOPO载体pCR2.1中以供克隆和测序。经由限制性消化从所述质粒取出含有所述SSN编码序列的基因片段，并连接到表达载体pETl5b的相容性限制性位点中。将这些样品与pDAB4883一起转化到BL21表达感受态大肠杆菌细胞中。对于有效的表达，通过用由pCOT4表达质粒组成的质粒pDAB4883转化BL21来在BL21大肠杆菌DNA中降低SSN蛋白损伤，所述pCOT4表达质粒含有在也受IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)诱导的启动子下游的连接酶基因。这帮助修复SSN在过表达期间对BL21细胞基因组进行的任何损伤。

将连接酶基因-pCOT4构建体和SSN-pETl5b构建体共转化到相同的BL21表达细胞中。将转基因BL21的培养物在50mL具有氯霉素、羧苄青霉素、和ZnCl₂的LB培养基中培养，并于37℃温育，直至OD_600nm达到0.5。用不同浓度的IPTG(0.1-0.7mM)诱导表达，并于不同温度(16-28℃)温育，并经由SDS-PAGE和Western印迹来分析以检测SSN蛋白的存在。如此，将IL1-LO/Fok1、IL1-43/Fok1、IL1-8/Fok1和I-SceI在大肠杆菌细胞中表达，并用Ni-NTA纯化。纯化后，基于自表达质粒释放特定片段的能力来证明SSN功能。

或者，经由体外翻译来表达序列特异性核酸酶。来自Promega的商业试剂盒

提供了一种用于表达蛋白质的有效且方便的方法。通过由试剂盒供应的蛋白质表达酶体外表达含有从T7或SP6 RNA聚合酶启动子下游克隆的序列特异性核酸酶基因的环形质粒。遵循制造商的方案在50μL反应中在60-90分钟内生成合成的蛋白质。其它商业试剂盒可用于蛋白质的体外翻译，可以使用的其它试剂盒包括：来自Ambion的ActivePro^TM、来自Ambion的PROTEINscript^TM II、来自New England Biolabs的PURExpress^TM，还有其它商品化的试剂盒。

图1和图2显示了加有组氨酸标签的(1)和未加组氨酸标签的(2)SSN，即ZFN-IL1Fok1的大肠杆菌表达。体外表达的ZFN-IL1Fok1从质粒释放意义明确的侧翼为ZFN结合位点的片段(ZFN-binding site-flanked fragment)。如此，大肠杆菌和体外表达的SSN都可用于对靶DNA分子的有效且特异性的消化，并且它们在这项研究的整个过程中交替使用。

显示了自克隆的SSN基因表达的蛋白质是功能性的(即在切割供体DNA方面)。例如，用ZFN-IL1Fok1处理质粒pDAB1585(显示于图4)。经消化的质粒DNA是线性化的。然后，将来自经ZFN-IL1Fok1消化的质粒的线性化片段自凝胶纯化，并使用过夜体外连接规程来自我连接。将连接产物转移到化学感受态DH5α大肠杆菌细胞中。将数个重组菌落回收，并通过限制样式分析和DNA测序两者来分析，表明pDAB1585按预期消化。

实施例2：生成具有侧翼有GFP报告基因片段的SSN结合位点的靶细胞培养物。

靶序列由在β-葡糖醛酸糖苷酶(uidA)表达盒侧翼的两个绿色荧光蛋白(gfp)基因片段(Evrogen Joint Stock Company，Moscow，Russia)组成。在一个靶构建体中，将具有识别序列的ZFN结合位点整合到所述靶构建体中，所述识别序列由锌指-FokI融合蛋白可以以同二聚体结合的反向重复序列组成(图3)。所述结合位点含有IL1-FokI融合蛋白的识别序列的四个串联重复，使得每个结合位点大小为约200bp以确保该识别序列易接近复杂染色质环境中的所述锌指-Fok1融合蛋白。在第二个构建体中，将I-SceI结合位点整合到靶构建体中(图6)。在每个靶构建体中，将结合位点与uidA编码序列在N端融合。5’和3’gfp基因片段重叠540bp。这些重叠的序列提供在靶序列内同源性，并且在5’gfp片段的3’端插入终止密码子以确保没有从靶序列的功能性gfp转录。

使用土壤杆菌转化来将靶序列稳定整合到BY2烟草细胞悬浮液中。将BY2培养物(获自Jun Ueki of Japan Tobacco，Iwata，Shizuoka，Japan)在pH 6.0的培养基中维持，所述培养基含有LS基础盐(PhytoTechnology Labs，ShawneeMission，KS，#L689)、170mg/L KH₂PO₄、30g/L蔗糖、0.2mg/L 2，4-D和0.6mg/L盐酸硫胺。通过将0.25mL PCV添加至50mL基于LS的培养基来将BY2细胞每7天进行传代培养，所述基于LS的培养基在250mL烧瓶中在旋转振荡器上于25℃和125RPM维持。为了生成具有整合的靶序列的转基因BY2细胞培养物，将传代培养之后4天的悬浮液的烧瓶分成10-12份4mL等分试样，将其在100x25mm培养皿中与100μL含有pZFN-TARGET pDAB1585(图4)或pI-SceI-TARGET pDAB100375(图7)的土壤杆菌菌株LBA4404共培养，所述土壤杆菌菌株LBA4404过夜培养至OD600为约1.5。将皿用

(AzwellInc.，Osaka，Japan)包裹，并于25℃在不摇动的情况中温育3天，之后将过量的液体取出，并用11mL含有500mg/L羧苄青霉素的LS培养基更换。在将烟草细胞再悬浮后，将1mL悬浮液分配到LS培养基的100x25mm平板上，所述LS培养基含有用8g/L TC琼脂(Phyto Technology，Shawnee Mission，KS)固化的500mg/L羧苄青霉素和200mg/L潮霉素。平板于28℃在黑暗中在打开的状态下温育。这导致针对单一处理的120-144块选择平板。单独的潮霉素抗性分离株(isolate)在铺板后10-14天出现，并将它们转移到单独的60x20mm平板(每块平板一个分离株)，在这些平板上将它们按14天传代培养日程表在选择下作为愈伤组织维持，直至需要用于分析和后续的再转化实验。

选择含有单一全长整合拷贝的靶序列的潮霉素抗性、转基因细胞培养物，并将其用于再启动悬浮培养，其通过将约250-500mg愈伤组织放入40-50mL含有100mg/L潮霉素的LS基础培养基中，并每7天进行传代培养来进行，如上文所描述的。

在所述实验中使用细胞簇和单细胞(如DAS单细胞专利申请WO/2008/083233中所描述的那样生成)两者。实验前3-4天，通过将2mL BY2悬浮聚集物转移到250mL烧瓶中的40mL LSBY2培养基中来将一周时间的悬浮培养物传代培养到新鲜培养基，所述LSBY2培养基含有原液浓度的4-氯-1，5-联苯-1H-吡唑-3-基氧)乙酸乙酯(如记载于专利WO/2008/083233的)、1-3％甘油、和0.05-0.1％(v/v)DMSO。在诱导单细胞的处理后3.5天或7天时收集单细胞。将BY2单细胞经由流式细胞仪加工以测定细胞存活力，而且还经由共焦显微术来评估细胞稳定性。通过观察背景荧光水平(若有的话)来检测稳定性。较小百分比的细胞显示与死亡细胞匹配的背景荧光，表明背景荧光来自经历坏死的细胞。在测试背景荧光后在所述实验中使用单细胞和常规的悬浮聚集物两者。

实施例3：用SSN包被纳米颗粒(NP)以供投递到植物细胞中。

直径大小150nm的金胶体(BBI International，GC150)、5-((2-(和-3)-S(乙酰基巯基)琥珀酰)氨基)荧光素(SAMSA荧光素：Invitrogen，A-685)、大小80和90nm羧酸多官能化的金胶体的纳米颗粒(TedPella，32019)、Sulfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)、EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]盐酸碳二亚胺)(PierceBitoechnology，24510，22980)、MES(2-[N-吗啉代]乙磺酸)(Fisher Scientific，AC32776-1000)、磷酸盐缓冲盐水缓冲包(Sigma，P536810PAK)、加有组氨酸标签的GFP(Evrogen，激发最大值-482nm，发射最大值-502nm，FP611)、turboYFP(Evrogen，激发最大值-525nm，发射最大值538nm，FP611)、碘化丙啶(Sigma-P4864)、二乙酸荧光素(Sigma，F7378)是用SSN包被并用于投递到靶细胞培养物中的多官能化NP的类型。

(i)纳米颗粒缀合物的制备

(a)为对照处理合成没有SSN的金-荧光素缀合物：通过先前所描述的方法(Cannone等2006)来制备金-荧光素缀合物以在没有SSN的情况中在BY2簇或单细胞中投递并追踪颗粒。将一(1)mg SAMSA荧光素在100μl 0.1M NaOH中溶解，并涡旋振荡15分钟以除去保护硫醇的乙酰基基团。然后，将活化的SAMSA与100μl 150nm金胶体(约109个颗粒/mL)混合。然后，将此溶液温育1小时以确保反应的完成。然后，添加50μL 1M HC1以中和溶液。以3000RPM将溶液离心30分钟，并除去上清液。将获得的黄色沉淀物在200μL 0.1M PBS中重悬，产生橙色的溶液。将此纯化步骤重复两次以确保除去游离的SAMSA荧光素。SAMSA与金的附着模式主要经由硫醇键合。由于显著的静电排斥(SAMSA在pH＞7时为双阴离子的)，认为SAMSA与金胶体表面垂直(Cannone等2006)。使用此类NP来追踪进入细胞中的此类发荧光的颗粒的数目的进入作为给定条件中的细胞适应性的指标的测量。

(b)合成用SSN包被的金纳米颗粒(GNP)：使用略有修改的由Grabarek和Gergely，1990所描述的方案来合成GNP-SSN缀合物。以3000RPM将0.25mL20-150nm羧酸多官能化的金胶体溶液(约109个颗粒/mL)离心10分钟。在弃去上清液后，将红色的沉淀物在1mL活化缓冲液(0.1M MES、0.5M NaCl，pH 6.0)中悬浮。此后，将0.4mg EDC和1.1mg硫代-NHS添加至此溶液，并于室温涡旋振荡15分钟。然后，添加9μL ZFN-IL1Fok1，并于室温在黑暗中将所得的溶液温育多达2小时以使蛋白质和金完全起反应。通过寻找存在于金胶体上的羧酸数目来确定此反应中使用的金胶体与蛋白质的比率。首先，通过用一个金颗粒的表面积(球体假设)除以被一个羧酸基团占据的表面(0.20nm²(Kimura等2002))来计算存在于一个金胶体上的羧酸基团的数目。然后，此结果乘以存在的金胶体的总数以获得存在于整个金胶体溶液中的羧酸基团的总数。这等于存在于给定量的蛋白质中的氨基基团的数目。金胶体经由在存在于金胶体上的羧酸与存在于蛋白质上的氨基基团间形成酰胺键而附着于蛋白质(Grabarek和Gergely，1990)。大约有127,285个蛋白质分子与一个金纳米颗粒拴系在一起。

(ii)细胞处理：

a)金摄取和细胞存活力的时间过程：将下列样品在24孔无菌板中制备：(i)500μL靶物悬浮簇或单细胞(对照)；(ii)500μL BY2悬浮簇或单细胞+20μLGNP+25μL二乙酸荧光素(FDA)+25μL碘化乙啶；和(iii)其它处理包括单独的及与ZFN-IL1Fok1组合的40、60、80μL GNP及细胞和细胞存活力菌株。在5、20、120分钟时及最终在24-48小时后在荧光显微镜下检查经处理的样品以确认细胞的存活力。

b)金-SAMSA荧光素处理：在实验前将下列样品在24孔无菌板中制备：(i)500μL靶物悬浮簇或单细胞(对照)；(ii)500μL靶物悬浮簇或单细胞+20μLSAMSA-荧光素(对照)；和(iii)靶物悬浮簇或单细胞+20μL GNP-SAMSA-荧光素，其经处理并将悬浮液在黑暗中于室温温育20分钟以确认颗粒的进入。

c)经GNP包被的(例如加标签的)ZFN-IL1Fok1处理：在细胞或悬浮簇处理前将下列样品在24孔无菌板中制备：(i)500μL靶物悬浮簇或单细胞(对照)；(ii)500μL靶物悬浮簇或单细胞+9-20μL ZFN(对照)；和iii)500μL单细胞+10-40μL经GNP包被的(例如加标签的)ZFN-IL1Fok1。在实验前将经处理的细胞和簇在黑暗中于室温温育多达2小时。

在所有实验中包括使用拴系有GFP/YFP的GNP的对照处理以确保非侵入性穿过和最佳进入的时机，其在实验中作为指导使用(参见图5)。另外，将融合细胞穿透肽(CPP)与NP融合(例如多官能化)以追踪颗粒向靶物悬浮簇和单细胞中的实时进入。

实施例4：合成加有量子点(QD)标签的SSN缀合物。

发光半导体纳米晶体QD为许多已证明的生物学应用提供了一种有力的原型例子(Thermes V等2002；Windbichler等，2007；Fajardo Sanchez等，2008；Arnould S等，2006)。它们的效用源自独特的光物理特征和与大蛋白质相当的大小的组合。亲水性CdSe-ZnS QD的流体动力学半径从约5nm(对于与分子配体进行帽交换的纳米晶体)变化至约20nm(对于封装在嵌段共聚物内的纳米晶体)(Smith J等，2006)。将单一QD与数种生物分子(诸如抗体、肽、DNA)缀合以提供具有增强的亲合力的经包被的QD生物缀合物。

在本实施例中描述了使用与亲水性QD缀合(例如包被)的ZFN-IL1Fok1作为便于其胞内摄取和投递到合适的靶DNA位点的备选策略。该方法一般遵循用于将QD-蛋白质负载内在化到活细胞中的规程，如记载于DAS专利申请65502中的。

(i)QD合成：遵循所描述的规程(Lu等，2007；Doyon等2006；Collins等，2003；Lanio等，2000)使用热配位溶剂混合物中的有机金属前体的逐步反应来合成具有集中于510和540nm的发射最大值的CdSe-ZnS核心-壳QD。将纳米晶体多官能化，并通过用双功能配体替换天然的加帽壳(其主要由三辛基膦和氧化三辛基膦(TOP/TOPO)组成)来使其亲水，如先前所描述的(Lie等，2002；Mani等，2005；Desjarlais和Berg，1993)。使用两组亲水性QD：(1)仅用二氢硫辛酸加帽的纳米晶体；和(2)用附加有聚(乙二醇)的二氢硫辛酸(PEG Mw约等于600，DHLA-PEG)和以生物素为末端的DHLA-聚(乙二醇)(PEG Mw约等于400，DHLA-PEG-生物素)的混合物以9∶1摩尔比率的配体加帽的纳米晶体。这些分别称为DHLA-QD和DHLA-PEG-生物素-QD。

(ii)量子点生物缀合物的自我装配：为了以期望的价态自我装配QD-ZFN-IL1Fok1缀合物，将合适摩尔比率的His-ZFN添加至10mM Tris-ClpH 8缓冲液中的0.3μM 510nm发射性的经DHLA加帽的QD，并于室温温育30分钟。类似地，将b-PE-链霉亲合素添加至磷酸盐缓冲盐水(137mM NaCl、10mM磷酸盐、2.7mM KCl，pH 7.4，PBS)中的0.3μM 540nm发射性QD(以DHLA-PEG：DHLA-PEG生物素9∶1比率加帽)，并于4℃温育过夜；通过链霉亲合素-生物素相互作用来驱动此情况中的缀合物形成。使用凝胶电泳来表征缀合物，其中监测与附加有His的ZFN或经链霉亲合素标记的b-PE装配的QD的电泳迁移率的变化。将样品在1xTBE缓冲液(0.09M Tris、0.002MNa2-EDTA、0.09M硼酸，pH 8.3)中稀释，并且对于QD-b-PE和YFP缀合物分别在1％或2％琼脂糖凝胶上运行。特别地，监测改变每个QD生物缀合物的ZFN-IL1Fok1分子数目的效果，若它们与供追踪用的荧光蛋白融合的话。通过激发QD和/或蛋白质，并捕捉凝胶内分开的条带的荧光图像来收集凝胶图像。通过监测自我装配后QD与荧光蛋白间的能量转移的变化来确认缀合物形成。使用325nm激发在Tecan Safire双单色仪多功能微量滴定板读出器(Tecan，Research Triangle Park，NC)上收集荧光谱。对于胞内投递和成像实验，以额定的(nominal)ZFN∶QD摩尔比率将QD与ZFN-IL1Fok1的混合物进行自我装配。

(iii)量子点-荧光蛋白质缀合物的胞内摄取：在无菌条件中实施细胞内在化实验，如先前所描述的。将QD生物缀合物稀释到完全培养基中，添加至细胞培养物，并于37℃以40-150μg/mL温育1小时。以不同QD缀合物浓度将经混合表面QD包被的缀合物与细胞培养物一起温育，所述缀合物由1∶5或1∶10的具有1∶1至1∶2.5装配价态的QD/ZFN和QD/b-PE，连同每QD 50个CPP的CPP组成。通过用PBS或细胞培养基将培养物清洗至少三次来除去过量的未结合的QD缀合物。然后，将细胞于室温在3.7％低聚甲醛中固定10分钟，用PBS清洗两次，并在含有DAPI染料(Invitrogen)的ProLong Antifade封固介质中封固以进行细胞核染色。使用Leica显微镜来实施落射荧光图像收集。使用装备有565nm二向性滤光器的DualView系统来收集并定量并排分开荧光图像(Side-by-side split fluorescence)。对于510nm QD-YFP/ZFN细胞成像，以488nm激发样品，并用565nm二向性滤光器(dichroic)来收集/分开发射，并将其解卷积(deconvolute)。以λ＜565nm收集QD荧光，并以λ＞565nm收集YFP荧光尾。将向QD窗的YFP泄漏作为解卷积的一部分扣除。以488nm激发540nm QD和b-PE，并用565nm二向性滤光器来分开其各自的发射，并将其解卷积。使用Xe灯来激发DAPI荧光，并使用DAPI滤色块(DAPI cube)(用于激发的D350/50x，二向性400DCLP，用于检测的D460/50m)来收集发射。使用Xe灯来激发AF647-TF，并使用Cy5滤色块(激发HQ620/60x，二向性Q660LP，发射HQ700/75m)来检测荧光。激发/检测滤色块都是由Chroma Technology提供的。使用明亮的光源来收集微分干涉相差(DIC)图像。

(iv)经ZFN-IL1Fok1包被的QD的确认：与纳米晶体的富含Zn的无机表面直接发生His相互作用。以携带由小的间隔物分开的两个(His)6序列的N端和具有N端(His)8序列的CPP工程化改造ZFN-IL1Fok1容许形成紧密的QD-蛋白质/肽复合物。生物素-亲合素结合是在其强烈的相互作用(KD约10^-15M)方面在本领域中已知的普遍存在的生物缀合策略。使用用以羟基和生物素为末端的PEG的混合物加帽的QD表面(DHLA-PEG-生物素-QD)容许与商品化的b-PE链霉亲合素的容易的缀合(例如包被)。

(v)QD-ZFN-IL1Fok1缀合物的胞内投递：为了证实用YFP/ZFN-IL1Fok1负载包被的经多官能化的(例如表面官能化的)QD的摄取是通过纳米晶体表面上的CPP存在而介导的，将靶BY2细胞系与三种类型的缀合物分别一起温育：QD-CPP缀合物(每个QD为10-100个CPP)、QD-ZFN-IL1Fok1/CPP、和装配有ZFN-IL1Fok1和CPP的混合物的QD(每个缀合物具有约10个ZFN-IL1Fok1和约50个CPP的QD-ZFN-IL1Fok1-CPP)。将细胞与510nm发射性QD缀合物(为约75nM浓度)的溶液一起温育，漂洗以除去任何未结合的材料，随后使用落射荧光显微术来成像。还用DAPI来对细胞复染色以允许分别显现细胞核和内体。当额外的CPP存在于QD表面上(混合表面QD-ZFN-IL1Fok1-CPP缀合物)时，发生缀合物的实质性胞内摄取，如通过对这两组细胞测量的明显的荧光强度所指示的。此外，对这两种培养物收集的图像显示了，在QD和ZFN-IL1Fok1/YFP的荧光样式间有几乎完全的重叠。染色样式和共定位样式的评估指示核周分布，而且主要限于内体区室内。在存在CPP的情况中细胞系对QD缀合物的有效内在化表明CPP促成用ZFN-IL1Fok1荧光融合蛋白负载多官能化(例如表面官能化)的QD的胞内摄取。

与纳米颗粒部分中所描述的NP处理类似地处理单细胞和聚集体簇，并将它们在没有选择的情况中铺板，并在实验后2-4周监测GFP表达集落。

实施例5：在经由GNP和QD将SSN投递到烟草细胞中后的同源性指导的修复

将如上文所描述的那样用与颗粒拴系在一起的ZFN-IL1Fok1或I-SceI处理的靶细胞系在培养皿中的培养基上铺板，所述靶细胞系具有整合的ZFN或I-SceI结合位点。处理后，将细胞铺板到非选择培养基上。绿色荧光焦点在7天后可见。为了确认观察到的荧光源自功能性gfp基因的重建，分离发荧光的组织区段的集合，并经由选择性传代培养的数次传代来手工富集。将基因组DNA自这些发荧光的组织分离，并通过PCR用锚定于任意gfp基因片段上的探针来测定。从经SSN处理的发荧光的组织富集的样品在扩增时产生预测的0.6kb PCR产物，这指示预期的重组已经在这些组织中重建功能性gfp基因。还在富集的样品中观察到另外的4.1kb PCR产物，这指示在细胞群体中存在非重组的报告序列。鉴于用于实现gfp阳性细胞富集的发荧光的组织的视觉选择方法，这不是不可预期的。

虽然上文已经讨论了许多例示性的方面和实施方案，但是本领域技术人员应当认可某些修饰、置换、添加和其亚组合。因此，意图所附的权利要求书和引入的权利要求解释为包括所有此类修饰、置换、添加和亚组合，如在其真正的精神和范围内的。

Claims (16)

1.一种将序列特异性核酸酶(SSN)导入植物细胞中的方法，该方法包括：

提供具有细胞壁的植物细胞；

用SSN包被纳米颗粒；

将所述具有细胞壁的细胞与所述经包被的纳米颗粒彼此接触地放置；并允许所述纳米颗粒和所述SSN被摄取入所述包含细胞壁的植物细胞中。

2.依照权利要求1的方法，其中用SSN包被纳米颗粒包括经由所述纳米颗粒的表面上的非共价吸收来固定化所述SSN。

3.依照权利要求1的方法，其进一步包括将所述SSN吸收到所述纳米颗粒中。

4.依照权利要求1的方法，其进一步包括允许所述纳米颗粒被摄取入所述包含细胞壁的植物细胞的区室中。

5.依照权利要求4的方法，其进一步包括用细胞穿透肽和或亚细胞区室靶向蛋白包被所述纳米颗粒。

6.依照权利要求4的方法，其中所述区室选自下组：细胞溶胶、细胞核、液泡形成体、质体、黄化质体、色质体、白色体、油质体、蛋白质体、造粉体、叶绿体、和双层膜的腔。

7.依照权利要求1的方法，其中所述包含细胞壁的植物细胞选自下组：烟草、胡萝卜、玉米、芸苔、油菜籽、棉花、棕榈、花生、大豆、稻属物种(Oryza sp.)、拟南芥属物种(Arabidopsis sp.)、蓖麻属物种(Ricinus sp.)、和甘蔗细胞。

8.依照权利要求1的方法，其中所述植物细胞来自选自下组的组织：胚、分生组织、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、花、种子、荚和茎。

9.依照权利要求1的方法，其中所述纳米颗粒选自下组：金纳米颗粒、金包被的纳米颗粒、多孔纳米颗粒、介孔纳米颗粒、硅纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、钨纳米颗粒、明胶纳米颗粒、纳米壳、纳米核心、纳米球、纳米棒、磁性纳米颗粒、半导体纳米颗粒、量子点、纳米基质、树枝状聚合物纳米基质及其组合。

10.依照权利要求1的方法，其进一步包括衍生化所述纳米颗粒的表面。

11.依照权利要求1的方法，其中所述SSN是由具有非序列依赖性核酸酶域的锌指蛋白组成的锌指核酸酶。

12.依照权利要求11的方法，其中所述非序列依赖性核酸酶域源自IIS型限制性内切核酸酶FokI。

13.依照权利要求11的方法，其进一步包括选择具有稳定整合的所述ZFN的细胞。

14.依照权利要求13的方法，其中选定的细胞是可再生细胞。

15.依照权利要求14的方法，其进一步包括自所述可再生细胞再生植物。

16.依照权利要求1的方法，其中所述纳米颗粒是多官能化的纳米颗粒。

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